2. 北京大学药学院, 北京 100191
2. School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China
细胞穿透肽 (cell-penetrating peptides,CPPs) 也称为蛋白转导域 (protein transduction domains,PTDs),具有较强的介导其他分子进入细胞的能力,其中典型的代表有转录活化因子 (trans-activating transcriptional activator,TAT) 和聚精氨酸。大多数已知的CPPs并不具备细胞或组织特异性,它们可以与细胞膜上的硫酸类肝素和其他葡胺聚糖类等成分作用并被几乎所有类型细胞摄取[1, 2]。有报道[3, 4]显示,中和CPPs的电荷或借助长链聚乙二醇 [poly(ethylene glycol),PEG]的修饰,可使其吸附作用和细胞摄取作用大幅度降低。因此,通过多聚阴离子的静电屏蔽和PEG的空间位阻效应,有望抑制CPPs的细胞穿膜特性,有助于设计新型递送载体避免CPPs体内传递时非特异性细胞摄取现象。
1 可激活细胞穿透肽最早提出的可激活细胞穿透肽 (activatable cell- penetrating peptides,ACPPs) 是指可被肿瘤部位的特殊酶类激活进而诱发其细胞穿透性的一类新型载 体[5]。当聚阳离子肽段与聚阴离子肽段连接后,两者的静电作用使得聚阳离子肽的细胞穿膜功能被暂时屏蔽。酶裂解效应则可断裂聚阳离子和聚阴离子肽的连接部分,确保可激活细胞穿透肽在特定环境下的高渗透性。基于此,研究人员设计并开发了一系列类似的输送系统,通过引入环境敏感“开关”来控制CPPs活性,其中所依赖的特殊条件涉及肿瘤微环境[6] (如肿瘤部位过度表达某种蛋白酶、呈弱酸性)、外部的物理化学刺激[7] (如光照射) 和外源性物质的引入。见图 1。
蛋白酶解是一种简单的水解过程,解离两个相邻氨基酸之间的酰胺键。作为ACPPs的一部分,肽连接域可以是蛋白酶底物,它的断裂促进CPPs和阴离子肽的分离,从而引发细胞摄取。相比正常组织,肿瘤等病变微环境中高度表达某些特定类型的蛋白酶。基于此特点,学者们报道了以下几类蛋白酶可激活的ACPPs,用于定位输送显影探针和治疗分子。
1.1 基质金属蛋白酶10年前,钱永健课题组[5]首次报道一种基于ACPPs的新型靶向输送系统。此基 质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase,MMP) 敏感的系统由3部分构成: 聚精氨酸 (一种合成的CPPs); 聚阴离子部分,可以中和聚精氨酸的正电荷,屏蔽聚精氨酸的穿膜活性; 前两部分的连接段,一种MMP可裂解氨基酸序列。由于MMP在正常生理环境中表达程度较低,体循环中的ACPPs可稳定存在。一旦到达肿瘤区域,连接部分被过度表达的MMP-2/9裂解,随之聚阴离子部分脱离,ACPPs被激活和暴露 出聚精氨酸,携带负载分子进入肿瘤细胞。在此项研究中,Cy5 (Cyanine 5) 标记的九聚精氨酸 (r9) 和屏蔽肽 (e8) 通过PLGLAG接合,后者是MMP-2特异性裂解底物肽。在两条荷相反电性序列的静电作用 下,分子呈现发夹状结构。流式分析结果显示,候选ACPPs在人纤维肉瘤细胞的摄取量是非底物序列连接肽的17倍。而且同样静脉给予PEG化共轭连接物,酶可激活体系组在肿瘤部位累积量相比含乱序肽的非裂解对照组至少增加了3倍。
为了评价可激活细胞穿透肽在其他类型癌症的适用性,该课题组在皮下纤维肉瘤、黑色素瘤以及宫颈、前列腺、结肠和乳腺癌等多种移植瘤模型基础上进行了研究。结果显示,以L型氨基酸底物肽构成的ACPPs相对于对应的D型替代物 (阴性对照组) 都表现出明显的分布选择性,在肿瘤部位的累积量提高2~6倍[8]。除改善体内分布能力,ACPPs相比CPPs最主要的优势是对正常细胞的毒性较低。小鼠静脉注射多肽后,r9组的急性中毒剂量比ACPPs低4倍[9]。这些研究表明,ACPPs可以将显影和治疗分子有效传递到肿瘤及相关炎症部位。
未结合纳米载体的ACPPs面临的主要问题是体循环给药后较高的背景 (尤其是在软骨和肾脏[8]) 和肿瘤区域显影强度较低[9]。由此,钱永健课题组[8, 10]合成了ACPPs修饰的5代聚酰胺型树状大分子并对其选择性细胞摄取能力进行评价。为了达到更好的肿瘤成像效果,他们在该树状大分子纳米载体中同时负载了Cy5荧光探针和磁共振 (magnetic resonance,MR) 造影剂钆。经静脉注射后,大分子载体选择性分布于MMP-2过度表达的肿瘤中,产生的可探测信号持续超过48 h,此MR成像特性为外科切除术提供了保障。不仅如此,通过标记的Cy5荧光信号可实现手术过程中肿瘤边缘的成像。ACPPs修饰树枝状纳米粒的应用有助于完整地切除肿瘤边缘,进而改善肿瘤切除术效果[11]。
正电子发射断层摄影术 (positron emission tomography,PET) 和单光子发射计算机化断层显像 (single photon emission computed tomography,SPECT) 在肿瘤诊断领域应用非常广泛,有研究将基于ACPPs的输送载体与这两种技术结合,用于肿瘤诊断相关研究评价。在Watkins等[12]报道中,将锝放射性核素共轭连接到CPPs结构的末端,以此评价MMP-14的裂解性能。放射性同位素标记的MMP-2/9可裂解结构成功地累积于肿瘤部位,与非激活对照组 (MMP底物序列部分以乱序肽替代) 相比,可激活裂解结构在肿瘤区域富集高达6倍的累积量[13]。当然,相比非激活对照组,此系统还增加激活结构在肌肉、心脏、肺和脾脏等组织中的分布,表明该实验条件下激活结构的分布不具备肿瘤组织特异性,激活作用不仅发生在肿瘤也包括体循环系统。该作者认为针对循环系统内不表达的蛋白酶进行ACPPs设计以及优化筛选酶敏感连接臂,将有助于避免ACPPs的非特异性降解,进一步提高载体的肿瘤靶向性。
此外,双重标记的ACPPs载体也被应用于光声成像领域的研究。在Levi等[14]合成的MMP-2可裂 解结构中,BHQ3猝灭剂 (吸收波长672 nm) 连接至r5蛋白转导结构域,Alexa750荧光团 (激发波长/发 射波长: 749/775 nm) 连接至e4聚阴离子屏蔽域。由于未裂解状态下结构中的两个发色团均显示光谱信号,在675和750 nm两个波长处完整结构显示出强烈的吸收信号。经MMP-2裂解,ACPPs释放出聚阴离子屏蔽肽,BHQ3标记的CPP部分被细胞摄取。在675 nm产生的信号中减去750 nm得到的声光信号,所得剩余响应值源于激活的BHQ3-CPP部分。此策略的优势在于可辨识不同载体群中类似的ACPPs可激活探针的选择性分布。Savariar等[15]报道了一类新型的比率ACPPs (ratiometric ACPPs,RACPPs),结 构中包含远红外荧光供体 (Cy5) 和近红外荧光受体 (Cy7)。ACPPs中的连接臂一旦被肿瘤相关的MMP- 2/9或弹性蛋白酶裂解,淬灭的Cy5荧光将恢复并伴随Cy7二次发射。蛋白酶的水解作用使得Cy5∶Cy7发射比例增大了40倍,这两个荧光探针的发射强度比率,可作为评价蛋白酶解活性的一个指标。ACPPs整体探针的摄取和非特异性亲合并不会影响该定量过程,相比单波长强度的测定方法也更加简单易行。这种比率评价指标为肿瘤原发灶和转移灶的鉴别提供了一个快速且可量化的标准,具有较好的敏感性和选择性。
在ACPPs的设计、构建和评价方面,国内学者也进行了一系列较为深入细致的研究。齐宪荣课题 组[16]曾成功构建了序列为EEEEEXPLGLAGRRRR RRXKC的ACPPs,在IV型胶原酶 (MMP-2/9) 的作用下借助肽段质谱分析考察了酶解特性。结果表明,ACPPs被IV型胶原酶有效裂解伴随着CPPs的释放,裂解半衰期约为4 h。基于相同的底物序列 (PLGLAG),该课题组时念秋等[17]研发了一种共轭连接有ACPP的阿霉素 (doxorubicin,DOX) 偶联物 (ACPP-DOX)。流式细胞实验结果显示,酶触发的激活作用增强了ACPP-DOX的细胞摄取,相比MMP-2/9阴性表达的MCF-7细胞,阳性表达HT-1080细胞摄取的ACPP- DOX显著增多。 此外,ACPP-DOX可高效抑制HT-1080细胞增殖,ACPP则几乎无细胞毒性。上述实验结果表明,ACPP-DOX作为新型的前体药物有潜力在MMP相关肿瘤干预上发挥积极作用。
在CPPs类物质中,低分子量鱼精蛋白 (low- molecular weight protamine,LMWP) 在介导负载物跨细胞膜转运方面表现得像TAT一样高效。基于此,氨基酸序列设计的可活化LMWP (ALMWP) 由3个结构域组成: 聚阳离子LMWP、可裂解的连接域及聚阴离子域 (E10)。与该结构中LWMP的末端共轭连接后,纳米粒给药系统 (ALMWP-NP) 在HT-1080细胞的累积显著增强,显示出MMP依赖性摄取特征。基于HT-1080荷瘤小鼠的生物分布研究表明,ALMWP- NP显著增加了紫杉醇 (paclitaxel,PTX) 在肿瘤部位的累积,非靶组织的分布则无显著差异。此外,瘤内分布实验表明,更多的ALMWP-NP穿透至肿瘤实质。而且相比未修饰的纳米粒和LMWP修饰纳米粒,负载PTX的ALMWP-NP抗肿瘤效果显著增强[18]。
为了进一步提高药物的肿瘤细胞选择性和穿透能力,齐宪荣课题组[19]设计开发了双修饰纳米脂质载体 (nanostructured lipid carrier,NLC) 系统,集肿瘤微环境敏感多肽 (tumor microenvironment-sensitive polypeptides,TMSP) 和小分子配体叶酸两者的优势于一体。将TMSP和叶酸分别与DSPE-PEG末端结合,同时对载多西紫杉醇 (docetaxel,DTX) NLC进行表面改性修饰 (F/TMSP-DTX-NLC)。TMSP由3部分组成: r9、MMP-2/9敏感的连接部位 (PVGLIG) 以及聚阴离子屏蔽肽 (EGGEGGEGG)。在KB、HT- 1080、MCF-7及A549细胞模型水平的实验结果表 明,F/TMSP-DTX-NLC细胞摄取和细胞毒性的差异高度依赖于叶酸受体表达和MMP-2/9分泌。F/TMSP- DTX-NLC能够有效穿透进入KB和HT-1080多腔隙的肿瘤球状体细胞。此外,相比非修饰的多西紫杉醇纳米脂质载体 (DTX-NLC) 和泰素帝 (多西他赛注射液) 而言,基于荷KB肿瘤裸鼠模型的评价实验,F/ TMSP-DTX-NLC显示了更高的抗肿瘤效力和较低的系统毒性。
利用肿瘤微环境的独特性,蒋晨课题组[20]设计了一种基于低pH和高表达MMP-2的可活化双重触发dtACPP。该结构中pH敏感屏蔽肽 (e4k4) 的等电点 (pI) 约为6.4,因此在正常生理环境 (pH 7.4) 中该肽段将带负电荷,而在肿瘤区域较低的pH微环境中则带正电荷或呈电中性。将此序列与PLGLAG和九聚精氨酸连接构成dtACPP,在此基础上利用阳离子聚L-赖氨酸 (DGL) 静电吸引荷负电的质粒DNA,最终形成压缩的纳米粒。生物分布的结果显示,与未修饰载体和CPP修饰载体治疗组相比,dtACPPD/DNA治疗组24 h累积量显著提高。此外,该课题组[21]对上述载体结构和功能进行升级,成功地研发了智能dtACPP修饰的纳米系统,使基因药物和化学治疗药物的负载能够同步实现。利用dtACPP修饰的纳米粒共传递表达靶向VEGF干扰RNA的质粒 (shVEGF) 和DOX (dtACPPD/shVEGF-DOX)。结果显示,该载体的干预实现了有效的肿瘤内血管抑制和细胞凋亡,还表现出较强的肿瘤靶向性、全身给药后较小的副作用和理想的抗肿瘤疗效。
1.2 凝血酶凝血酶 (thrombin) 被视为是动脉粥样硬化疾病发展过程中的关键因子,由于缺乏合适的分子探针用于体内蛋白酶活性成像,目前该蛋白酶的相关研究较少。Olson等[22]开发了一种新型的荧光标记的ACPPs,其结构中包含源自蛋白酶激活受体 (proteinase activated receptor 1,PAR-1) 的肽序列DPRSFL,该短肽可被凝血酶选择性裂解。DPRSFL- ACPP裂解产物累积于活体小鼠的动脉粥样硬化病变部位,预注射水蛭素组的保留量则降低85%。在病变特征更严重的斑块中,ACPPs裂解产物显示了最 大程度的细胞摄取。取人动脉粥样硬化斑块样品和ACPPs孵育,相比对照组,DPRSFL-ACPP组可以观察到更多的裂解产物 (63%)。该报道显示,DPRSFL- ACPP可应用于凝结物和动脉粥样硬化中凝血酶活性的研究,而且凝血酶可裂解的ACPPs有望被开发成诊断分子,用于高风险动脉粥样硬化斑块的早期诊断和术中显影。
利用替换诱变筛选 (substitution mutagenesis screen),该课题组对底物序列进行优化筛选后得到PPRSFL,该肽段可增加凝血酶裂解特异性同时降低相关酶类 (如纤溶酶和因子X) 的裂解程度。基于此底物肽,Chen等[23]构建了选择性更佳的ACPPs,以测量脑损伤后凝血酶的活性。凝血酶裂解ACPPs使得多聚谷氨酸脱离,促使Cy5标记的聚精氨酸被附近细胞摄取,而未裂解的探针则经再灌注从组织清洗出来。为证实PPRSFL-ACPP对凝血酶的选择性,在动脉输注ACPPs探针期间,静脉给予阿加曲班暂时阻止凝血酶活性。PPRSFL-ACPP荧光摄取明显减少,证实凝血酶活性对该体内显影策略的必要性。而且,大鼠脑部切片结果进一步证实,PPRSFL-ACPP在凝血酶活性检测中显示出理想的选择性,80%探针标记的PPRSFL-ACPP与免疫染色的凝血酶共定位,而与纤溶酶或因子X共定位的比例则少得多。
上面提到的两个ACPPs结构都只标记一个荧 光基团 (Cy5),定量检测时需要将未裂解的肽从 靶组织中清除。Tsien组[24]对ACPPs的结构进行升 级,在多聚阴离子域增加一个荧光受体 (Cy7),设计出一种比率ACPPs (RACPPs)。在未裂解的探针上,聚阳离子域上标记的Cy5在受体荧光团Cy7的作 用下产生了高效的荧光共振能量转移 (FRET)。连接部分被凝血酶裂解后,FRET作用被破坏,Cy5荧光 团(峰值约为670 nm) 随之很快得以恢复且Cy7 (峰值约为780 nm) 再发射被消除。体外实验显示,将 纯化的凝血酶加入到含底物序列PPRSFL的RACPP (RACPPPPRSFL) 中,Cy5/Cy7发射比率提高达34倍。尽管RACPPPPRSFL是目前最为典型的凝血酶选择性ACPPs,但该课题组最近筛选出一种新的RACPP (RACPPNleTPRSFL,即利用正亮氨酸TPRSFL代替ACPPPPRSFL中的PPRSFL序列),可使凝血酶裂解加速约90倍。RACPPNleTPRSFL针对凝血酶的选择性是纤溶酶的52.5倍,是凝血因子Xa的27.7倍。此外,尾部受伤小鼠模型实验显示,RACPPPPRSFL组近10 min才检测到凝血酶比率增加,而RACPPNleTPRSFL组在 5 min时即表现出相对更强的响应。近期的一些研究筛选出新的有潜力的凝血酶特异性底物,为RACPPs进一步的优化创造了更大的空间[25, 26]。
1.3 前列腺特异性抗原前列腺特异性抗原 (prostate-specific antigen,PSA) 在前列腺癌 (prostate cancer,PC) 组织中表达高度上调,但在正常前列腺细胞中具有较低的表达水平[27],这一差异使得PSA成为前列腺癌治疗中潜在的靶点[28, 29]。Goun等[30]设计构建了一种“可激活的”PTD (APTD),其中r8通过一个PSA敏感的连接臂 (HSSKLQ) 与衰减域偶联。基于合成的r8衰减肽序列库,他们研究了不同序列对r8转运衰减的效力。不同APTD序列的底物裂解半衰期存在差异,一般在1.8~2 h内。以Jurkat细胞和前列腺癌细胞为模型,PSA对APTD的裂解 显著增强了所有时间点和浓度条件下的细胞摄取量 (P < 0.05)。在3 μmol·L-1及以上的多肽浓度水平,相比单纯的r8 PTD所有候选的衰减序列均显著抑制了r8 PTD载体的细胞摄取 (P < 0.01)。结构中包含一个天冬氨酸间隔两个甘氨酸单元的衰减序列,显示了最强的转运衰减作用。而且,随着天冬氨酸引入数量增大,r8 PTD传递衰减效应逐渐增强。基于这些实验结果的策略,为选择性输送治疗与诊断分子到前列腺癌细胞的问题提供了新的解决思路。
前列腺特异性膜抗原 (prostate-specific membrane antigen,PSMA) 是一种分子质量为100 kDa的膜结合糖蛋白,该蛋白的表达程度与前列腺癌发展紧密相关,尤其在前列腺癌症晚期PSMA呈高度表达[31]。研究显示,叶酸缺陷条件下培养的PSMA阳性表达细胞,对叶酸的摄取程度更高,表明PSMA可促进游离叶酸分子的胞内转运[32]。结合叶酸和PSA敏感的ACPPs,作者设计构建了一种高效靶向PC细胞的传递系统——双修饰脂质体[33]。PSA敏感肽包括3个域: CPP (聚精氨酸)、PSA裂解肽序列 (SSKYQ) 及聚阴离子抑制肽 (DGGDGGDGGD)。体内和体外研究表明,多电荷域之间的相互作用可降低非特异性细胞内化,进而促进PC细胞识别和摄取。相比对照载体 (单修饰和非修饰),双修饰脂质体显著增强了所负载小干扰RNA (siRNA) 的细胞摄取,下调保罗样激酶-1 (polo-like kinase 1,PLK-1) 的表达进而诱导前列腺肿瘤细胞的细胞凋亡。基于22Rv1荷瘤裸鼠模型的评价显示,双修饰系统能够最大程度分布于肿瘤部位、降低肿瘤组织PLK-1的表达同时抑制肿瘤的生长。
1.4 其他ACPPs合理设计的主要障碍是候选蛋白酶底物的有效性和目标蛋白酶的组织表达特异性。Whitney等[34]在体内研究中,利用噬菌体展示技术来鉴别累积于肿瘤的肽,考察蛋白水解作用。这种识别蛋白酶解底物的方法是基于肿瘤组织水平的酶解劈裂作用,并未引入任何预先设计或参考的特定蛋白酶种类以及底物序列。为检验这种方法的效力,该研究应用噬菌体展示技术,针对一个独特的ACPPs库进行了体内外评价分析。体内筛选实验中,将噬菌体注射到荷瘤小鼠后,从肿瘤匀浆中提取裂解的噬菌体。体外水平的研究则使噬菌体与正常和肿瘤组织 提取物作用,分别提取裂解的和原型噬菌体。将该法得到的4个候选ACPPs合成并荧光标记,静脉给 予荷瘤小鼠。基于几个肿瘤模型的评价显示,包含底物肽段RLQLKL的序列为最有效的裂解肽,其成功标记了肿瘤和转移灶,对比度达5倍。此筛选得到的ACPP并非MMP和各种凝血因子的酶解底物,而肿瘤中过度表达的纤溶酶、弹性蛋白酶可高效水解断 裂此肽。上述方法可筛选出肿瘤过表达蛋白酶靶向的ACPPs,体现出公正筛选方案 (unbiased selection schemes) 在开发治疗和诊断试剂方面的价值。
2 结合PEG链保护效应的ACPPs利用类似PEG等亲水性聚合物的表面修饰作用,可以延长载体的体循环半衰期以及增加肿瘤累积量,然而PEG等分子的空间位阻效应不利于CPPs、配体等载体修饰功能域与细胞之间的亲合作用[35]。Harris等[36]设计构建了基于磁性荧光葡聚糖包衣的氧化铁纳米粒新型载体,表面修饰了PEG以及细胞内化活性肽,其中PEG经MMP-2酶解底物肽与载体连接。基于HT-1080细胞的流式分析结果显示,经激活态载体转运的荧光探针的细胞摄取量可达屏蔽态载体的40倍。利用像素分析法 (pixel-by-pixel analysis) 检测了肿瘤组织切片中与聚合物外层共定位的纳米粒比例,结果显示,纳米粒与可解离外层的连接降低了6倍,表明纳米粒外层的解离发生在肿瘤内。该研究的设计思路可以拓展到其他多种环境敏感和刺激响应型载体上,在相关病理刺激因素影响下实现表面修饰的生物活性基团的激活。
量子点纳米粒属于一种半导体纳米结晶,由于具备优良的量子产率、高摩尔消光系数及高度耐受光漂白作用,该纳米粒作为显影剂应用于大量体内外研究中。Park课题组[37]制备的PEG化量子点纳米粒可以在MMP-2的作用下发生去PEG化效应。该研 究通过改变生物素-底物肽-PEG共聚物的投料量,定量控制经抗生蛋白链菌素包被的量子点表面PEG修饰度。此外,纳米粒表面还连接了生物素修饰的细胞穿透肽。结果显示,每个量子点纳米粒修饰超过9条PEG支链,即可将CPP修饰纳米粒的细胞摄取量降到20%左右,而经MMP-2处理后,量子点的细胞摄取程度显著提高。见图 2。
上述两种载体的靶向原理主要是利用PEG基础上的被动靶向和环境敏感机制的结合,Zhu等[38]为了提高载体的靶向能力,在载体表面PEG远端引入了单抗,进一步赋予载体肿瘤细胞特异性靶向功能。载体积累于肿瘤部位后,过表达的MMP-2将载体表面的敏感肽劈裂致使长链PEG脱离下来,TAT充分暴露进而发挥细胞穿透促进作用。基于鼠乳腺癌细胞4T1和鼠正常心肌细胞H9C2模型的流式分析结果 显示,可解离PEG和TAT双修饰脂质体经MMP处理后细胞摄取程度显著提高。而进一步修饰了具有 核小体亲合作用的mAb 2C5后,MMP处理前后载体的细胞摄取情况无显著差异,提示针对细胞水平靶向效果而言,可解离PEG和TAT修饰的贡献已经足够大,总体靶向能力有待于体内水平更加深入的研究和评价。
3 结论与展望同许多非病毒传递载体一样,CPPs的不足之处在于无法有效区分不同类型的组织和细胞。尽管在体外水平上,已报道的基于ACPPs的分子成功地控制CPPs的屏蔽与激活,部分分子甚至在动物模型上取得了较理想的效果,但要在体外、体内层面特别是癌症治疗的临床应用中获得令人满意的效果仍是一个艰巨的任务。首先必须面临的困难是蛋白酶解选择性和效率较低,有必要在更多的模型或样本上利用诸如公正筛选方案等手段,发现更高效率和特异性的酶解底物序列。再有,酶解机制和其他靶向元素 (配体、刺激响应等) 的有机结合,有望进一步改善基于ACPPs载体的靶向效果。
在个体化医疗这一未来患者管理的模式中,分子成像和靶向药物传递将扮演着重要角色。将诊断与治疗相结合的治疗诊断学成像,特别适用于一些复杂的疾病如癌症。然而,至今基于ACPPs的研究基本上只是单独地传递治疗剂或影像剂,这两种形态的整合为癌症等疾病治疗个性化和对正常组织损伤最小化提供了一个很有潜力的途径。
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