蛋白质组学和基因组学的研究通常需要在分子水平上对生物体的结构和功能有深刻的理解[1]。例如,蛋白质组学的研究包括蛋白质的检测和鉴别,仅此涉及的研究范围就很大,对发现在生物体内含量极低又具有重要生物功能的蛋白质非常困难。目前实验室常用免疫学的方法检测和定量测定生物样品中的蛋白质[2],如利用抗原抗体特异性反应。尽管满足了特异性和选择性等方面的要求,但是抗体的本质是蛋白质,其结构和活性容易受到理化环境改变而改变甚至失活,而且特异性抗体的筛选也是一件繁琐的工作[3, 4]。
分子印迹就是将模板分子与功能单体通过共价、非共价或金属协同作用形成预聚合物,在交联剂的作用下功能单体发生聚合,将模板分子固定于聚合物中,最后脱除模板分子,即在聚合物材料上留下与模板分子在大小、形状和官能团的方向上都互补的孔穴结构。空穴不仅保留了与模板分子化学结构互补的官能团的有序排列,也维持了它的整个空间构象[5]。当材料再次遇到模板分子时,可发生特异性的结合。根据模板分子与功能单体所发生的相互作用将分子印迹策略分为共价印迹和非共价印迹[6]。分子印迹过程如图 1所示。
在过去20年中,印迹的模板分子包括糖类、甾体、杀虫剂、药物分子和氨基酸衍生物等[7],其应用领域涉及色谱填料、固相萃取、给药系统、催化和生物传感器等,但成功的都是以一些小分子为模板的。对生物大分子尤其是蛋白质分子印迹技术的研究却相对滞后,主要是因为蛋白质分子印迹的过程中面临着以下几大难题: ① 很难获得纯度极高的蛋白质模板分子; ② 模板分子从高度交联聚合物中的脱除困难; ③ 印迹位点对模板分子的特异性结合能力有限; ④ 蛋白质分子在印迹材料混合物中难溶等[8]。经过几十年的探索,许多改良的制备蛋白质分子印迹聚合物的方法已经出现[9]。
纳米材料是一种拥有极大的比表面积和纳米尺寸特性的新型材料,20世纪70年代就已经开始有人对其进行研究[10]。近年来,将小分子印迹于纳米骨架材料表面的研究已延伸到对大分子蛋白质的印迹。这些纳米级别的印迹聚合物不仅能保证模板分子的有效脱除,而且具有良好的对模板分子的重结合能力。本文综述了近年来用于蛋白质分子印迹的纳米骨架材料的研究进展及蛋白质分子印迹的应用前景。
1 二氧化硅纳米粒蛋白质分子印迹可以在二氧化硅纳米粒的表面进行。最初采用的是单分散的二氧化硅纳米粒,随后又有研究人员采用3-甲基丙烯酰氧对二氧化硅纳米粒表面进行修饰。甲基丙烯酸、丙烯酰胺、(二甲基氨基) 乙基甲基丙烯酸酯为功能单体,N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂。将修饰后胶态的二氧化硅纳米粒分散到溶解有模板分子的高度稀释的功能单体溶液中,模板分子与修饰基团之间的相互作用能将模板分子限制在纳米粒表面,在单体溶液发生聚合的同时产生表面印迹位点。采用低浓度的单体溶液是为 了防止形成凝胶。通过高速离心除去未交联的功能 单体以及洗脱除去模板分子即可获得印迹聚合物纳米粒[11]。
溶菌酶价廉易得,且水溶性很好,很容易分散在含有纳米骨架材料的单体溶液中,是最常用的印迹模板分子。He等[12]以溶菌酶为模板分子,乙烯基修饰的二氧化硅纳米粒为骨架结构,以甲基丙烯酸为功能单体,以过硫酸铵为引发剂制备了溶菌酶分子表面印迹的二氧化硅纳米粒。实验证明,在纳米粒表面形成了一层聚甲基丙烯酸薄膜,在薄膜表面存在许多印迹位点。采用该印迹纳米粒与模板分子共孵 育,5 min内能达到吸附饱和,而且对溶菌酶模板分子具有明显的特异性识别能力。常用的分子印迹的功能单体大多数具有乙烯基结构,因此该文报道的印迹方法具有很高的通用性。但采用乙烯基修饰的二氧化硅纳米粒作为骨架材料最大的问题就是单体容易形成凝胶。因此,实验前需要进行大量的摸索来优化处方从而避免形成凝胶。
以二氧化硅纳米粒为骨架结构,使聚合反应在其表面发生,产生具有核壳结构的印迹聚合物纳米粒,这种核壳结构最大的优势在于能阻止模板分子进入聚合物的内部,为模板分子的洗脱提供了很大的方便,而且也能确保产生大量的表面印迹位点。Liu等[13]制备了具有这种核壳结构的免疫球蛋白结合蛋白 (BiP) 印迹二氧化硅纳米粒。高度稀释的功能单体溶液在二氧化硅表面聚合时形成了一层很薄的聚合物膜。该层聚合物膜不仅有利于模板分子的脱除而且也极大地增强了印迹位点对模板分子的结合能力。宏观结合实验表明,该印迹纳米粒具有很强的吸附能力,饱和吸附量为5.4 μg·g-1。这是传统印迹微球饱和吸附量的115倍。此外,该印迹纳米粒还能从含有数千种蛋白质的混合溶液中特异性的识别和富集BiP。因此这种核壳结构的印迹纳米粒可以用来识别和富集细胞提取物中低浓度的天然蛋白质,但这种核壳结构纳米粒的粒径通常在200 nm左右,超过了肾脏能够排出的粒子尺寸范围。如果想将其应用到生物医学领域,还要优化处方,降低核壳纳米粒的粒径从而使其能被肾脏清除或寻找可生物降解的骨架材料。
为进一步提高这种核壳结构印迹纳米粒的特异性吸附能力和饱和吸附量,Fu等[14]改进方法,对二氧化硅纳米粒分别采用3-氨丙基三甲氧基和马来酸酐进行修饰,这既能提供更多的可供聚合的双键而且也在二氧化硅纳米粒的表面引入了羧基,羧基的引入能极大提高模板蛋白质分子的结合。与原始的修饰方法相比,采用改进的方法制备的溶菌酶印迹聚合物纳米粒对溶菌酶模板分子的吸附量提高了两倍。因此,改进的修饰方法能显著提高溶菌酶分子印迹纳米粒对模板分子的吸附效果。
2 纳米线氧化铝模型法合成纳米结构单元,包括纳米线,是90年代发展起来的前沿技术,在纳米结构制备中占有极其重要的地位。氧化铝模型是含有高密度纳米柱形孔洞、厚度为几十至几百微米的阳极氧化铝膜。目前使用氧化铝模型法已合成了各种不同性质的纳米材料。合成的纳米管或纳米线的长度是由氧化铝膜厚度决定的,直径是由氧化铝膜孔洞的大小决定的。通过氧化铝模型法合成的纳米线已经在分析化学领域得到了广泛的应用。如通过氧化铝模型法合成的 金属纳米线可以用于生物标记,合成的二氧化硅纳米管可用于生物酶的固定。更为突出的工作是2002年Mitchell等[15]和2003年Inomata等[16]报道的一种全新的使用纳米管膜分离手性药物对映体的方法。利用硅烷试剂在氧化铝膜孔洞的内表面修饰一层二氧化硅膜,通过该二氧化硅膜将抗体固定在氧化铝膜孔洞的内表面,这种抗体只对4-[3-(4-fluorophenyl)·2- hydroxy-l-[1, 2, 4]n-iazol-l-yl-propyl]-benzonitrile (FTB,一种芳香化酶的抑制剂) 的RS型对映体具有亲和力。此开创性的工作为纳米管膜用于分离分析奠定了基础。
Yang等[17]首次采用氧化铝模型法进行了小分子谷氨酸印迹。印迹是在氧化铝薄膜表面的纳米级孔道中进行的,聚合反应结束后通过溶解氧化铝薄膜而得到印迹聚合物。采用此法制备的印迹纳米聚合物具有相对适宜的表面积,且对谷氨酸表现出极高的选择性和亲和性。受此启发,Li等[18]在具有纳米级孔道氧化铝薄膜表面进行了蛋白质的印迹。首先将模板蛋白质分子固定在氧化铝薄膜表面的纳米级孔道中,然后将含有丙烯酰胺 (功能单体)和N,N-亚甲基双丙烯酰胺 (交联剂) 的混合溶液加入到这些固定有模板分子的纳米级孔道中,在过硫酸铵的引发下发生聚合反应。聚合结束后,将得到的产物溶解在碱性溶液中,氧化铝薄膜随之溶解得到印迹有模板分子的纳米聚合物。该印迹纳米聚合物对模板分子表现出高的选择性和亲和性。尽管文献中并没有报道采用此印迹纳米线识别复杂生物样品中的模板分子,但此技术的开发为后续的研究提供了很大的鼓励和帮助。
聚多巴胺作为一种水溶性和生物相容性都很好的聚合物材料也常用于蛋白质分子在纳米线表面的印迹。Ouyang等[19]在模板蛋白质分子存在的情况下,通过聚合多巴胺制备了纳米线。聚合是在氧化铝表面的孔道中进行的。将环氧基引入到氧化铝表面的孔道中,蛋白质模板分子通过氨基与环氧基反应从而连接到氧化铝表面的孔道中,在过硫酸铵的存在下,使多巴胺在孔道中聚合,最后除去氧化铝和模板分子即得到了水溶性很好的聚多巴胺印迹纳米线。这种纳米线具有更好的结合能力和选择性。以人血清白蛋白为模板分子制备得到的纳米线对模板分子的饱和吸附量为25 mg·g-1。但是这种方法也存在缺点,特别是将环氧基引入到氧化铝表面的孔道中,此过程非常繁琐,很难控制,引入环氧基后存在的立体空间障碍也为聚合带来了困难。
3 碳纳米管碳纳米管 (carbon nanotubes,CNT) 是一种独特的大分子。单壁碳纳米管 (single-walled carbon nanotubes,SWCNT) 由单层石墨 (直径0.4~2 nm) 构成,而多壁碳纳米管 (multi-walled carbon nanotubes,MWCNT) 是由直径2~100 nm的多个同心石墨圆柱体组成。它们抗张强度高、质量极轻、热和化学稳定性很高,并有金属导体和半导体电学性质。生物医学材料和设备是CNT用于研究的主要领域,包括生物传感器、药物和疫苗运输载体,以及新型生物材料。CNT作为现有聚合物材料的纳米填充剂,可显著提高机械性能,并能形成高度各向异性纳米复合物。近年来,CNT用于蛋白质分子印迹偶见报道[20]。
Lee等[20]通过对碳CNT的表面进行一系列的修饰,从而确保功能单体和模板分子能在CNT的表面发生自组装形成预聚合物,使聚合反应在CNT的表面成功进行,制备了丝氨酸表面印迹的CNT。傅里叶红外及扫描电镜分析说明印迹聚合物成功地共价连接到碳纳米管的表面。宏观结合实验结果表明,印迹纳米管能选择性识别丝氨酸,而非印迹纳米管对模板分子丝氨酸只存在极小的非特异性吸附。这为生物传感器和化学传感器的制备提供了新的思路和方法。
Zhou等[21]以丙烯酰胺为功能单体、N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、过硫酸铵为引发剂、牛血清白蛋白为模板分子,使聚合反应在CNT的表面发生,制备牛血清白蛋白印迹碳纳米管。尽管该印迹纳米管的性能不是特别好,但对模板分子仍然具有5.53 mg·g-1的平衡吸附量。然而该文仅通过考察吸附能力来优化单体、交联剂和引发剂的用量是不太恰当的。吸附包括特异性吸附和非特异性吸附,在吸附能力极低的情况下,这种吸附很有可能是非特异性的,即印迹没有发挥其本身的作用。真正能够评价特异性吸附能力和识别能力的参数是印迹因子。因此,在优化制备处方时应该采用印迹因子而不单是吸附量。
通过对CNT的表面进行修饰,能提高印迹效果,主要是因为修饰基团能通过共价或非共价作用结合模板分子,从而将模板分子限制在CNT的表面,在聚合反应过程中能够产生更多的表面印迹位点。Moreira等[22]在MWCNT的表面引入羧基,以肌钙蛋白T为模板分子,使羧基与蛋白的氨基发生反应从而将模板分子连接到CNT的表面。对于CNT表面空余的缝隙则填入丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的混合液,在过硫酸铵的引发下使其发生聚合反应,反应结束后脱除模板分子即得到了肌钙蛋白T印迹的CNT。未经修饰的CNT粒径为12~13 nm,修饰后粒径为15~19 nm,尽管粒径有所增大,但并没有改变CNT本身的优良性质。实验结果表明,该印迹纳米管能从含有许多蛋白质的溶液中特异性识别并结合肌钙蛋白T。尽管羧基的引入能够提高印迹的效果,但由于模板分子与羧基是通过化学键结合,相比非共价结合,键合力更强,因此这也为模版分子的洗脱带来了一定的难度。
目前将碳纳米管用于分子印迹的报道相对较少,而且印迹策略较传统方法并没有明显改进。因此如何改变印迹手段从而提高印迹效果是碳纳米管应用于分子印迹所面临的巨大挑战。
4 磁纳米粒天然受体修饰磁纳米粒表面用来识别蛋白质在文献中已有很多的报道。但由于这些天然的受体容易受理化环境的影响而发生变性甚至降解,因此,寻找新的解决方法成为了研究热点。鉴于印迹纳米粒具有模拟天然受体的作用,许多的科研工作者都已将目光转向分子印迹。磁纳米粒作为分子印迹的骨架材 料,最大的优势在于可以通过外加磁场达到分离纯化的目的,从而大大缩短制备的时间。
由于具有良好的生物相容性、较高的磁化率和 低毒性,而且制备过程中粒径容易控制,Fe3O4纳米粒成为了分子印迹中最常用的磁性材料。Zhou等[23]以3-硼酸酯为功能单体和交联剂、过硫酸铵为引发剂和人免疫球蛋白G为模板分子,使其在硅酸盐修饰的Fe3O4纳米粒表面发生聚合反应,反应结束后在磁纳米粒的表面形成聚合物薄膜,洗脱除去模板分子后即可获得人免疫球蛋白G印迹的磁纳米粒。由于采用的模板分子与HIV-1抗体具有相同的Fc片段,因此制备的人免疫球蛋白G印迹的纳米粒同样能识别和检测HIV-1抗体。与常规的HIV-1检测手段相比,采用印迹磁纳米粒进行检测不仅明显降低了检测成本而且极大的提高了检测灵敏度。
此外,Zhou等[23]还制备了人血红蛋白印迹的Fe3O4纳米粒,将该纳米粒加入到含有血红蛋白溶液中,孵育一段时间后,通过外加磁场分离纯化出印迹纳米粒。由于印迹纳米粒上已吸附了血红蛋白,可以通过加入血红蛋白特异性的检测探针从而得出原溶液中血红蛋白的浓度。采用此法检测血红蛋白不仅快速简便,而且具有极低的检测限 (2.23 pg·mL-1)。分子印迹磁纳米粒最大的用处在于分析领域,可以通过外加磁场分离得到印迹纳米粒,因此能有效节省样品的分析时间。
选择具有生物相容性的聚合物单体是制备磁纳米粒前必须考虑的问题。传统的功能单体如丙烯酰胺和甲基丙烯酸都可以用于聚合物薄膜的制备,丙烯酰胺水溶性很好且能提供大量的氢键,甲基丙烯酸能通过静电作用吸附模板分子。然而0.4% 是单体溶液发生聚合反应的极限浓度,否则很容易出现一个印迹聚合物粒子中含有多个磁纳米粒,不仅会增大粒径也使粒径的分布变得不均匀。Jing等[24]以丙烯酰胺为功能单体、N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、过硫酸铵为引发剂以及溶菌酶分子为模板分子,在硅酸盐修饰的Fe3O4纳米粒表面发生聚合反应,反应结束后去除模板分子即得到了溶菌酶分子印迹的磁性纳米粒,该印迹纳米粒对溶菌酶分子具有很高的吸附能力 (0.11 mg·mg-1)。此外,通过对印迹磁纳米粒进行分离纯化,并采用荧光技术,该印记纳米粒还可以用来检测血浆中溶菌酶的含量。
5 蛋白质分子印迹的应用前景分子印迹技术发展至今已取得长足进步,尤其是小分子化合物印迹技术发展成熟,有些已实现了商品化。然而,从近年来对蛋白质印迹材料的研究报道中不难发现,由于蛋白质自身性质复杂,相关研究相对滞后,多数材料的应用价值仅局限于分析化学和生物化学领域,鲜有研究者致力于挖掘其在更多领域的潜能。
Cutivet等[25]首次将分子印迹技术引入酶抑制剂的研究。酶的激动和抑制是调控代谢反应和生物过程的重要手段。一些通过化学法合成得到的小分子酶抑制剂对靶点缺乏足够的亲和性和选择性,往往导致副作用[26]。研究人员将胰蛋白酶抑制剂4-氨基苯甲脒与单体甲基丙烯酸偶联得到新化合物,该化合物在印迹材料的聚合中可充当模板胰蛋白酶强大的锚定位点。实验表明,分子印迹材料对胰蛋白酶的抑制作用明显超出小分子抑制剂苯甲脒。可见,制备以酶为模板的分子印迹材料,为酶抑制剂类药物的设计提供了新思路。
Shea的研究小组[27]制备了Mel印迹纳米粒,并首次将其作为解毒剂运用于体内,取得了突破性的进展。体外研究表明,该材料在粒径、对模板的亲和力和选择性方面都堪比天然抗体。小鼠体内实验发现,印迹纳米粒经尾静脉注射后可与Mel结合,在进入肝脏后被巨噬细胞摄取,起到解毒的功效。小鼠生存曲线表明,注射了印迹纳米粒的小鼠存活率远高于其对照组。且细胞实验和组织病理学切片证明材料无明显毒性和免疫原性。
6 结论综上所述,二氧化硅纳米粒、纳米线、碳纳米管和磁纳米粒是目前常用的蛋白质分子印迹纳米骨架材料,聚合反应可在这些骨架材料的表面发生,形成印迹聚合物膜。尽管文献中报道的这些印迹聚合物薄膜都对模板分子有很好的选择性和结合能力,但是由于这些聚合物的形成都是通过自由基引发交联聚合,自由基的产生是否会改变模板蛋白质分子的空间构象甚至使其变性失活从而降低印迹聚合物的特异性吸附能力都还存在诸多质疑。再者,文献中报道的模板分子洗脱方式都过于繁琐,如何快速简便的洗脱模板以及确保模板分子的可重复利用还有待进一步研究。
新型纳米骨架材料的出现将为蛋白质分子印迹提供更为广阔的应用前景。由于分子印迹材料与模板蛋白的结合非常类似于抗原-抗体或配体-受体的结合,且具有更好的物理和化学稳定性。一旦发展成熟,可利用其特异性识别功能作为“人工抗体”或“人工受体”运用于新型药物靶向传释系统,取代蛋白或多肽类靶向头基,在体内与对应的靶点发生特异性结合,实现药物的主动靶向传递。此外,印迹骨架材料作为一个核心也为载药提供了希望,这也是目前研究的一个方向。
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