药学学报  2014, Vol. 49 Issue (12): 1724-1729   PDF    
白木香倍半萜合酶基因AsSS4的克隆、原核表达与功能鉴定
梁良1,2, 郭庆梅3, 张争1,4 , 徐艳红1, 韩晓敏, 刘娟1    
1. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193;
2. 聊城市人民医院, 山东 聊城 252000;
3. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 250012;
4. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所海南分所 (海南省南药资源保护与开发重点实验室), 海南 万宁 571533;
5. 燕山大学环境与化学工程学院, 河北 秦皇岛 066004
摘要:通过RT-PCR方法从伤害处理的白木香树木质部中克隆得到沉香倍半萜合酶4 (sesquiterpene synthase 4, AsSS4) 基因的全长开放读码框, 该基因全长读码框为1 698 bp, 编码包含565个氨基酸的蛋白质.将AsSS4基因与原核表达载体pET28a相连构建重组载体pET28a-AsSS4, 把重组载体转入大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS中, 用IPTG诱导重组菌, 经SDS-PAGE电泳分析, 获得分子质量约为64 kD的重组AsSS4蛋白.利用镍凝胶亲和色谱法获得纯度较高的AsSS4蛋白, 以法尼基焦磷酸 (FPP) 为底物进行蛋白酶促反应, 共催化产生5种倍半萜类成分: cyclohexane, 1-ethenyl-1-methyl-2, 4-bis(1-methylethenyl)-、β-elemene、α-guaiene、α-caryophyllene和δ-guaiene.本研究首次证实了白木香倍半萜合酶AsSS4基因的功能, 为揭示伤害诱导沉香倍半萜形成的分子机制奠定了理论基础.
关键词白木香     倍半萜合酶基因     原核表达     基因功能    
Cloning, prokaryotic expression, and functional identification of a sesquiterpene synthase gene (AsSS4) from Aquilaria sinensis
LIANG Liang1,2, GUO Qing-mei3 , ZHANG Zheng1,4, XU Yan-hong1, HAN Xiao-min, LIU Juan1    
1. Instituent of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China;
2. Liaocheng City People's Hospital, Liaocheng 252000, China;
3. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250012, China;
4. Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Hainan Provincial Key Laboratory of Resource Conservation and Development of Southern Medicine, Wanning 571533, China;
5. School of Environmental and Chemical Engineering, Yan Shan University, Qinhuangdao 066004, China
Abstract: A sesquiterpene synthase (AsSS4) full-length open reading frame (ORF) cDNA was cloned from wounded stems of Aquilaria sinensis by RT-PCR method. The result showed that the ORF of AsSS4 was 1 698 bp encoding 565 amino acids. Prokaryotic expression vector pET28a-AsSS4 was constructed and transformed into E. coli BL21 (DE3) pLysS. Recombinant AsSS4 protein was obtained after induction by IPTG and SDS-PAGE analysis with a MW of 64 kD. Enzymatic reactions using farnesyl pyrophosphate showed that recombinant AsSS4 protein purified by Ni-agarose gel yielded five sesquiterpene compounds, cyclohexane, 1-ethenyl-1-methyl-2, 4-bis(1-methylethenyl)-, β-elemene, α-guaiene, α-caryophyllene and δ-guaiene. This paper reported the first cloning and functional characterization of AsSS4 gene from A. sinensis, which will establish a foundation for future studies on the molecular mechanisms of wound-induce agarwood formation in A. sinensis.
Key words: Aquilaria sinensis     sesquiterpene synthase gene     prokaryotic expression     gene function    

沉香属植物白木香 [Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg] 为我国特有的珍稀濒危植物,是国产名贵药材沉香的唯一正品植物来源[1],现已被列入了《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES) 附录II[2]。然而,白木香树只有受到外界伤害后才能形成沉香类物质[3],其伤害诱导沉香形成的分子机制一直未得到清晰揭示,从而严重制约了高效结香技术的建立。由于倍半萜类物质是沉香药材的最主要成分之一[4, 5, 6],因此解析沉香倍半萜的生物合成途径是揭示沉香形成机制的分子基础[7]。倍半萜合酶 (sesquiterpene synthase) 是倍半萜合成途径中的关键酶,催化前体底物法呢基焦磷酸 (farnesyl diphosphate,FPP) 形成倍半萜[7]。目前已有超过30种植物中的各种萜烯挥发物合成酶基因被克隆出来,并有研究证明过量表达倍半萜合酶基因的转基因植株能够合成积累较多的倍半萜[8, 9, 10, 11]。吴宏清等[12]从白木香中克隆了可能编码大根香叶烯- D合成酶的基因As-SesTPS,但是未验证该基因的功能。本文从白木香中克隆了一个倍半萜合成酶基因,并验证了该基因编码蛋白是否能够体外催化合成倍半萜的功能,以期揭示白木香产沉香倍半萜的机制。

材料与方法 材料

中国医学科学院药用植物研究所温室栽培的3年生白木香A. sinensis用于提取总RNA,菌株和载体植物表达载体pBI121、大肠杆菌 (Escherichia coli) 由本实验室保存。

试剂

M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、2.5 mmol·L-1 dNTP、T4 DNA Ligase (3 U·µL-1)、10×T4 DNA Ligation Buffer、DNA marker、DNA A-Tailing Kit试剂盒购于宝生 物工程 (大连) 有限公司; Total RNA Purification Kit购于美国LC Sciences公司; Pfu Ultra ⅡFusion HS DNA Polymerase Buffer、Pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DNA Polymeras购于美国Agilent Technologies公司; 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、β-半乳糖苷酶 (X-Gal)、法尼基焦磷酸 (FPP)、二硫苏糖醇 (DTT) 购于Sigma公司; BLOWEST AGAROSE G-10购于BLOWEST公司; 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根生化科技 (北京) 有限公司; SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、考阿斯亮蓝G-250购于康为世纪公司; 其他试剂均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。

仪器

Nano-Drop 2000核酸/蛋白定量仪 (Thermo Scientific,Wilmington,DE)、荧光定量PCR仪 (Bio- rad)、台式高速离心机 (Eppendorf)、凝胶成像系统 (Bio-Rad)、小型垂直电泳槽Mini-PROTEAN Tetra System (Bio-Rad)、Power RacTM Basic (Bio-Rad)、Profinia Protein Purification System纯化系统 (Bio-Rad)、气相色谱仪Agilent 7890A GC system (Agilent)、气质联用仪Varian 450GC-300MS (Varian)、萃取头 (Supecl,PDMS/DVB/CAR,美国) 及萃取瓶 (Supecl,7 mL,美国)。

白木香总RNA的提取及cDNA第一条链的合成

酒精灯火焰灭菌枝剪,待冷却后全断杆伤害处理12 h,取全断杆横切面下1 cm厚的茎,剥去树皮后立即用液氮冷冻,存于 -80 ℃备用。依照LC Sciences公司的Total RNA Purification Kit试剂盒方法提取 白木香总RNA。用1% 琼脂糖凝胶电泳检测,分光光度计NanoDrop ND 2000C检测RNA的A260/A280在1.94~2.12之间。以白木香总RNA为模板,参照M- MLV RTase cDNA Synthesis Kit (TaKaRa) 说明书的方法合成cDNA的第一条链。

目的片段的克隆

根据白木香高通量测序结果和已报道的倍半萜合酶基因,运用DNAMAN和Primer 5.0软件设计特异引物如下: AsSS4F: 5'-GGATCCAT GTCTTCGGCAAAACTAGGTTCT-3'; AsSS4R: 5'-CT CGAGTCAGAT TTCAATAGCATGACGCAAC-3'。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。以反转录产物cDNA为模板,进行PCR扩增。反应体系如下: cDNA 3 µL、2.5 mmol·L-1 dNTP 1 µL、Pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DNA Polymerase 1 µL、Pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DNA Polymerase Buffer 5 µL、引物AsSS4F 1 µL、引物AsSS4R 1 µL、dd H2O 38 µL。根据引物合成的退火温度,设置了Touch-down PCR程序,保证得到较好的扩增效果。PCR程序: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 1 min (变性),69 ℃ 1 min (退火,每个循环降1 ℃),72 ℃ 2 min (延伸) 共16个循环; 95 ℃ 1 min,54 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,共35个循环; 72 ℃ 10 min。4 ℃保存。PCR产物在1% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测,纯化PCR产物。由于PCR中高保真酶Pfu酶扩增片段不带A末端,应使用平末端连接试剂盒先加A末端后再与pGM-T载体连接,经热激法转化到大肠杆菌TOP 10中,用蓝白斑筛选重组子,挑选阳性克隆的单菌落37 ℃培养,经菌液PCR验证后选择 (2个以上) 扩增出与目的片段一致的条带送上海英俊生物技术公司 (北京测序部) 进行测序。

白木香倍半萜合酶基因AsSS4原核表达载体的构建

通过Primer 5.0和DNAMAN序列分析软件,筛选出pGM-T-AsSS4质粒和pET-28a质粒上均具有的酶切位点BamH I和Xho I,将pGM-T-AsSS4质粒和pET-28a质粒分别双酶切,双酶切体系如下: pGM-T- AsSS4质粒或pET-28a质粒30 µL、10×K Buffer 10 µL、Xho I 5 µL、BamH I 5 µL、ddH2O 50 µL混匀后,37 ℃酶切8 h。酶切产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测并回收。取2 µL回收产物检测产物浓度 (Nano-Drop 2000核酸/蛋白定量仪),并根据浓度设计连接体系如下: pET-28a载体2 µL、AsSS4目的片段6 µL、10×T4 DNA Ligase Buffer (TaKaRa,Japan) 1 µL、T4 DNA Ligase (TaKaRa,Japan) 1 µL,混匀后置16 ℃连接过夜。取 5 µL连接产物转化到E.coli TOP 10感受态细胞中。挑取单菌落到5 mL LB (50 µg·mL-1 Ampr) 液体培养基,置于37 ℃摇床200 r·min-1振摇过夜。参照方法2,对菌液进行PCR检测,PCR扩增产物在1% 琼脂糖凝胶电泳检测。阳性菌液送上海英潍捷基公司测序验证。

重组蛋白的诱导表达、纯化

将构建好的原核表达载体转化宿主菌感受态细胞 (BL21 (DE3) pLysS),菌液PCR验证选择阳性克隆。在含相应抗生素 (氨苄青霉素Ampr和卡那霉素Kanr终浓度均为50 µg·mL-1) 的2 mL LB培养基中,37 ℃摇培至12 h,再按照1∶20比例稀释,取10 mL培养物接种到500 mL相同的培养基中,在37 ℃ 250 r·min-1培养基中震荡培养4 h至OD600为0.5~0.6,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG) 至终浓度0.5 mmol·L-1,16 ℃ 200 r·min-1恒温振荡诱导培养22 h,4 ℃ 5 000 r·min-1离心10 min收集菌体[13]。将菌体重悬于预冷磷酸盐缓冲液 (PBS溶液) (150 mmol·L-1 NaCl、16 mmol·L-1 Na2HPO4、4 mmol·L-1 NaH2PO4,pH 7.3) 中,彻底重悬菌体,超声波充分破碎菌体 (冰上操作,400 W,超声2 s,暂停4 s,工作时间20 min),4 ℃ 5 000 r·min-1离心10 min,所得上清液加入上样缓冲液,于沸水中煮5 min,用10% 分离胶和5% 浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE 电泳,考马斯亮蓝G-250快速染色,进行SDS-PAGE检测分析。蛋白纯化时,用1 L三角瓶摇培500 mL菌液,5 000 r·min-1离心10 min,弃上清液。然后用 1.6 mL 1×PBS缓冲液重悬菌体,反复冻融4次,12 000 r·min-1离心15 min,取全部上清液。使用Bio-Rad的Profinia Protein Purification System蛋白纯化系统,使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱 (Bio-Rad) 纯化经IPTG诱导表达的总蛋白溶液,得到纯化的白木香倍半萜合酶融合蛋白。使用His-Taq柱进行纯化,可以有效的分离目的融合蛋白,消除总蛋白中其他蛋白对后续酶促反应可能产生的影响。纯化的蛋白用SDS-PAGE分析,进行蛋白酶促反应检测其活性。

原核表达蛋白酶促反应

酶促反应体系如下: 总体系为200 µL,含有Tris-HCl buffer (25 mmol·L-1,pH 7.0)、10% 甘油、100 mmol·L-1 MgSO4、5 mmol·L-1 DTT、46 µmol·L-1 FPP和50 µL蛋白纯化产物 (浓 度0.34 g·L-1)[14]。加入7 mL萃取瓶混匀后,在30 ℃水浴中温育1 h。应用固相微萃取SPME吸附挥发物质,萃取头预饱和0.5 h,然后吸附0.5 h。分别以水 和空载体菌液提取的蛋白代替AsSS4蛋白,其他组成不变,作为对照组,采用气质联用仪 (GC-MS) 对催化产物进行检测。产物使用美国Varian 450气相与Varian 300质谱联用仪进行分析,色谱柱选用30 m × 0.25 mm × 0.25 µm VF-5MS石英毛细管柱。GC-MS条件[14]: 电离方式EI,电子能量70 eV,载气为氦气,流速为1 mL·min-1,进样口温度250 ℃,起始温度为80 ℃,以5 ℃·min-1升至220 ℃,保持10 min,再以10 ℃·min-1升至240 ℃,保持3 min。扫描质量范围30~500 amu。

结果 1 白木香倍半萜合酶基因AsSS4原核表达载体的构建

按照试剂盒说明书提取白木香总RNA,用1% 的琼脂糖凝胶检测,结果表明RNA样品呈现3条分别为28S、18S和5S的清晰条带 (图 1)。检测所有样品RNA的A260/A280在1.94~2.12之间,表明RNA样品质量和完整性较好,可以用于下一步cDNA的合成。

Figure 1 Total RNA of A. sinensis. M: DL2000 DNA marker; 1: Total RNA of A.sinensis

通过反转录合成单链cDNA,然后以cDNA为模板,以AsSS4F和AsSS4R为引物,用高保真酶扩增出 白木香AsSS4基因的ORF约1 700 bp,扩增出的条带与预期一致,且条带清晰特异性较好 (图 2)。设计引物将酶切位点BamH I和Xho I引入到AsSS4的两端,并构建到pGM-T克隆载体上,得到阳性克隆pGM-T-AsSS4质粒 (图 3)。

Figure 2 Agrose gel electrophoresis analysis of RT-PCR amplification of AsSS4. M: DL2000 DNA marker; 1: PCR products of AsSS4 ORF

Figure 3 Identification of recombinant plasmid pGM-T-AsSS4. M: DL5000; 1: Positive clones identification for the ligation of AsSS4 to pGM-T-vector by PCR

阳性克隆质粒进行BamH I和Xho I双酶切 (图 4)。将酶切下来的目标条带,连接同样酶切的pET-28a (+)。菌液PCR验证 (图 5),重组质粒双酶切验证 (图 6)。

Figure 4 Detection of double restriction enzyme digestion of plasmid pGM-T-AsSS4

Figure 5 Detection of PCR. M: DL5000; 1: Positive clones identification for the ligation ofAsSS4 to pET-28a by PCR

Figure 6 Detection of double restriction enzyme (BamH I and Xho I) digestion of plasmid pET-28a-AsSS4. M: DL8000; 1: pET-28a-AsSS4 enzyme digestion products
2 蛋白表达及纯化结果

AsSS4编码565个氨基酸,理论分子质量为64 kD。首先采用了pET-28a载体构建原核表达载体,采用IPTG为诱导物进行了诱导。SDS-PAGE分析显示,以E.coli BL21 (DE3) pLysS为宿主菌,0.5 mmol·L-1 IPTG,16 ℃、200 r·min-1振摇诱导22 h为条件,在64 kD附近位置出现了特异蛋白带 (图 6),特异蛋白带大小符合预期。未经诱导的含有重组质粒pET-28a- AsSS4的菌株不表达该蛋白。说明原核表达载体pET- 28a-AsSS4构建成功,并通过IPTG诱导成功表达。

以同样条件大量诱导后,使用Bio-Rad的Profinia Protein Purification System蛋白纯化系统,应用Ni- Agarose His标签蛋白纯化柱 (Bio-Rad) 纯化经IPTG诱导表达的总蛋白溶液,得到纯化的白木香倍半萜合酶AsSS4融合蛋白。SDS-PAGE电泳检测分析得到了符合预期大小的特异蛋白带 (图 7)。

Figure 7 Induced expression product of pET-28a-AsSS4. M: Marker; 1: pET-28a vector; 2: Expression without IPTG-induced; 3-5: Induced expression by IPTG; 6,7: Purified protein
3 蛋白酶促反应产物分析

结果显示,催化产物主要有5种化学物质,经 与标准品对比,分别确定为cyclohexane,1-ethenyl-1- methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-、β-榄香烯 (β-ele­mene)、α-愈创木烯 (α-guaiene)、α-石竹烯 (α-caryo­ phyllene)、δ-愈创木烯 (δ-guaiene),其中β-榄香烯、α-愈创木烯、δ-愈创木烯为催化产物的主产物。

讨论

为揭示伤害诱导沉香属植物产生沉香的分子机制,日本学者已证实将水杨酸和茉莉酸甲酯加至沉香属植物悬浮细胞中能够诱导产生沉香倍半萜前体物α-愈创木烯、α-蛇麻烯和δ-愈创木烯[13]。随后成功从茉莉酸甲酯处理的越南沉香cDNA文库中筛选鉴定并验证4个倍半萜合酶能够催化合成这3种倍 半萜[14]。Southern Blot结果显示,在越南沉香基因组中可能存在着更多的沉香倍半萜合酶基因,但是迄今为止沉香属植物基因组未见报道,沉香倍半萜合酶基因及其数量未能揭示[15]

本研究根据高通量测序结果和已报道的倍半 萜合酶基因[16],设计特异性引物,克隆得到全长为 1 698 bp倍半萜合酶基因AsSS4,并且在大肠杆菌中异源表达,获得分子质量约为64 kD的重组AsSS4蛋白。利用镍凝胶亲和色谱法获得纯度较高的AsSS4蛋白,以法尼基焦磷酸 (FPP) 为底物进行蛋白酶促反应,共催化产生5种倍半萜类成分。本研究首次 证实了白木香倍半萜合酶AsSS4基因的功能,为揭示伤害诱导沉香倍半萜形成的分子机制奠定了理论基础。目前本课题组已成功构建了植物高效表达载体pBI121-AsSS4,并通过农杆菌LBA4404介导的浸花法转化到拟南芥,获得了卡那霉素抗性的转基因拟南芥,以期揭示该基因在异源植物中的表达特性。

参考文献
[1] Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China (中华人民共和国药典: 第一部) [S]. Vol 1. Beijing: China Medical Science Press, 2010: 172.
[2] CITES. Amendments to Appendix I and II of CITES [C]. In Proceedings of Thirteenth Meeting of the Conference of the Parties, Bangkok, Thailand, 2004: 2-14.
[3] Xu YH, Zhang Z, Wang MX, et al. Identification of genes related to agarwood formation: transcriptome analysis of healthy and wounded tissues of Aquilaria sinensis [J]. BMC Genomics, 2013, 14: 227.
[4] Chen HQ, Wei JH, Yang JS, et al. Chemical constituents of agarwood originating from the endemic genus Aquilaria plants [J]. Chem Biodiv, 2012, 9: 236-250.
[5] Chen HQ, Yang Y, Xue J, et al. Comparison of compositions and antimicrobial activities of essential oils from chemically stimulated agarwood, wild agarwood and healthy Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg trees [J]. Molecules, 2011, 16: 4884- 4896.
[6] Yang JS. Chemical constituents of Aquilaria overview [J]. Nat Prod Res Dev (天然产物研究与发), 1998, 10: 99-103.
[7] Xu YH, Yang X, Zhang Z, et al. Cloning and expression analysis of HMG-CoA reductase from Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg. [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48: 953-959.
[8] Nagegowda DA. Plant volatile terpenoid metabolism: biosynthetic genes, transcriptional regulation and subcellular compartmentation [J]. FEBS Lett, 2010, 584: 2965-2973.
[9] Facchini PJ, Chappell J. Gene family for an elicitor-induced sesquiterpene cyclase in Tobacco [J]. Proc Nat Acad Sci USA, 1992, 89: 11088-11092.
[10] Sallaud C, Rontein D, Onillon S, et al. A novel pathway for sesquiterpene biosynthesis from Z, Z-farnesyl pyrophosphate in the wild tomato Solanum habrochaites [J]. Plant Cell, 2009, 21: 301-317.
[11] Degenhardt J, Kollner TG, Gershenzon J. Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin of terpene skeletal diversity in plants [J]. Phytochemistry, 2009, 70: 1621-1637.
[12] Wu HQ, Wang L, He X, et al. Cloning of sesquiterpene synthase gene As-SesTPS from Aquilaria sinensis and analysis its bioinformatics and expression [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2014, 45: 94-101.
[13] Kumeta Y, Ito M. Genomic organization of δ-guaiene synthase genes in Aquilaria crassna and its possible use for the identification of Aquilaria species [J]. J Nat Med, 2011, 65: 508-513.
[14] Kumeta Y, Ito M. Characterization of δ-guaiene synthases from cultured cells of Aquilaria, responsible for the formation of the sesquiterpenes in agarwood [J]. Plant Physiol, 2010, 154: 1998-2007.
[15] Zhang Z, Gao ZH, Wei JH, et al. The mechanical wound transcriptome of three-year-old Aquilaria sinensis [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2012, 47: 1106.
[16] Gao ZH, Wei JH, Yang Y, et al. Selection and validation of reference genes for studying stress-related agarwood formation of Aquilaria sinensis [J]. Plant Cell Rep, 2012, 31: 1759.