药学学报  2015, Vol. 50 Issue (2): 227-232   PDF    
三七病程相关蛋白PR10-1基因克隆及功能初步分析
唐美琼1, 闵丹丹2, 李刚1 , 蒋妮1, 叶云峰1    
1. 广西药用植物园, 广西药用资源保护与遗传改良重点实验室, 广西 南宁 530023;
2. 广西中医药大学, 广西 南宁 530000
摘要:采用同源克隆法和RACE技术相结合, 对三七根部蛋白质组差异进行研究, 鉴定PR10-1蛋白相应的基因全长cDNA, 初步分析该基因在三七中的功能。测序结果显示该基因序列全长863 bp, 包含1个序列长465 bp编码155个氨基酸的开放阅读框, 命名为PnPR10-1, GenBank登录号KJ741402。 氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现, PnPR10-1与人参的PR10-1蛋白同源性最高, 含有Bet-v-I家族等多个保守结构域。实时荧光定量PCR分析显示, PnPR10-1在1~3年生三七各组织中均有本底表达, 暗示其参与生长发育、代谢调控等生物学过程; PnPR10-1在根部受根腐病原菌(Fusarium oxysporum)胁迫上调表达, 推测PnPR10-1基因可能参与抗三七根腐病等广谱抗病防御反应。
关键词三七     病程相关蛋白     基因克隆     表达模式     防御反应    
Cloning and functional characterization of pathogenesis-related PR10-1 gene in Panax notoginseng
TANG Mei-qiong1, MIN Dan-dan2, LI Gang1 , JIANG Ni1, YE Yun-feng1    
1. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants, Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement, Nanning 530023, China;
2. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, China
Abstract: With homology cloning approaches coupling with RACE (rapid-amplification of cDNA ends) techniques, the full-length coding sequence of pathogenesis-related protein PR10-1 with differential expression was cloned from the total RNA of the root of Panax notoginseng, and its function was explored furtherly. As a result, the longest 465 bp ORF (named as PnPR10-1 with the Accession No. KJ741402 in GenBank) was detected from the cloned sequence with full-length of cDNA of 863 bp. The corresponding peptide encoded consisted of 155 amino acids, contained some domains such as Bet-v-I, and showed high similarity with that from Panax ginseng by analysis of phylogenetic trees created from the alignments. Real-time quantitative PCR showed that the expression of PnPR10-1 gene was constitutive in different tissues of 1-3 year old plant, suggesting that it might be involved in growth, development, and secondary metabolism; yet it was up-regulated significantly with the infection of Fusarium oxysporum in root, suggesting that it might be involved in defense against many diseases including root rot in P. notoginseng.
Key words: Panax notoginseng     pathogenesis-related protein     gene cloning     expression profile     defense    

三七(Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen) 为主产云、桂地区的重要名贵中药材,市场需求量大,且仅依赖于栽培生产。但是,其规模化种植却受到以根腐病为主的病害的严重限制,三七根腐病常年发病率为5%~20%,严重的达70% 以上,甚至绝收,是一种四季均能发生的毁灭性病害,且生长年限越长病害越严重[1, 2, 3, 4]。三七根腐病病原菌比较复杂,主要包括细菌中的假单胞杆菌(pseudomonas sp.)、真菌中的柱孢菌 (Cylindrocarpon destructans,C. didynum)、镰刀菌 (Fusarium solani,Fusarium solani f. sp. Radicicola,F. oxysporum Schlecht.,F. scirpi lamb.)、细链格孢 (Alternaria tenuis Nees,A. panax Whetzel)、槭菌刺孢 (Mycocentrospora acerina (Harfig) Deighton.),以及线虫中的小杆线虫 (Rhabditis elegans Maupas.) 等,通常以上述柱孢菌、镰刀菌或假单胞菌中某一类为主,数种病原菌复合侵染,加速根系腐烂[2, 4, 5]。研究三七抗病的遗传机制,指导和培育三七抗病品种,对保证三七种植业及相关产业的可持续发展具有重要理论和应用意义。

由于三七2~3年才能开花结籽,繁殖系数低,种子寿命短,育种周期长、难度大,迄今为止,生产中所使用的仍然是天然混杂群体,尚无严格农学意义上的三七品种[6]。现代分子生物学的发展为加快三七抗病的遗传改良提供了新的手段。但一方面,长期狭窄区域内的家化栽培导致三七遗传多样性丧失,基因资源匮乏[7]。另一方面,三七的分子生物学研究基础薄弱,进展缓慢; 现有三七基因克隆和功能分析又主要集中于三七皂苷次生代谢途径相关的研究[8, 9],其抗病研究目前仅见李瑞博等[10]对三七病程相关PR1基因进行了克隆和表达分析。因此,发掘和利用三七优良抗病基因尤为重要。

病程相关蛋白 (PR) 是一类由植物编码、受病原等生物和非生物胁迫后诱导产生和积累的蛋白家族,能通过细胞壁加厚、抗菌活性、信号转导等方式参与植物抗病反应[11],根据其结构、亲缘关系及生物活性主要分为17个亚类[12]。其中,植物中PR10蛋白是 一类具有多种小亚类的胞内蛋白,表现抗菌、体外酶活性、参与植物次生代谢、抵御非生物胁迫等复杂的生物学功能[13, 14, 15, 16, 17]。本课题组前期三七蛋白质组差异定量研究鉴定了一个与人参PR10-1序列高度相似的病程相关蛋白 (另文待发)。但三七PR10-1在细胞内的分子功能、与三七根腐病抗性的关联性及其作用机制尚不明确。

本研究将克隆三七中PR10-1蛋白质相应基因的编码序列,分析其结构特征、时空表达规律及根腐病原胁迫后的表达特性,为明确PR10-1基因抗病的分子机制,通过基因工程手段为三七抗病品种奠定基础。

材料与方法 材料

1~3年生三七采自靖西县禄洞乡,经广西药用植物园凌征柱研究员鉴定确认。清水洗净粘附的泥土后用滤纸吸干水分,分离根、茎、叶等不同组织,并将其切成0.1㎝的块状,用锡箔纸包装后小袋分装,迅速冻存于液氮中,保存于本实验室 -80 ℃冰箱中备用。

感染根腐病的三七植株标本采于靖西县禄洞乡三七种植基地,病样编号并装入纸袋,带回实验室后置4 ℃冰箱,用于病原菌的分离、鉴定和保存。

RNA提取、检测及第一链合成

采用TRIZOL法分别提取不同生长年限三七不同器官组织的总RNA,操作流程按照TRIZOL试剂说明书进行。利 用NanoDrop分光光度计和1% 琼脂糖电泳检测所 提取RNA的纯度和完整性。以提取的RNA为模板,oligo(dT)18为反转录引物,按照TaKaRa公司的Prime ScriptTM RT Reagent试剂盒说明书合成第一链。

PnPR10-1基因克隆及分析

根据蛋白质组差异分析获得的多肽序列,利用CODEHOP软件,设计简并引物对FA07 (5'-TGTACAAGGGCTTCTTCYTNG AYATNGA-3') / RB07 (5'-GTGGCGTCCTTGATGTTN TCYTCNGG-3') 扩增cDNA中间序列。根据克隆 测序所得cDNA中间序列设计5' RACE引物PR5-1 (5'-GATCACGGCGTCGCCTATGGTGT-3' ) 和PR5-2 (5'-TGGCTTCGCCAAGAGTGACGAGC-3' ),3' RACE引物PR3-1 (5'-TGGAACCGTCAAGCTCGTCACTC-3' ) 和PR3-2 (5'-GGCGAAGCCAGCCAATTCAACAC-3' ),按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试 剂盒说明书进行PCR扩增。对目的片段进行回收,T载体连接、转化,挑选3~5阳性克隆测序、拼接。根据拼接结果,采用Primer Premier 5.0软件设计引物FPR10 (5'-ATGGGTGTCCAAAAGACCGAAG-3' ) 和RPR10 (5'-CGGATCAAGAAATTAAAACAAACTT-3' ) 扩增出完整的ORF。

通过www.ExPASy.ProtParamtool.htm、DNAman分析该基因编码氨基酸的大小及等电点,利用InterProScan、Neighbor-joining等软件分析PnPR10-1蛋白的保守域,预测其可能的信号肽区域和跨膜区域,分析进化关系。

三七根腐病原的分离、鉴定

采用常规组织分 离法进行病原菌的分离。PDA培养基上进行纯化,直至获得纯培养物。采用形态鉴定和ITS区通用引物对ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 和ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') 扩增相结合的方法鉴定三七根腐病病原菌。

用针刺接种法将病原菌接种到健康的1年生三七根,放置于具有湿润滤纸的培养皿中,28 ℃恒温 培养。待出现发病症状后,取病斑附近健康部位提取RNA,以不接种病原的健康组织RNA为对照,用于qRT-PCR检测。

实时荧光定量PCR分析

采用双标准曲线法进行相对定量分析,在ABI7500实时PCR系统上检测PnPR10-1基因在三七中的时空表达规律,以及根腐病原诱导后的表达变化。上下游引物分别为YG-7-F (5'-GGGTGTCCAAAAGACCGAAGT-3' ) 和YG-7-R (5'-GTTCCAACACCACCATCACCC-3' )。PCR反应体系如下: cDNA 模板1 μL,上、下游引物 (1 µmol·L-1) 各0.5 μL,1×Rox Reference DyeⅡ 0.5 μL,2×SYBR premix Ex Taq12.5 μL,加水补足至20 μL。反应程序为: 95 ℃变性30 s; 95 ℃/5 s,58 ℃/30 s和72 ℃/34 s,40个循环。qRT-PCR均以18S片段为内参 (18S-F: 5'- GATGCGCTCCTGTCCTTAAC-3',18S-R: 5'-CATCCT TGGCAAATGCTTTC-3' ),组织表达以1年生根中的表达量为对照; PnPR10-1的诱导表达以不接种病原的1年生健康根中的表达量为对照。实验数据采用Excel统计软件进行绘图和SPSS 16.0软件进行方差分析。

结果与分析 1 PnPR10-1基因的克隆

基于不同生长年限三七根茎蛋白质组差异定量分析鉴定的PR10-1蛋白序列,设计简并引物FA07/ RB07,扩增得到单一的中间片段。经回收、T克隆和测序,得到中间片段序列信息。在此基础上,设计特异引物,采用RACE技术,分别扩增5' 和3' 末端序列 (图 1)。通过测序拼接,获得863 bp的PnPR10-1全长cDNA,包括465 bp的最长开放阅读框 (ORF)、159 bp的5' 端非翻译区 (5' UTR) 和236 bp的3' UTR。根据该ORF序列设计引物FPR10/RPR10,经RT-PCR扩增测序后比较表明,该序列与前述5' 和3' RACE片段拼接后预测的ORF序列完全一致。该基因在GenBank注册,获登录号“KJ741402”。

Figure 1 Amplification products of PnPR10-1 5' RACE,3' RACE end and ORF. M: DL1000 DNA Marker; 1: 5' RACE product; 2: 3' RACE product; 3: ORF product
2 PnPR10-1基因的生物信息学分析

通过NCBI Blastx工具进行比对发现,该基因属于“SRPBCC superfamily”超基因家族。DNAman 分析表明,PnPR10-1基因编码155个氨基酸,其理 论分子量为16.5 kD,等电点为4.43。利用在线工具InterProScan4.0 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/) 对PnPR10-1蛋白预测保守结构域 (采用默认参数),发现其含有14个保守结构域 (图 2)。其中,1~155位有4个保守域,分别是Bet-V-I结构域 (Bet v 1 domain,IPR00916)、START类结构域 (START-like domain,TPR023393)、主要乳胶蛋白结构域 (major latex protein domain,IPR024948)、Bet-V-I型过敏原 (Bet v 1 type allergen,IPR024949); BET过敏原结构域 (PR00634),分别位于3~23位、26~36位、50~59位、66~85位、85~98位、110~126位、144~154位; 病程相关蛋白结构域 (PS00451),位于89~129位; 还有两类位于32~99位 (PTHR31213和PTHR31213: SFD) 保守结构域在IPR中没有命名。其中,47~53位有保守的氨基酸序列“GDGGVGT”,即富含甘氨酸的磷酸结合环 (P-loop)。Bet-V-I结构域的基因本体 (GO) 预测表明,该蛋白参与防御反应 (GO: 0006952) 和生物应激反应 (GO: 0009607) 的生物学过程。

Figure 2 The conserved domains of PnPR10-1 protein predicted by InterProScan4.0

利用clustalw2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/ index.html) 在线比对工具对PnPR10-1全长序列与GeneBank中已登录的10种注释为PR10-1的氨基酸序列进行多序列比对,采用MEGA 4.0生物学软件[18],以Neighbor Joining (NJ) 法构建系统进化树 (图 3),可见三七PnPR10-1与人参 (Panax ginseng,登录号: ADW93867.1) 的PR10-1聚为一类,表现较近的亲缘关系,与罂粟 (Papaver somniferum,登录号: AAX56075.1) 的亲缘关系较远。

Figure 3 Phylogenetic tree analysis of PnPR10-1. Plant origin: Panax ginseng (ADW93867.1),Medicago truncatula (CAA6993.1),Medicago sativa (CAC6993.1),Lilium regale (AHG94646.1),Salvia miltiorrhiza (AHF20213.1),Lolium perenne (AEO11775.1),Zea mays (ADA68331.1),Vitis pseudoreticulata (ABD78554.1),Vitis vinifera (CAC16166.1),Papaver somniferum (AAX56075.1)
3 三七根腐病原的分离鉴定

三七根腐病田间发病症状表现为地上部植株矮小,叶片逐渐黄化,病块根呈湿腐状态。将采集回来的病组织中分离出来的根腐病原菌,经纯化培养后回接到健康的三七根上,28 ℃保湿培养下,第3天开始显症,对照不显症 (图 4)。从显症部位进行再次分离,所得菌株与原接种菌株菌落形态一致,在PDA培养基上表现为菌丝体呈白色棉絮状,菌落底色呈浅黄色。分生孢子镰刀形,1~5个隔 (图 5)。提取病原菌的基因组DNA,采用通用引物ITS4/ITS5进行PCR扩增,获得长为581 bp的单一片段,经测序分析后发现,该序列与Genbank中尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum) 相似性达99%,结合形态特征,将其鉴定为尖孢镰刀菌。

Figure 4 Disease symptom of P. notoginseng root inoculated. The diseased parts are indicated by ↑

Figure 5 The conidium type of root-rot pathogens (×40)
4 三七PnPR10-1基因的表达特性分析

PnPR10-1基因时空表达的实时荧光定量结果如图 6示,可见,PnPR10-1基因在所检测的所有组织中均有表达,以1年生三七根为对照 (相对表达量为1),在1年生三七茎组织中表达最强 (2.968),在3年生的根组织中表达最弱 (0.47),在3年生三七根、茎和叶组织中的表达量均低于1年生和2年生三七,并在各年限中根部组织中的表达量均表现为低于茎和叶组织。

Figure 6 PnPR10-1 expression in different tissues of 1-3 year old plan of P. notoginseng. The different normal letters indicate significant difference among tissues at 0.05 level

采用分离自三七的根腐病原F. oxysporum接种1年生健康根,表现出发病症状后 (接种后3天),提取未发病处根组织RNA,并反转录成cDNA第一链为模板,进行表达分析。结果显示,受根腐病原胁迫后PnPR10-1基因的表达量显著提高,为未受胁迫处理健康材料表达量的3.8倍 (图 7),表明PnPR10-1基因的表达受根腐病原F. oxysporum诱导,推测该基因可能参与三七根腐病防御反应。

Figure 7 PnPR10-1 expression in root of P. notoginseng in response to F. oxysporum. The different normal letters indicate significant difference among tissues at 0.05 level
讨论

由结果分析可知,三七PR10-1基因相应蛋白属于能结合广泛疏水配体的SRPBCC结构域超家族蛋白,在分子进化上表现有多个保守结构域,提示其具有复杂的分子功能,可能参与许多重要生物学过程。比如,Bet v 1能结合油菜素内酯[19]、细胞分裂素[20]、类固醇[21]和脂肪酸[22]等功能的分子,提示三七PR10-1可能具有代谢调控、生长发育、抗病等重要生物学功能。据报道,玉米中ZmPR10.1主要在根中表达,受玉米细菌性枯萎病菌和黄曲霉菌的侵染诱导,与生物胁迫引起寄主的防御反应有关[23]; 人参中PgPR10-1主要在花蕾中表达,表现参与非生物胁迫防御反应[17]; 豌豆PR10.1是一种核酸酶,其转基因表达能提高植物细胞分裂素水平,参与植物生长发育和调控[24]

本研究中,PnPR10-1基因在1~3年生三七的根、茎、叶中表现为组成型表达,暗示其可能参与三七的代谢调控、生长发育等基本生物学过程; 但在不同生长年限或组织类型的材料中表达量具有差异,可能与其在不同材料中参与生物学过程的种类、强弱等不同有关,例如,相比于3年生根,三七1年生根中可能因为初生代谢较旺盛,为适应细胞分裂等生长发育及调控,其PnPR10-1表达量偏高。人工接种三七根腐病原F. oxysporum后,PnPR10-1基因在根组织中的表达水平显著增加,表现明显的病原侵染应激反应; 结合其在三七叶和茎中的高表达量,推测该蛋白可能具有参与茎、叶病原等的广谱抗病性。

但是,关于植物PR10蛋白抗菌机制的研究却 少有报道,一般认为可能与其具有的核酸酶活性相关[25]。PR10蛋白中P-LOOP是一类广泛存在于磷酸化激酶和核酸结合蛋白的保守结构域[26],该区域的磷酸化可能与核酸酶的活性有关[27, 28]。BLASTP分 析表明,Bet v 1家族蛋白在邻近配体结合口袋入口处保守P-LOOP的构象却与核酸结合蛋白中发现的典型的P-LOOP不同,包含Bet v 1的PR10蛋白无体外RNase酶活性,其生物学意义也不清楚。本研究中PnPR10-1基因相应蛋白存在P-LOOP区域,是否具有核酸酶活性,还需要进行基因体外表达等后续相关研究,以进一步明确该蛋白的功能及作用方式。

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