他克莫司 (tacrolimus,FK506) 属于钙调磷酸酶抑制剂家族,是器官移植术后防治排斥反应的一线免疫抑制剂。然而,他克莫司治疗窗窄,药动学个体差异大^[1],患者血药浓度过低时易因移植物的排斥导致移植失败,过高时易导致感染及肝肾毒性的发生,对于移植术后早期的患者尤为危险^[2]。因此,临床上常规采用治疗药物监测 (therapeutic drug monitoring,TDM) 对其浓度进行监测。但TDM具有滞后性,只有当服药后且达到稳态浓度时才能进行测定^[3],因此希望运用药物基因组学寻找新型生物标记物,在患者服药前预测其所需剂量,使血药浓度尽早达到治疗窗,提高疗效及降低不良反应发生率。

他克莫司主要经CYP3A4、CYP3A5代谢^[4],同时也是P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp) 的底物^[5],因此影响CYP3A4、CYP3A5以及多药耐药基因1 (multidrug resistance 1,MDR1,编码P-糖蛋白) 活性或表达的 因素可能会影响他克莫司的浓度。关于CYP3A4、CYP3A5和MDR1等基因多态性对他克莫司浓度影 响的研究较为广泛^{[6, 7, 8]},也有研究关注了多药耐药相关蛋白2 (multidrug resistance-associated protein 2,MRP2/ABCC2)、孕烷X受体 (pregnane X receptor,PXR)、细胞色素P450氧化还原酶 (cytochrome P450 oxidoreductase,POR)、IL-6、IL-10及IL-18等的多态性^{[9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]},然而目前仅明确CYP3A5*3基因多态性与他克莫司代谢相关,该突变可引起可变剪切,产生不稳定的蛋白质,从而使携带CYP3A5*3/*3的人不表达CYP3A5,他克莫司血药浓度较高^[16]; 其他基因多态性对他克莫司的影响尚存争议。

小泛素相关修饰蛋白4 (small ubiquitin-related modifier 4,SUMO4) 是小泛素相关修饰蛋白成员之一,位于信号转导通路中核因子B (nuclear factor-kappa B,NF-κB) 的上游,可通过竞争性抑制对NF-κB的活 化起负性调控作用,导致NF-κB不能被激活,无法发挥其转录调控作用^[17]。而NF-κB又可通过竞争性结合视黄醇类X受体 (retinoid X receptor,RXR),抑制经由PXR-RXR调控的相关基因表达,包括CYP3A4、CYP3A5和MDR1^[18]。因此,SUMO4的基因多态性 可能会通过改变NF-κB的活性或表达,对CYP3A4、CYP3A5及MDR1的表达产生影响,进而导致他克莫司的药动学个体差异。本研究旨在探讨SUMO4的基因多态性对肾移植术后早期患者他克莫司浓度的影响,旨在为临床个体化用药提供参考。

引物 (中国Sangon公司); Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set 384试剂盒 (美国SEQUENOM公司)。

Veriti梯度PCR仪(美国ABI公司); DNA质谱阵列基因分析系统 (美国Sequenom公司); IMX全自动免疫分析仪 (美国Abbot公司)。

本研究纳入2006年9月至2014年9月期间于中山大学附属第一医院器官移植中心进行肾移植手术的患者,共132例。入选患者均为首次接受肾移植手术,术后均采用他克莫司 + 霉酚酸酯 + 泼尼松三联免疫抑制疗法,且肝功能指标正常。排除发生排斥反应或急性感染、接受多器官移植以及合用可能对他克莫司代谢有影响的药物 (如酮康唑、利福平等) 的患者。本研究符合赫尔辛基宣言规定,并经中山大学附属第一医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。

患者连续服用同一剂量他克莫司至少3日后,在术后第6～9天,采集清晨服药前 (即末次给药后12 h) 的静脉血2 mL置于EDTA抗凝真空管,采用微粒子酶免疫法检测他克莫司全血谷浓度。为便于比较,对他克莫司的浓度进行剂量校正,即剂量校正浓度=全血谷浓度/剂量×体重 (C/D)。

取患者外周静脉血2 mL,参照并优化Loparev等^[19]的碘化钠-氯仿法提取基因组DNA。CYP3A5*3的基因型采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态 (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP) 法检测,SUMO4 (rs237024,rs237025) 的基因型采用Sequenom^® MassARRAY system进行检测。所有引物均由美国Sequenom公司在线软件Assay Design Suite设计得到(https://www.mysequenom.com/Tools),见Table 1">表 1。

表 1(Table 1)

Table 1 Primers for polymerase chain reaction and extension reaction. F: Forward primer; R: Reverse primer; E: Extension primer SNP Primer SUMO4 rs237024 F: 5'-ACGTTGGATGATTGGTTGCCCACCAAATCG-3' R: 5'-ACGTTGGATGAAGAGGCAGACACCACTTAG-3' E: 5'-CGGAATCTGATCTGCTTCA-3' SUMO4 rs237025 F: 5'-ACGTTGGATGGTACACATACCAGTTACTTC-3' R: 5'-ACGTTGGATGCACCACATTCTGACTACTAC-3' E: 5'-TCCCCCTTCCACATTC-3'

Table 1 Primers for polymerase chain reaction and extension reaction. F: Forward primer; R: Reverse primer; E: Extension primer

多重PCR反应体系5 μL,包括1 × PCR缓冲液、 2 mmol·L^-1氯化镁、500 mol·L^-1 dNTPs、0.1 mol·L^-1引物混合物、1 U PCR酶和全基因组DNA10 ng。用0.5 U虾碱性磷酸酶 (shrimp alkaline phosphatase,SAP) 去除游离dNTP。单碱基延伸反应体系2 μL,包括1.57 mol·L^-1延伸引物混合物,1 × iPlex终止混合物,1 × iPlex酶。

PCR反应条件: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃变性 30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共45个循环; 最后72 ℃延伸5 min。SAP反应条件: 37 ℃孵育40 min,85 ℃失活5 min。

单碱基延伸反应条件: 94 ℃预变性30 s; 94 ℃变性5 s,以下步骤5个循环: 52 ℃退火5 s和80 ℃延伸5 s,共40个循环; 最后72 ℃延伸5 min。

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。数据以x± s表示; 用χ²检验分析基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡; 用非参数检验比较不同组别之间他克莫司剂量校正浓度的差异; 采用在线软件SHEsis (http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php) 对各位点之间进行连锁不平衡分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

本研究共纳入132例中国汉族肾移植术后患者,其中男性90例 (68.2%),女型42例(31.8%); 年龄 为21～65岁,平均 (39.9 ± 10.8) 岁,体重 (60.0 ± 10.9) kg。

SUMO4 rs237024,rs237025基因型及等位基因频率见表 2,2个SNP均符合Hardy-Weinberg平衡 (P > 0. 05),研究资料具有群体代表性。

表 2(Table 2)

Table 2 Genotype and allele frequency data of SUMO4 rs237024 and rs237025 in 132 Chinese renal transplant patients Gene SNP Genotype frequency Allele frequency GG GA AA G A SUMO4 rs237024 73 (55.3%) 52 (39.4%) 7 (5.3%) 99 (75.0%) 33 (25.0%) SUMO4 rs237025 73 (55.3%) 52 (39.4%) 7 (5.3%) 99 (75.0%) 33 (25.0%)

Table 2 Genotype and allele frequency data of SUMO4 rs237024 and rs237025 in 132 Chinese renal transplant patients

经SHEsis分析,SUMO4基因rs237024与rs237025位点存在完全连锁不平衡 (D' = 1),即只存在3种单倍型组合GG-GG型、GA-GA型和AA-AA型。

将SUMO4rs237024-rs237025各基因型分为GG- GG型组和携带A突变等位基因的A-A型组 (GA-GA型 + AA-AA型)。结果 (表 3) 显示,A-A型组他克莫司剂量校正浓度显著高于GG-GG型组 (P < 0.05)。

表 3(Table 3)

Table 3 Comparison C/D (concentration/dose) of tacrolimus in renal transplant patients according to their SUMO4 rs237024- rs237025 haplotypes. *P < 0.05 vs GG-GG group Gene Haplotype n C/D/(ng·mL-1/mg·kg-1) SUMO4 GG-GG 73 104.35 ± 45.97 GA-GA+AA-AA 35 130.72 ± 69.22

Table 3 Comparison C/D (concentration/dose) of tacrolimus in renal transplant patients according to their SUMO4 rs237024- rs237025 haplotypes. *P < 0.05 vs GG-GG group

由于CYP3A5*3是目前公认的与他克莫司浓度密切相关的遗传因素,为排除CYP3A5*3基因型作为混杂因素影响分析结果,以CYP3A5*3基因型分层后再考察SUMO4 rs237024和rs237025与他克莫司浓度相关性。以CYP3A5*1/*1和CYP3A5*1/*3作为CYP3A5表达组,CYP3A5*3/*3作为非表达组。结果 (表 4) 显示,在CYP3A5表达型组患者中,A-A型组 (GA-GA型+ AA-AA型) 他克莫司剂量校正浓度显著高于GG-GG型组 (P < 0.05)。然而,在CYP3A5非表达型组患者中则未发现存在相关性。

表 4(Table 4)

Table 4 C/D of tacrolimus in SUMO4 rs237024-rs237025 haplotypes classified by CYP3A5 genotypes. *P < 0.05 vs GG-GG group in CYP3A5 expressers Gene Haplotype CYP3A5 expresser CYP3A5 nonexpresser n C/D (ng·mL-1/mg·kg-1) n C/D (ng·mL-1/mg·kg-1) SUMO4 GG-GG 33 70.16 ± 21.56 40 132.55 ± 41.42 GA-GA+AA-AA 18 88.75 ± 31.81 41 149.14 ± 73.33

Table 4 C/D of tacrolimus in SUMO4 rs237024-rs237025 haplotypes classified by CYP3A5 genotypes. *P < 0.05 vs GG-GG group in CYP3A5 expressers

SUMO4蛋白位于细胞质中,与泛素 (ubiquitin) 分子具有相似的空间构象。泛素与底物蛋白结合后,蛋白酶体将特异性地识别被泛素标记的蛋白,并迅速将其降解^[20]。在T细胞活化的信号的转导途径中,泛素与磷酸化的抑制性-κB (inhibitor of NF-κB,I-κB) 结合是I-κB降解、NF-κB活化并转位到细胞核内的必要前提^[21]。SUMO蛋白作为泛素的结构类似物,能与泛素竞争性地结合二者共同的底物蛋白,然而与泛素介导的I-κB降解不同,SUMO化并不促使蛋白质降解,反而加强蛋白质的稳定性或调节蛋白质在细胞内的定位和分布,影响转录活性^{[22, 23]}。SUMO化的I-κB蛋白不能再泛素化,蛋白酶体也就不能将其降解,因此SUMO修饰后的I-κB会抑制NF-κB的活化,即SUMO蛋白对NF-κB的活化起负性调节作用^[24]。NF-κB是一个广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子,参与机体的炎症反应、免疫反应、细胞分化与凋亡及其他应激反应^[25]。研究发现NF-κB能抑制PXR对相关的基因的调控作用: NF-κB的结构元件p65可竞争性地结合RXR,干扰PXR-RXR复合物的形成,抑制PXR-RXR复合物与基因调控序列的结合,从而抑制经由PXR-RXR调控的相关基因表达,包括他克莫司的代谢酶CYP3A4,CYP3A5和转运体MDR1^[18]。SUMO4作为NF-κB的调控因子,目前国内外尚无研究将其作为影响他克莫司浓度个体差异的因素进行考察。

SUMO4 rs237025 (196G>A,Val55Met) 功能研究表明,该突变会引起SUMO4分子构象和功能活性的异常,对NF-κB负性调节作用减弱,从而使NF-κB 蛋白转录活性提高5.5倍^[24],推测其可能通过抑制CYP3A4、CYP3A5及MDR1基因的表达而导致他克莫司浓度上升。本研究发现,SUMO4 rs237025 GA + AA型组他克莫司剂量校正浓度显著高于GG型组 (P < 0.05),与预测一致。本研究考察的另一个SNP rs237024为内含子突变,然而它与rs237025位点存在完全连锁不平衡 (D' = 1),因此推测它与他克莫司浓度相关可能是由于其与rs237025位点的完全连锁造成的。

体外研究^[26]发现,CYP3A5对他克莫司的固有 清除率高于CYP3A4,而CYP3A5*3基因型与他克莫司浓度密切相关是他克莫司遗传药理学/药物基因 组学研究最为一致的结论^{[27, 28, 29, 30]},因此,本研究排除CYP3A5*3基因型的干扰后再考察SUMO4基因多态性对他克莫司浓度的影响。研究发现,以CYP3A5*3基因型分层后,SUMO4基因多态性与他克莫司浓度的相关性仅存在于CYP3A5表达型者中,由此也可表明他克莫司主要由CYP3A5代谢,只有CYP3A5正常表达者他克莫司的代谢才会受到SUMO4基因多态性的影响,相关机制有待进一步的探讨及验证。

本研究通过探讨SUMO4基因多态性与他克莫司浓度的相关性,发现SUMO4 rs237024-rs237025携带A突变等位基因与他克莫司剂量校正浓度较高相关,此研究结果为运用药物基因组学寻找生物标记物,指导肾移植术后患者他克莫司个体化用药提供了参考依据。今后将继续探索影响他克莫司浓度个体差异的因素,以期进一步指导他克莫司个体化用药。