虎杖 (Rhizoma polygoni cuspidati) 系蓼科植物虎杖 (Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.) 的干燥根茎和根。中医认为,虎杖具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰的功效。可用于治疗关节痹痛、湿热黄疸、经闭、水火烫伤、跌扑损伤和痈肿疮毒等。虎杖的主要成分是蒽醌及蒽醌苷,还含有二苯乙烯类化合物,如虎杖苷 (polydatin)、白黎芦醇 (resveratrol) 等,其中虎杖苷含量较高,中国药典 (2010年版一部) 以虎杖苷作为虎杖药材的质量控制指标。虎杖是中医临床常用的抗高尿酸血症中药^[1]。现代药理也证实虎杖具有明显的抗高尿酸作用^{[2, 3, 4, 5]}。本实验主要对虎杖苷的降尿酸作用进行初步研究。

ICR小鼠,SPF级,雄性,体重18～20 g,由上海斯莱克科学实验动物中心提供,实验动物许可证号: SCXK (沪) 2007-0005。实验前在本实验室适应性喂养1周。在整个实验过程中自由饮水和标准颗粒饲料喂养。

虎杖苷 (批号: 20130215,含量98%),氧嗪酸钾盐 (批号: SF0328GDB) (上海源叶生物科技有限公司); 苯溴马隆片 (批号: 130213,昆山龙灯瑞迪制药有限公司)。氧嗪酸钾盐注射液的配制: 200 mL 0.8% CMCNa溶液中加入氧嗪酸钾盐2 g,配制成质量浓度为10 g·L^-1氧嗪酸钾盐注射液。Trizol (Invitrogen公司); 荧光定量检测试剂盒、DNA Marker、M-MLV反转录试剂盒 (大连宝生物工程有限公司); 引物合成在上海Invitrogen公司完成; 其他化学试剂均为国产分析纯。

Screen Master 3000型半自动生化分析仪 (Italy)。定量PCR、梯度PCR仪 (Takata公司); 引物合成及测序在上海Invitrogen公司完成。

采用ICR雄性小鼠60只随机分为6组,分别为虎杖苷3个剂量组 (5、10、20 mg·kg^-1)、阳性对照组 (苯溴马隆,16.7 mg·kg^-1)、模型组和正常组,每组10只。虎杖苷和苯溴马隆各组药物均用0.8% CMC-Na配制成相应浓度,正常组和模型组灌胃 (ig) 等体积0.8% CMC-Na溶液 (0.02 mL·g^-1)。参考文献^{[2, 6]},连续给药7天,每 天1次,最后1次于造模1 h后给药。采用氧嗪酸钾盐按250 mg·kg^-1剂量腹腔注射 (ip) 各实验组和模型组的小鼠造模,正常组则ip等体积0.8% CMC-Na溶液。各实验用药1 h后从小鼠眼眶后静脉丛进行采血,在4 000 r·min^-1条件下离心5 min取血清100 μL,采用半自动生化仪测定血清尿酸 (UA)。

小鼠处死后快速获取肾组织于无菌冻存管中,转入液氮保存,隔日取液氮保存的小鼠肾脏组织,切取约50 mg于无菌1.5 mL离心管中,加入4 ℃预冷的dPBS 1 mL洗组织两次,转移组织到新的1.5 mL离心管,每管加入Trizol 1 mL,匀浆,充分裂解组织,酚氯仿法提取组织Total RNA,取1 μg RNA反转录制备cDNA,使用随机反转录引物Random Primer,然后取1 μL反转录产物进行PCR检测,实验使用Beta actin (NM_007393.3) 作为参照基因。引物序列: Beta actin-forward primer,5'-CCTAA GGCCAACCGTGAAAAGATG-3',Beta actin-reverse primer 5'-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3',PCR产物长度为219 bp; OAT1 (NM_008766.3) 引物,OAT1- forward primer,5'-CTTTCCCGCACAATGGCACAGA GG-3',OAT1-reverse primer 5'-GTCCGCCAGGTAGC CAAACATCAT-3',PCR产物长度为209 bp; OAT3 (NM_031194.5) 引物OAT3-forward primer,5'-CCAA ACGCCAGTCTTCCCAATGA-3',OAT3-reverse primer 5'-TGCGGCCAAACCTGTCTGA-3',PCR产物长度为211 bp; URAT1 (NM_009203.3) 引物,URAT1-forward primer,5'-TTCATGCCCACCTTCCCCCTCTAC-3',URAT1-reverse primer 5'-CATCCTCCAGCTGCGCAC ACCATA-3',PCR产物长度为207 bp。PCR的反应总体系为20 μL: Takara SYBR Premix Ex Tap 10 μL,上下游引物 (20 μmol·L^-1) 各0.2 μL,cDNA 2 μL,dH₂O补足反应体系至20 μL。反应条件: 95 ℃,5 min; 60 ℃,20 min; 72 ℃,20 min,共40个循环。通过Ct值进行数据分析,确定MEG3相对含量,通过ΔCt进行计算,目的基因相对于内参基因的表达量为2ΔCt = 2Ctm - Ctn。

实验数据采用SPSS 13.0统计软件。多组计量资料组间比较采用方差分析,等级资料采用Ridit检验,P < 0.05具有统计学意义。

造模组与正常组相比血尿酸水平明显增高 (P < 0.01)。与模型组比较,虎杖苷的低、中、高剂量组 和苯溴马隆组对血清尿酸水平均有显著的抑制作用 (P < 0.05,P < 0.01)。见表 1。

表 1(Table 1)

Table 1 Effect of polydatin in hyperuricemic mice induced by potassium oxonate (n = 10,± s). △△P < 0.01 vs normal group; P < 0.05,**P < 0.01 vs model group Group Dose/mg·kg-1 Serum uric acid/mg·L-1 Normal - 34.19 ± 4.95 Model - 46.69 ± 8.52△△ Polydatin 5 40.29 ± 5.13 10 38.24 ± 5.75 20 37.29 ± 6.64 Benzbromarone 26 34.47 ± 5.86**

Table 1 Effect of polydatin in hyperuricemic mice induced by potassium oxonate (n = 10,± s). △△P < 0.01 vs normal group; P < 0.05,**P < 0.01 vs model group

以Ct值分析URAT1、OAT1和OAT3的相对含量,Beta actin作为参照基因。数据分析 (图 1) 显示,与正常组比较,模型组小鼠肾脏组织中URAT1基因相对含量明显上升(P < 0.01),而虎杖苷明显抑制URAT1上升的趋势,其中高剂量组与模型组比较有显著差异 (P < 0.01),虎杖苷抑制URAT1上升具有明显的浓度依赖性; 与正常组比较,模型组小鼠肾脏组织中OAT1和OAT3基因相对含量则明显降低 (P < 0.01),而虎杖苷可以明显抑制OAT1和OAT3降低的趋势,其中高剂量和中剂量组与模型组比较具有统计学差异 (P < 0.05),虎杖苷抑制OAT1和OAT3上升也具 有明显的浓度依赖性; 阳性药苯溴马隆对基因含量的影响与虎杖苷具有相同的趋势。

Figure 1 Effects of polydatin (5,10,20 mg·kg-1) on the mRNA levels of renal mURATl,mOATl and mOAT3 in hyperuricemic mice induced by potassium oxonate. URAT1: Urate anion transporter 1; OAT1: Organic anion transporter 1; OAT3: Organic anion transporter 3. n = 10,± s. △△P < 0.01 vs normal group; P < 0.05,**P < 0.01 vs model group

尿酸是核酸基嘌呤分解代谢的最终产物,有内源性、外源性之分。内源性嘌呤在体内代谢受次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、黄嘌呤转化酶和磷酸核糖焦磷酸酰胺转换酶等调节而代谢成尿酸。外源性 是食物中的嘌呤在体内代谢成尿酸。尿酸主要由肾脏排出。若体内产生尿酸过多或由肾 (尿液) 排出过少,则引起血尿酸升高而形成高尿酸血症。高尿酸血症是由于嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少引起的细胞外液尿酸盐超饱和状态,是一种极具隐匿性的危害人类健康的代谢性疾病。血清尿酸水平不仅与痛风直接相关,近期研究发现高尿酸血症常与传统的代谢性心血管危险因素,如高血压、高脂血症、糖尿病、肥胖及胰岛素抵抗等伴发,是心血管疾病的独立危险因素^{[7, 8]}。本实验中采用氧嗪酸钾盐造成小鼠高尿酸血症模型,其高尿酸血症模型组小鼠的尿酸水平显著地高于正常组小鼠的血清尿酸水平,表明本实验造模成功。

本实验研究结果表明,虎杖苷能显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平,其低 (5 mg·kg^-1)、中(10 mg·kg^-1)、高 (20 mg·kg^-1) 3剂量均能显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平。经统计分析,虎杖苷的降尿酸作用在5～20 mg·kg^-1内没有明显的量效关系,可能是虎杖苷的降尿酸作用机制具有多靶点、多途径的特点,在不同的剂量下,虎杖苷降尿酸的作用侧重或优先于某一途径,因此不能表现明显的量效关系。为此需要进一步的研究。

在生理情况下,尿酸由肾小球滤过、肾小管重吸收和分泌,从而维持人体正常的尿酸水平,引发高尿酸血症的重要原因之一是尿酸排泄减少。负责尿酸在肾脏中转运的是肾小管上皮细胞刷状缘侧 (管腔膜) 和基底外侧膜上固定的一些有机阴离子转运蛋白 (URAT1、OAT1和OAT3等),这些转运蛋白具有广泛的底物专属性,与体内许多代谢产物和大部分药物的排泄密切相关^{[8, 9]}。这些转运蛋白对尿酸浓度的调控作用,使其成为高尿酸血症药物治疗的重要靶点。尿酸在肾小管的重吸收和分泌是由不同的转运 蛋白完成的,其中表达在刷状缘侧膜的尿酸-有机阴离子交换蛋白 (URAT1) 负责尿酸的重吸收,而表达在基底侧膜的有机阴离子转运蛋白 (OAT1、OAT3) 则负责尿酸的分泌。因此,URAT1、OAT1和OAT3的基因含量变化,可以反映高尿酸血症的发展程度。本实验中,使用实时定量的方法分别检测3组基因相对含量,结果显示,与正常组相比,模型组小鼠肾脏组织中URAT1基因相对含量明显上升,而虎杖苷具有明显抑制URAT1上升的趋势; OAT1和OAT3基因则降低趋势明显,虎杖苷可以明显抑制二者基因的下降趋势。结果表明,虎杖苷可抑制尿酸重吸收的转运蛋白URAT1的mRNA表达,增加尿酸分泌转运蛋白OAT1、OAT3的mRNA表达,从而增强肾脏对尿酸的排泄作用。这也从基因水平说明虎杖苷对高尿酸血症具有良好的疗效。