药学学报  2015, Vol. 50 Issue (2): 148-153   PDF    
人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究基本策略及进展
梁会超, 王庆华, 巩婷, 杜国华, 杨金玲 , 朱平     
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 国家卫生计生委天然药物生物合成重点实验室, 北京 100050
摘要:人参、西洋参和三七等传统中药材因其广泛且良好的药理活性一直倍受关注, 而人参皂苷是其主要活性成分。糖基转移酶是催化人参皂苷生物合成最后一步的关键酶。人参皂苷苷元经过糖基转移酶的修饰, 产生了复杂多样的人参皂苷, 从而具有广泛的药理活性。目前人们已通过合成生物学技术实现了人参皂苷苷元和稀有人参皂苷compound K的合成。人参皂苷苷元的糖基化作为人参皂苷生物合成途径的最后一步, 是整个合成途径中最重要的环节之一, 近年来也取得了一些研究进展。本文介绍了人参皂苷生物合成途径中相关糖基转移酶研究的基本策略, 并对相关进展进行了综述, 为人参皂苷生物合成途径的深入解析及通过合成生物学途径获得人参皂苷提供理论参考。
关键词人参     人参皂苷     生物合成     糖基转移酶     合成生物学    
The basic strategies and research advances in the studies on glycosyltransferases involved in ginsenoside biosynthesis
LIANG Hui-chao, WANG Qing-hua, GONG Ting, DU Guo-hua, YANG Jin-ling , ZHU Ping     
State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of National Health and Family Planning Commission, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: Traditional herbal medicines, Panax ginseng, Panax quinquefolium and Panax notoginseng, attract our attention for their extensive and powerful pharmacological activities. Ginsenosides are the main active constituents of these medicinal herbs. The related glycosyltransferases involved in ginsenoside biosynthesis are the key enzymes which catalyze the last important step. Modification of ginsenoside aglycones by glycosyltransferases produces the complexity and diversity of ginsenosides, which have more extensive pharmacological activity. At present, ginsenoside aglycones and compound K have been obtained by synthetic biology. As the last step of ginsenoside biosynthesis, glycosylation of ginsenoside aglycones has been studied intensively in recent years. This review summarizes the basic strategies and research advances in studies on glycosyltransferases involved in ginsenoside biosynthesis, which is expected to lay the theoretical foundation for the in-depth research of biosynthetic pathway of ginsenosides and their production by synthetic biology.
Key words: Panax ginseng     ginsenoside     biosynthesis     glycosyltransferase     synthetic biology    

人参、西洋参和三七同属于伞形科人参属多年生草本植物,都是应用广泛的传统中药材。人参皂苷属于三萜类化合物,是人参、西洋参和三七中的一种重要次级代谢产物,也是其主要活性成分。根据碳骨架的不同,人参皂苷可分为齐墩果烷型和达玛烷型两类。其中齐墩果烷型皂苷以齐墩果酸为苷元; 达玛烷型皂苷则以原人参二醇和原人参三醇为苷元。达玛烷型苷元由糖基转移酶催化不同的糖基修饰,从而产生了不同种类的达玛烷型皂苷。二醇型皂苷包括Rb1、Rd、F2、Rg3等; 三醇型皂苷包括Re、Rg1、Rf、Rh1等[1]。目前已经分离得到的各种人参皂苷可达150多种[2]

糖基转移酶催化人参皂苷苷元的糖基化是人参皂苷生物合成途径中最下游的步骤。药理学研究发 现,多种类型的人参皂苷可以发挥不同甚至相反的药理作用,其根本原因在于糖基化修饰的不同[3, 4, 5, 6, 7]。因此,人参皂苷生物合成相关糖基转移酶的研究一直倍受关注。本文对人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究的基本策略及进展进行了综述,为人参皂苷生物合成途径的深入解析及通过合成生物学途径获得人参皂苷提供理论参考。

1 人参皂苷生物合成途径中相关糖基转移酶研究策略 1.1 糖基转移酶的纯化方法——直接提取法

蛋白提取纯化技术是较早兴起的技术,也是获得蛋白样品的最基本方法。随着技术手段的改进,从植物中提取和纯化蛋白的方法越来越成熟。研究者可以直接从植物材料中提取纯化得到糖基转移酶,从而对其进行酶学性质研究。陈欣等[8]采用硫酸铵盐析法首次从人参毛状根中分离得到一种糖基转移酶,通过SDS-PAGE分析,确定其分子质量为56.6 kDa,并对该酶的催化条件及金属离子对酶活性的影响进行了分析。但是由于没有进行生物转化实验,因此没有确定该酶是否与人参皂苷生物合成相关。Yue等[9]从三七悬浮细胞中纯化出一种糖基转移酶,通过SDS-PAGE分析,确定其分子质量为36 kDa,并且发现其能催化Rd转化为Rb1,转化率达80%。

1.2 糖基转移酶基因研究方法 1.2.1 通过转录组分析筛选糖基转移酶基因

目前,糖基转移酶基因的筛选主要采用转录组分析的方法。随着转录组高通量测序技术的快速发展,每种材料都可获得大量的表达序列标签 (expressed sequence tag,EST)[10]。首先建立材料的cDNA文库,通过大规模测序获得cDNA片段5' 或3' 端序列,这些片段即为EST。获得片段的数量与cDNA数量即基因表达水平相关,因此可以将其看作细胞内表达基因的一个目录和表达指数[11, 12]。转录组测序方法的缺点是获得的片段通常小于500 bp,即使随着测序技术的提高也很难获得基因全长,但利用软件可将相关序列拼接起来,构成contigs,尽可能延长所得序列。后续分析主要采用生物信息学方法,通过序列比对得到序列间的同源关系及系统发育关系,从而确定保守序列等信息。根据这些序列信息完成基因注释,并推断可能的功能基因,然后再进行基因的功能鉴定。现阶段发现的大部分糖基转移酶基因均通过此方法获得。

1.2.2 运用特征序列筛选糖基转移酶基因

根据酶的序列特异性及对底物的选择特异性,目前已发现的糖基转移酶大体可分为95个家族。植物中发现的糖基转移酶大多与萜类和甾醇类化合物合成相关,而且多以活性核苷糖尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖 (UDPG) 为糖基供体。在人参属植物中参与人参皂苷生物合成的糖基转移酶也是如此,这类糖基转移酶一般属于第一家族,也被称为UDP-糖基转移酶 (UGT)[13]。对糖基转移酶第一家族来说,公认的影响糖基转移酶发挥作用的保守序列是C端44个氨基 酸组成的PSPG盒。目前研究一致认为PSPG盒是糖基转移酶与UDPG的结合位点,其中存在高度保守的谷氨酸和组氨酸。Vogt等[14]在定点突变了谷氨酸和组氨酸之后,发现糖基转移酶失去了活性,由此推测这两个氨基酸可能直接参与了糖基转移酶的催化 反应。目前发现的第一家族糖基转移酶中50% 都含有PSPG盒。作为模式生物,拟南芥率先完成了糖基转移酶基因相关信息分析,发现其中第一家族的糖基转移酶绝大部分都含有C末端保守序列[15, 16]。因此,在研究人参皂苷生物合成相关糖基转移酶时,PSPG可作为一个重要特征指标帮助我们在大量的序列中尽快筛选到糖基转移酶基因。

1.2.3 筛选糖基转移酶基因的其他方法

糖基转移酶基因的获得还可采用从cDNA文库中直接扩增的方法。首先利用植物材料提取RNA,通过RT-PCR获得cDNA,构建文库。再通过已知的糖基转移酶基因序列比对,发现其中的保守序列,据此设计简并引物,从cDNA文库中扩增糖基转移酶基因。还可以结合蛋白提取方法,通过提取植物材料中的糖基转移酶,进行功能鉴定以确定酶的催化功能,然后根据蛋白的氨基酸序列克隆糖基转移酶基因。

1.3 糖基转移酶基因功能鉴定方法

糖基转移酶基因一般从表达水平和功能水平两方面进行鉴定。植物体同一条代谢途径中所有酶的表达水平及调控通常呈现相关性。已有文献表明,在人参属植物中,人参皂苷生物合成相关基因表达模式相似,并且通过茉莉酸甲酯诱导后会出现共同上调的现象[17]。因此,表达水平鉴定就是先利用茉莉酸甲酯诱导,然后采用qRT-PCR方法检测候选糖基转移酶基因和内参基因 (已知的人参皂苷生物合成相关基因,如达玛烯二醇-II合酶基因等) 的表达水平是否相关。与此同时,可以通过检测基因表达的组织特异性来辅助筛选糖基转移酶基因。功能鉴定通常采用体外酶促反应实验,即纯化糖基转移酶基因表达产物,供给外源的活性糖及底物,检测催化功能及转化率,从而鉴定基因功能。Meesapyodsuk等[18]从王不留行的7 200个ESTs中筛选到一个基因pSv33B05,其表达产物可能参与皂苷生物合成过程中的C-28糖基化,划归UGT74M1家族。将该基因利用原核系 统表达,纯化后的产物在体外酶促反应体系中,以某些三萜类化合物 (皂皮酸、绵根皂苷元和常春藤皂 苷元等) 为底物,以UDPG为活性糖基供体时,可以催化转糖基反应。Achnine等[19]从蒺藜苜蓿的ESTs中筛选到两个可能的三萜类糖基转移酶UGT71G1和UGT73K1编码基因,通过原核系统表达,利用重组酶建立体外酶促反应体系,发现其能以某些三萜类化合物为底物催化转糖基反应。

2 人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究进展 2.1 西洋参中人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究

Sun等[20]以西洋参的根为材料构建cDNA文库,从中筛选出可能参与人参皂苷苷元糖基化的235个unigenes,其中包括148个contigs和87个singletons。对这些序列进行了PSPG结构域和注释信息的二次筛选,最终筛选出27个可能的糖基转移酶基因。利用茉莉酸甲酯处理西洋参材料,qRT-PCR结果显示,这27个基因中有11个被诱导上调,3个被明显下调。随后检测11个被上调基因的组织特异性表达,其中4个基因 (contig01001、contig14976、contig15451和contig16321) 的表达模式与达玛烯二醇-II合酶基因相似,所以推测其可能为人参皂苷生物合成相关糖基转移酶基因。Wu等[21]将生长3年的北美人参转移到模拟自然的人工生长环境中,从第四年开始,从7个不同生长阶段的根中提取RNA,利用454测序技术进行测序,将得到的序列比对后发现有164个可能为糖基转移酶基因序列,其中54个同时在人参和三七中发现过。为了进一步鉴定基因功能,分别以达玛烯二醇-II合酶和鲨烯环氧酶基因为内参,进行茉莉酸甲酯诱导实验,发现6个序列 (Pq137680.1、Pq47050.2、Pq177130.1、Pq117050.1、Pq158770.1和Pq10160.3) 与达玛烯二醇-II合酶基因表达呈正相关,其中Pq137680.1的相关水平最高,因此推测这些序列可能是人参皂苷生物合成相关糖基转移酶基因。

2.2 三七中人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究

Luo等[22]利用四年生三七的根为材料构建cDNA文库,从中筛选出242个可能的糖基转移酶unigenes。根据其与达玛烯二醇-II合酶基因表达模式的关系,筛选到16个糖基转移酶片段,其中8个片段通过RACE获得了全长序列。通过系统发育分析,其中序列Pn00082、Pn02086和Pn13895与蒺藜苜蓿的三萜类糖基转移酶UGT71G1和UGT73K1基因序列同源性较高,同属于糖基转移酶A组,其中Pn13895同源性最高,被认为是最有可能参与人参皂苷生物合成的糖基转移酶基因。但是通过功能鉴定发现糖基转移酶UGT71G1和UGT73K1均参与催化生成齐墩果烷型人参皂苷,因此从三七中筛选到的糖基转移酶在达玛烷型人参皂苷合成过程中是否发挥作用还有待验证。向丽等[23]根据被注释为糖基转移酶的转录本Pn02086设计特异引物,分别利用从三七花、茎和根提取的RNA,通过RT-PCR和RACE技术获得PnUGT1基因。通过生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质及高级结构进行分析,确定其351~394位是糖基转移酶的保守结构域PSPG。将PnUGT1与多种植物的糖基转移酶进行序列比对,进化关系分析表明其与蒺藜苜蓿中的糖基转移酶UGT71G1亲缘关系最近,PSPG结构域相似性为66%。但组织特异性表达实验结果表明,该基因并非在根中表达水平最高,而是在叶中表达水平最高,在根中表达水平反而最低。Chen等[24]发现西洋参中的皂苷含量在花中最高,其次是根、叶和茎。这与通常认为根是含人参皂苷的主要组织、根为人参皂苷主要来源的认知显然不符。由此又引出了人参皂苷在人参中的合成和贮存位置是否一致的问题,而破解相关糖基转移酶进而解析人参皂苷生物合成途径恰好有助于解决这一问题。

2.3 人参中人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究

Chen等[25]以生长11年的人参根为材料构建cDNA文库,利用454测序技术进行测序,通过GO功能分类及KEGG通路分析,筛选到235个糖基转移酶unigenes。通过序列比对发现,其中有6个序列 (FW1NBNE01BJ9EH、JI157165、FW1NBNE01AV059、FW1NBNE01CGFKY、JI158143和JI162959) 与西 洋参中发现的侯选糖基转移酶基因序列contig14976和contig16321有较高同源性[20]。Li等[26]分别以人 参根、茎、叶和花为材料构建cDNA文库,利用454测序技术获得大量的序列信息,从中筛选出129个 可能的糖基转移酶unigenes,其中6个 (contig89150、contig89599、contig48582、contig18298、contig76094 和contig72547) 与Sun等[20]预测的西洋参糖基转移酶基因序列有较高同源性。Khorolragchaa等[27]利用不同人参组织构建cDNA文库,从704个ESTs中筛选到88个长度大于500 bp的ESTs,并从中筛选到12个糖基转移酶基因,均包含PSPG结构域。通过系统发育分析表明,这12个糖基转移酶基因序列分别属于8个家族,6个组。针对含44个氨基酸的PSPG结构域进行序列比对,发现位点1 (W)、4 (Q)、8 (L)、14 (G)、19 (H)、21 (G)、22 (W)、24 (S)、27 (E)、43 (E/D) 和44 (Q) 高度保守。通过qRT-PCR方法检测组织特异性表达,结果显示这12个糖基转移酶在根和叶中表达水平最高。通过茉莉酸甲酯诱导后,发现其中6个糖基转移酶 (PgUGT1、PgUGT2、PgUGT4、PgUGT7、PgUGT12和PgUGT17) 表达水平明显提高。组织特异性表达实验结果显示PgUGT2在根中的表达水平最高,并且发现PgUGT2基因与在三七中发现的Pn13895具有很高同源性,所以推断其参与人参皂苷生物合成的可能性较大; PgUGT2基因与Chen等[25]发现的JI162959也具有同源性,而且PgUGT1和PgUGT2是少有获得全长基因序列的候选糖基转移酶,因此具有深入研究的价值。Jung等[28]以四年生人参的根、地下茎、正在发育的种子、组织培养幼苗和土壤培养幼苗的嫩芽为材料构建cDNA文库,从中筛选到12个糖基转移酶基因序列,这些序列均含有PSPG结构域,还含有其他植物UDP糖基转移酶中的UDP结合结构域。Kim等[29]以四年生人参的叶片为材料构建cDNA文库,从中筛选到4个可能的糖基转移酶基因序列,这4个序列均包括在Jung等[28]筛选到的12个候选糖基转移酶基因序列之内。Subramaniyam等[30]以茉莉酸甲酯处理的人参不定根为材料构建cDNA文库,筛选相关糖基转移酶基因。利用芯片技术检测了各基因的表达模式,结果显示在茉莉酸甲酯的诱导下,11个候选糖基转移酶的表达水平得到上调。Yan等[31]从人参cDNA文库中筛选到一个糖基转移酶基因UGTPg1,将人参皂苷合成相关酶基因与UGTPg1一起导入酿酒酵母后,构建了能产生稀有人参皂苷Compound K的工程菌。这是第一次确证人参皂苷生物合成相关糖基转移酶的功能,也是第一次在微生物中构建了完整的人参皂苷代谢途径。通过序列比对,发现UGTPg1与Khorolragchaa等[27]筛选出的PgUGT2基因同源性高达99%。后续研究发现,该酶还可以作用于底物Rh2和Rg3,而这两个催化反应与糖基化反应恰恰相反,都是水解反应,生成了在C20位仅有寡糖基的F2和Rd,而且有趣的是该酶对Rh2和Rg3的亲和力比PPD高。上述结果表明,糖基转移酶的作用是复杂的,甚至可能是双功能的。此外,该研究还发现,糖基转移酶与细胞色素P450的作用顺序可以相互颠倒,而通常认为人参皂苷的生物合成都是先经过细胞色素P450的催化再被糖基转移酶修饰,这一新发现扩展并完善了人们对人参皂苷生物合成途径的认知。

综上所述,人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究已取得一定进展。但在GenBank中注册的人参ESTs近2万条,西洋参ESTs近5千条,而三七ESTs仅百余条,与拟南芥高达180多万条ESTs相比,现有的数据不足以完成对人参皂苷生物合成相关糖基转移酶这类多基因家族酶的深入研究。现阶段得到的大量糖基转移酶基因序列都是部分片段,得到的全长基因仅占极少数。唯一完成功能鉴定的人参皂苷生物合成相关糖基转移酶,其结果也并非推测的单纯糖基转移酶活性,其催化功能、底物选择性及作用机制等都非常复杂,需要进一步深入探究。

3 小结

人参皂苷是名贵药材人参、西洋参和三七的主要有效成分,具有多样的生物活性和可观的经济价值。随着近年来大量肆意采挖,天然生长的人参已经日趋减少,仅剩的资源也大都分布在人迹罕至之地,难以被人们利用,况且不加节制的采挖势必导致天然人参资源的迅速枯竭。而土地资源有限、人参生长周期长及连作障碍等又严重阻碍了人参种植产业的发展。由于人参皂苷结构复杂,人工合成也异常困难。有鉴于此,人们试图通过合成生物学技术来生产人参皂苷。通过科研工作者多年的努力,人参皂苷生物合成途径的解析已基本完成,并且已在酿酒酵母中成功构建出人参皂苷苷元和稀有人参皂苷compound K的代谢途径。但人参皂苷苷元的糖基化修饰研究还处于初始阶段。以仅有的几种苷元为底物,经过糖基转移酶选择性修饰,便产生出百余种能够发挥不同药理活性的人参皂苷。糖基转移酶作为一种多基因家族 酶,其庞大的种类数量、特异的序列及专一的选择性都给我们研究人参皂苷苷元的糖基化修饰带来了挑战。近年来,通过发展迅速的转录组测序技术及生物信息学分析,已经筛选出一些与人参皂苷合成相关的糖基转移酶基因序列,但其中大多为部分片段而非全长基因,因此难以进行后续的功能鉴定。迄今为止,已经完成功能鉴定的糖基转移酶数量极其有限。但可以预见,将来随着对糖基转移酶研究的不断深入,利用合成生物学技术获得能产生人参皂苷的工程菌,再结合微生物发酵方法有望成为新一代的人参皂苷生产途径。

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