干扰素 (IFN) 是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子,于1957年被发现并命名[1]。1976年干扰素用于慢性活动性乙肝的治疗[2],但由于干扰素来源有限且价格昂贵,未能大量应用于临床。20世纪80年代初,人们用基因重组的方法获得了干扰素[3],并于80年代末进入工业化生产并投放市场。目前干扰素已被广泛应用于病毒感染性疾病及肿瘤的治疗,我国上市的有24家国内企业生产的IFN-α1b、α2a、α2b及γ,4家国外企业生产的IFN-α2a、α2b、β1a及β1b,临床上应用较多的主要是IFN-α。
IFN-α由160多个氨基酸组成,含有2对二硫键,氨基酸序列如下:
IFN-α1b: CDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISP SSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQ QIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLE ACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE。
IFN-α2a/b: CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMR K/R ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEM IQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE。
其中IFN-α2a与IFN-α2b只在第23位存在1个氨基酸的差别 (Lys/Arg)。
作为重组技术生产的蛋白制品,其蛋白结构正确与否是质量控制的关键内容,错误的结构不仅影响生物学活性,还可能产生免疫原性。本研究选取5个厂家生产的IFN-α理化对照品 (包括1批IFN-α1b、1批IFN-α2a及3批IFN-α2b),应用液质联用技术对其进行了一级结构鉴定,包括氨基酸序列的验证及翻译后修饰的鉴定,并对测定结果进行了比较。
材料与方法 试剂与仪器超纯水 (Milli-Q); 乙腈(色谱纯); 甲酸、碳酸氢铵、二硫苏糖醇 (DTT)、碘乙酰胺 (IAM) 均为分析纯; Trypsin试剂盒 (德国Calbiochem公司); 流动相A (0.1% 甲酸水溶液); 流动相B (0.1% 甲酸乙腈溶液)。超滤管 (截留分子量10 kD); 超高效液相色谱系统 (Waters ACQUITY H-Class); 分子量测定用色谱柱 (BEH300 C4,3.5 μm,2.1 mm × 50 mm); 肽图测定用色谱柱 (BEH300 C18,1.7 µm,2.1 mm × 100 mm); 质谱仪 (Xevo G2 QTof); Unify操作软件。
分子量测定柱温80 ℃; 样品池温度10 ℃; 上样量2 μg; 流速0.2 mL·min-1; 洗脱梯度: 3 min内流动相B由5% 至85%; 质谱采集模式: MS/灵敏度; 毛细管电压: 3 kV; Cone电压: 40 V; 去溶剂气体温度: 350 ℃; 源温: 120 ℃; 去溶剂气体流速: 800 L·h-1,扫描范围(m/z): 500~4 000。用20 μg·mL-1碘化钠溶液对质谱仪进行校正后连接UPLC与质谱进行检测。用Unify软件对采集的数据进行处理并计算分子量。
液质肽图测定通过超滤将样品的缓冲液置换为50 mmol·L-1碳酸氢铵溶液、蛋白浓度约1 mg·mL-1。取50 µL加入胰蛋白酶2 μg,37 ℃孵育过夜 (翻译后修饰鉴定的样品先加入0.1 mmol·L-1的DTT 1 µL,37 ℃孵育1 h; 再加入0.1 mmol·L-1的IAM 2 µL,室温暗处反应30 min,完毕后加胰蛋白酶)。柱温40 ℃; 样品池温度10 ℃; 上样5 μg; 流速0.2 mL·min-1; 洗脱梯度: 60 min内流动相B由1% 至60%; 质谱采 集模式: MSe/灵敏度; 毛细管电压: 3 kV; Cone电压: 40 V; 去溶剂气体温度: 350 ℃; 源温: 120 ℃; 去溶 剂气体流速: 800 L·h-1,扫描范围 (m/z): 50~2 000。用20 μg·mL-1碘化钠溶液对质谱仪进行校正后连接UPLC与质谱进行检测。用Unify软件对采集的数据进行分析处理,结合一级及二级质谱测定结果对样品的氨基酸序列进行验证,并对翻译后修饰进行鉴定。
结果 1 分子量测定将5批干扰素理化对照品编号为1~5,其中1为IFN-α1b、2为IFN-α2a、3~5为IFN-α2b。5批对照品的实测分子量均与理论一致 (表 1),其中3、4号样品由于翻译后修饰,分子量存在不均一现象。经过计算各分子量之间的差值,结合后续的液质肽图鉴定结果,确定3、4号样品的翻译后修饰类型包括: Met111的氧化、N-末端的乙酰化以及N-末端“+Met”,样品3、5的去卷积化前、后的质谱图比较分别见图 1、2。
蛋白的质谱分子量与理论一致是从完整蛋白的层面证明氨基酸序列与理论一致,还需要进一步在肽段的水平进行验证。通过测定肽段的分子量并结合串联质谱结果确定每个肽段的序列是否与理论一致,具体验证方法见文献[4]。表 2是样品1的液质肽图 (图 3) 解析结果,氨基酸覆盖率为99%,只有C-末端的2个氨基酸 (赖氨酸与谷氨酸) 未发现; 肽段分子量测定结果显示误差基本在5 ppm以下,并且有足够数量的串联质谱碎片 (b/y离子),结合完整蛋白分子量测定结果,进一步证明其氨基酸序列与理论一致。通过对肽图结果的解析,其他4批对照品的氨基酸覆盖率也在98% 以上,由于结果类似,在此不再赘述。
完整蛋白直接用胰蛋白酶进行酶切后,有些肽段仍然通过二硫键连接在一起,寻找并鉴定这些肽段可获得样品的二硫键连接信息。肽图分析结果显示,样品1的二硫键连接方式为Cys29-Cys139、Cys86- Cys99,样品2~5为Cys1-Cys98、Cys29-Cys138 (图 3,样品4、5与3类似,未列出),二硫键连接肽段解析结果见表 3。
样品3、4、5同为IFN-α2b,比较其液质肽图,三者之间存在一些差异,对差异肽段进行定性,结果发现样品3、4的部分T1及T1c5存在“+Met”及乙酰化修饰,样品5未见该修饰; 样品3的部分T10肽段存在蛋氨酸氧化修饰,样品4、5也有该修饰,但修饰比例较少。图 4为样品3、5的肽图比较结果,由于样品4的修饰种类介于3与5之间,故未列出。
T1与T1c5均为N-末端肽段,T1丢掉C-末端5个氨基酸后形成T1c5。通过对T1及T1c5的翻译后修饰肽段进行串联质谱分析确定两种修饰均发生在N-末端的半胱氨酸上 (图 5、6)。
T10为从N-末端开始第10个理论酶切肽段,即第84~112位氨基酸组成的肽段。串联质谱解析结果显示: 该肽段的蛋氨酸氧化位点为第111位蛋氨酸 (图 7)。
综上,对样品3中翻译后修饰相关肽段的测定结果进行了汇总,见表 4。
本文中样品3~5的非还原SDS-PAGE的纯度测定结果均为100% (文中未列出),但质谱分子量测定结果显示样品3、4部分存在翻译后修饰,其纯度并非100%,样品5虽然分子量结果比较均一,但肽图测定结果显示也存在少量的蛋氨酸氧化。这说明液质联用技术能够发现常规质控方法不能发现的产品理化特征,有助于更加深入的了解其特性,当其中某些特性为其关键质量属性时,可进一步建立并优化检测方法,完善和提高产品的质量标准。
二硫键是蛋白质中一种关键的共价键,对于维持蛋白的正常空间结构具有十分重要的作用。20世纪80年代,人们已经发现干扰素α含有4个高度保守 的半胱氨酸,形成2对二硫键 (Cys1-Cys98,Cys29- Cys138)[5]。人们将干扰素α的二硫键还原后发现它失去了抗病毒活性,氧化环境下重新形成二硫键后,抗病毒活性恢复[6]。另有研究表明: 二硫键Cys29- Cys139将干扰素内两个保守的亲水区域连接起来,而这两个区域构成了受体识别的基本框架 (basic framework)[7]; 但是有学者在对复合干扰素包涵体进行复性研究时发现,只含有二硫键Cys29-Cys139的中间体 (intermediate) 的抗病毒活性低于正常结构干扰素的10%[8],说明另一对二硫键的正确形成对干扰素的活性也至关重要。本研究中样品2~5的二硫键连接方式与上述文献报道相符。
样品1的二硫键连接方式为Cys86-Cys99、Cys29- Cys139,与上述文献有差异,但文献中未明确干扰素的类型。有学者在研究IFN-α1b与抗体的复合物的晶体结构时发现,Cys29与Cys139在晶体结构中非常接近,应该形成了二硫键,Cys86与Cys99存在于一段α-螺旋的两端,不可能形成二硫键[9],而天然IFN-α1b的二硫键连接方式未见文献报道。样品1的生物学活性为1.6×107 IU·mg-1,较其他4批的均值 (2.4 ± 0.5)×108 IU·mg-1低,但比IFN-α1 (D) 国际标准品 (NIBSC code: 83/514) 的活性 (7.1×106 IU·mg-1) 要高。所以天然IFN-α1b的二硫键连接方式及其对活性的影响还有待进一步的研究。
关于IFNa2b (样品3、4、5) 第111位蛋氨酸存在不同程度的氧化修饰,有研究表明IFN-α2b氨基酸序列中的5个蛋氨酸在存放过程中均容易发生氧化修饰[10],但是第111位蛋氨酸是最容易被氧化的,并在IFN-α2b制品中发现过[11]。Met111发生氧化后会使蛋白二级结构中的α -螺旋比例降低,β-折叠比例升高,但对生物学活性没有影响[12],也有研究发现蛋氨酸氧化会使IFN-α2b更易于发生热变性,但会降低其聚合速率[13]。本研究仅对蛋氨酸氧化进行了鉴定,其对结构及功能的影响将在以后的研究中进行。
本研究还发现部分干扰素样品存在N-末端乙酰化及“+Met”修饰。乙酰化是一种常见的翻译后修饰,但是在原核表达系统中较少见,也有研究者报道过IFN-α2b的N-末端乙酰化修饰[14]。关于N-末端“+Met”,原核细胞新生肽链的N-末端均为蛋氨酸,一般会在后期加工修饰时切除掉,如未切除完全则会在制品中存在N末端“+Met”现象。《中国药典》(2010版三部) 相关要求允许N-末端蛋氨酸的存在。至于乙酰化及“+Met”对干扰素结构及功能的影响还有待进一步研究。
综上所述,本文用液质联用技术对5批干扰素理化对照品进行了一级结构鉴定及比对研究,可为其他重组蛋白药物理化对照品的一级结构鉴定及同类蛋白制品的比对分析提供参考。
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