2. 海南医学院药学院, 海南 海口 571101
2. School of Pharmacy, Hainan Medical University, Haikou 571101, China
高脂血症 (hyperlipidemia) 是指脂肪代谢异常或脂肪转运异常而导致血清甘油三酯(TG)、总胆固醇 (TC)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 及总脂质等浓度超过正常标准,是诱发心脑血管疾病的高危因素之一[1, 2]。肝脏是脂质代谢的主要器官,多种基因和蛋白参与脂质代谢的调节。固醇调节元件结合蛋白 (sterol-regulatory element binding proteins,SREBPs) 及其下游基因脂肪酸合酶 (fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶 (ACC)、羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR) 可促进体内胆固醇、脂肪酸及甘油三酯的合成和积聚,被称作成脂基因 (lipogenic genes)[3, 4]。相反,过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisone proliferators-activated receptor alpha,PPARα) 及其下游基因乙酰辅酶A氧化酶 (ACOX) 和肉毒碱棕榈酰转移酶I (CPT-1) 等可以通过促进脂肪酸β氧化而降低脂质水平[5, 6]。
随着现代人们生活水平的不断提高和生活方式的改变,由于不良饮食结构及不健康的生活习惯致使高脂血症患者与日俱增,并且正朝着年轻化的趋势发展,给人类健康造成巨大威胁[1,7]。虽然目前临床上常用的降血脂药物,如他汀类和贝特类降脂药物,可以对高血脂进行良好的控制,但是它们同时也会产生一些不良反应,例如胃肠道不适、失眠、恶心、转氨酶升高、肌痛等,长期服用这些药物会增加高脂血症患者的负担,因此顺应性较差[8, 9]。为了开发疗效高、副作用少的新型降血脂药物,近年来,人们已逐渐将注意力转移到临床上已经被证明有效的传统民族药物上来。
露兜簕为露兜树科 (Pandanaceae) 露兜树属 (Pandanus) 植物露兜树 (Pandanus tectorius Soland.) 的果实[6, 10]。在中国海南省部分地区,当地黎族人民常使用它治疗高脂血症,现已成为黎族当地医院制剂,且临床疗效显著。本课题组通过高脂饲料诱导的高脂血症金黄地鼠模型和db/db自发肥胖型糖尿病 小鼠模型确证了露兜簕提取物的降血脂活性,发现该降血脂有效部位富含咖啡酰奎宁酸类成分,并可以通过上调PPARα通路的表达和活性发挥降血脂作用[6, 11]。为进一步阐明露兜簕发挥降血脂作用的物质基础及作用机制,本文利用油酸诱导的肝HepG2细胞脂质积聚模型对从露兜簕提取物中分离得到的7种咖啡酰奎宁酸类化合物的降脂活性进行了筛选和研究,并通过实时定量PCR方法分析各活性成分对肝细胞脂代谢相关基因的表达调节作用,从而初步揭示露兜簕降血脂作用的主要活性成分及潜在作用途径。
IX51倒置荧光显微镜 (OLYMPUS公司); KC junior微孔板分光光度计 (BIOTEK公司); 7500实时定量PCR仪 (ABI公司)。
7种露兜簕来源咖啡酰奎宁酸 (纯度>98%) 由中国医学科学院药用植物研究所许旭东研究员提供,如表 1所示; 洛伐他汀 (lovastatin,纯度>98%)、胰蛋白酶、四甲基氮唑蓝 (MTT)、油红O染料、油酸 (OA)、trizol试剂、青霉素、链霉素 (Sigma公司); DMEM高糖培养基 (Gibco公司); 超级小牛血清 (四季青生物研究所); 细胞胆固醇/胆固醇酯定量试剂盒、细胞甘油三酯定量试剂盒 (BioVision公司); BCA蛋白定量试剂盒、cDNA反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒 (北京全式金生物技术有限公司); 引物由Invitrogen公司设计合成; 兔抗人SREBP-1c和ACC多克隆抗体购自Abcam公司,其余试剂为分析纯,购自于国药集团化学试剂有限公司。
人肝癌HepG2细胞购自北京协和医学院基础医学研究所细胞中心。细胞在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下用含10% FBS的高糖DMEM培养基培养,同时在培养基中按100∶1的比例添加双抗 (100 u·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素),每两天更换一次新鲜培养液。
取生长状态良好的对数生长期HepG2细胞,以适宜浓度接种于96孔板中,每孔加入细胞悬液100 μL,培养24 h至细胞完全贴壁。待细胞生长汇合至70%~80%时,用含100 μmol·L-1油酸 (OA) 和10 μmol·L-1各种试剂的不完全培养基孵育细胞,每组设8个复孔,在37 ℃、5% CO2下继续培养24 h。弃掉培养基,用PBS洗一遍,4%多聚甲醛在4 ℃固定过夜。PBS清洗一遍,每孔加入油红O染液室温染色15 min,PBS漂洗干净,弃掉PBS后,每孔加入DMSO 100 μL,置于摇床上摇匀,用微孔板分光光度计在358 nm读取吸光度。
取生长状态良好的对数生长期的HepG2细胞,胰酶消化后接种于96孔板 (细胞数 4 000/孔)。用完全培养基配制不同浓度的待测天然产物,使药物浓度分别为100、50、10和1 μmol·L-1,空白对照组给予含溶剂的完全培养基; 每组设置8个平行复孔,在37 ℃、5% CO2下培养24 h。然后,每孔加入5 g·L-1 MTT溶液20 μL,在37 ℃、5% CO2下 继续培养4 h。弃掉板中培养液,每孔加入DMSO 150 μL,室温摇床振荡混匀,充分溶解紫色结晶。微孔板分光光度计570 nm处读取吸光度,观察给药组细胞的相对活力。
取状态良好的对数生长期HepG2细胞,胰酶消化后接种到6孔板中,经100 μmol·L-1 OA诱导和10 μmol·L-1各种天然产物的不完全培养基孵育细胞。500 μL油红O染色,PBS漂洗干净,在光学倒置显微镜下观察并拍照。
收集并裂解经OA诱导和药物处理的细胞,使用细胞总胆固醇和甘油三酯定量试剂盒按照制造商提供的使用说明进行细胞内TC和TG定量,并使用BCA蛋白定量试剂盒按照制造商提供的使用说明测定样品中的蛋白含量。进而计算细胞内的TC和TG含量。
收取经上述药物处理24 h 的细胞,用含有蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、氟化钠和钒酸钠的加样缓冲液冰上静置裂解细胞10 min,再95 ℃变性10 min,12 000 r·min-1离心5 min,上清液即为全细胞裂解液。SDS-PAGE凝胶电泳后冰浴 湿式转印至PVDF膜,参数为恒压80 V × 3 h。用含0.5 g·L-1油酸脱脂奶粉和0.5 mL Tween-20的PBST封闭30 min后,按抗体厂家建议稀释一抗后4 ℃敷膜结合过夜,以GAPDH抗体为内参。一抗结合后PBS-T洗膜10 min × 3次,加入二抗稀释液 (1∶1 000),室温孵育2 h,再次PBS-T洗膜10 min × 3次,用ECL化学发光显色液显色,于暗室中曝光。蛋白条带用ImageJ 1.44e软件进行灰度定量,以比较蛋白水平。
实验数据用SPSS 17.0统计分析软件处理,数据以x± s表示,采用单因素方差分析,多组之间两两相关比较进行t检验,P < 0.05为有统计学意义。
通过油酸诱导的HepG2肝癌细胞脂质积聚模型对从露兜簕分离得到的7种咖啡酰奎宁酸成分,即3-咖啡酰奎宁酸 (绿原酸,3-CQA)、4-咖啡酰奎宁酸 (隐绿原酸,4-CQA)、5-咖啡酰奎宁酸 (新绿原酸,5-CQA)、1,3-二咖啡酰奎尼酸 (莱蓟素,1,3 -CQA)、3,4-二咖啡酰奎尼酸 (异绿原酸B,3,4-CQA)、3,5-二咖啡酰奎尼酸 (异绿原酸A,3,5-CQA) 和3,4,5-三
咖啡酰奎尼酸 (3,4,5-CQA),的降脂活性进行筛选。油红O染色定量分析结果显示,3-CQA、3,5-CQA和3,4,5-CQA在10 μmol·L-1浓度下可显著抑制油酸诱导的HepG2肝癌细胞脂质积聚,而其余咖啡酰奎宁酸类化合物则效果不明显 (图 1)。
MTT实验结果表明,具有降脂活性的3-CQA、3,5-CQA和3,4,5-CQA,在10 μmol·L-1浓度下对HepG2细胞增殖没有不良影响。3-CQA在1~100 μmol·L-1内无明显的细胞毒性,3,4,5-CQA在100 μmol·L-1浓度下可抑制HepG2细胞增殖,而3,5-CQA在约50 μmol·L-1浓度下即可抑制HepG2细胞增殖 (图 2)。
油红O染色后吸光度分析和光学显微镜观察结 果显示,具有降脂活性的咖啡酰奎宁酸成分,3-CQA、3,5-CQA和3,4,5-CQA,在1~10 μmol·L-1浓度下,均剂量依赖性地抑制油酸诱导的HepG2细胞中性脂质的积聚 (图 3A和3B)。细胞内总胆固醇 (图 4A) 和甘油三酯 (图 4B) 定量分析结果表明,3-CQA、3,5- CQA和3,4,5-CQA对细胞内胆固醇和甘油三酯的积聚均有明显的抑制作用,其作用效力依次为3-CQA > 3,5-CQA > 3,4,5-CQA。
实时定量PCR结果显示,3-CQA、3,5-CQA和3,4,5-CQA对HepG2细胞中脂代谢相关基因的mRNA水平具有显著影响。3-CQA和3,5-CQA均可提高脂质氧化相关基因PPARα、CPT-1和ACOX-1的表达水平,同时显著抑制脂质合成相关基因SREBP-1c、SREBP-2、ACC、HMGR和FAS的表达水平,特别是3,5-CQA的抑制效果尤为明显。相对地,3,4,5-CQA对脂质氧化相关基因的表达无明显影响,但可显著抑制脂质合成相关基因SREBP-1c、SREBP-2、ACC、HMGR和FAS的表达水平 (图 5)。Western blot分析进一步印证了实时定量PCR的实验结果。三种咖啡酰奎宁酸,特别是3-CQA和3,5-CQA可显著抑制成脂重要因子SREBP-1c的蛋白表达水平,同时可降低成脂因子ACC的蛋白表达水平,但在统计学上并不显著 (图 6)。有趣的是,虽然3-CQA对SREBP-1c的转录水平没有显著影响,但却明显抑制其蛋白水平。3-CQA对SREBP-1c蛋白表达水平的影响与Murase等的实验结果一致[12]。
本课题组前期利用高脂饲料诱导的高脂血症金黄地鼠和db/db自发肥胖型糖尿病小鼠证明了露兜簕正丁醇提取物 (PTF) 具有优良的降血脂作用,并且咖啡酰奎宁酸类化合物是其主要成分[6, 11]。本文进一步利用HepG2肝癌细胞模型对露兜簕的降脂活性进行了筛选,并对其潜在的作用机制进行了研究。
比较各种咖啡酰奎宁酸化合物的结构和药效可以发现,显示降脂活性的咖啡酰奎宁酸类化合物均含有3位咖啡酰基; 同时含有3位和5位咖啡酰基的3,5-CQA显示最强的降脂活性; 而同时含有4位咖啡酰基的3,4-CQA和3,4,5-CQA则比4位不含咖啡酰基的对应化合物的降脂活性更弱。因此推测,3位取代的咖啡酰基是影响咖啡酰奎宁酸类化合物降脂活性的关键位点,5位的咖啡酰基对降脂活性有一定的协同作用,而1位和4位的咖啡酰基则对降脂活性有拮抗作用。
实验数据表明,3-CQA是其中降脂效力最高且细胞毒性最小的活性化合物。关于绿原酸具有优良降脂活性的研究也已有较多报道[13, 14, 15, 16, 17, 18]。因此,本研究结果提示,绿原酸可能是露兜簕发挥降血脂作用的重要活性成分。
脂质代谢受到多种基因和蛋白的调节。SREBP- 1c及其下游基因ACC、FAS主要促进脂肪酸的合成,而SREBP2及其下游基因HMGR则主要参与胆固醇的合成[19]。另一方面,PPARα及其下游基因CPT-1、ACOX1则可以通过提高脂质氧化发挥降脂作用[20]。实时定量PCR结果显示,3-CQA、3,5-CQA和3,4,5-CQA均可显著抑制脂质合成因子SREBP-1c、SREBP-2及其下游基因ACC、FAS、HMGR的表达水平,提示它们可以通过抑制脂肪酸和胆固醇的合成发挥降脂作用。同时,3-CQA和3,5-CQA还显著提高脂质氧化相关基因PPARα、CPT-1和ACOX1的表达水平,表明3-CQA和3,5-CQA还可以通过促进脂肪酸β氧化实 现降低细胞内脂质积聚的作用。Western blot分析进一步证实了实时定量PCR的结果,这些结果初步揭示了露兜簕来源咖啡酰奎宁酸成分发挥降脂作用的可能途径,但还需要更进一步的实验数据加以证实,这将在后续工作中完成。
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