药学学报  2014, Vol. 49 Issue (12): 1718-1723   PDF    
具有穿膜功能的嵌合型AVPI-低分子量鱼精蛋白/DNA共给药系统的抗肿瘤研究
谭娇1,2, 王雅萍2, 王慧欣2, 梁剑铭2, 张梦2, 孙逊1 , 黄永焯2     
1. 四川大学华西药学院, 四川 成都 610041;
2. 中国科学院上海药物研究所, 上海 201203
摘要:本文旨在合成具有穿膜活性的促凋亡AVPI-低分子量鱼精蛋白嵌合多肽 (AVPI-LMWP), 制备安全有效的AVPI-LMWP/pTRAIL基因共给药系统, 通过凋亡肽AVPI与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因 (pTRAIL) 联合用药来发挥抗肿瘤作用.采用标准固相合成法合成嵌合型多肽AVPI-LMWP.基于静电吸附作用, AVPI-LMWP可与DNA药物形成AVPI-LMWP/pTRAIL 复合物, 并对其理化性质进行了表征, 同时研究其细胞摄取效率和抗肿瘤增殖能力.结果表明, 采用共孵育法成功制备了AVPI-LMWP/pTRAIL复合物, 随着AVPI-LMWP/pTRAIL质量比的增加, 复合物的平均粒径逐渐减小, zeta-电位变化较小.凝胶电泳实验结果表明, 当两者质量比大于15:1时, AVPI-LMWP能完全包裹和压缩质粒pTRAIL.体外细胞摄取实验显示, 随着二者质量比的增加, 细胞摄取效率有所提高.体外细胞毒性实验表明, AVPI-LMWP/pTRAIL (W:W = 20:1) 复合物抑制HeLa细胞增殖的效果显著强于pTRAIL、AVPI-LMWP及LMWP/pTARIL复合物.研究显示, AVPI-LMWP/pTRAIL基因共给药系统能将质粒高效递送到HeLa细胞内, 并能有效地诱导肿瘤细胞凋亡, 是具有联合治疗应用价值的多肽/基因共给药系统.
关键词穿膜肽     凋亡肽     基因给药     细胞凋亡     TRAIL     AVPI     肿瘤治疗    
Cell-penetrating chimeric apoptotic peptide AVPI-LMWP/DNA co-delivery system for cancer therapy
TAN Jiao1,2, WANG Ya-ping2, WANG Hui-xin2, LIANG Jian-ming2, ZHANG Meng2, SUN Xun1 , HUANG Yong-zhuo2     
1. West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China;
2. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China
Abstract: To develop a cell-penetrating chimeric apoptotic peptide AVPI-LMWP/DNA co-delivery system for cancer therapy, we prepared the AVPI-LMWP/pTRAIL self-assembled complexes containing a therapeutic combination of peptide drug AVPI and DNA drug TRAIL. The chimeric apoptotic peptide AVPI-LMWP was synthesized using the standard solid-phase synthesis. The cationic AVPI-LMWP could condense pTRAIL by electrostatic interaction. The physical-chemical properties of the AVPI-LMWP/pTRAIL complexes were characterized. The cellular uptake efficiency and the inhibitory activity of the AVPI-LMWP/pTRAIL complexes on tumor cell were also performed. The results showed that the AVPI-LMWP/pTRAIL complexes were successfully prepared by co-incubation. With the increase of mass ratio (AVPI-LMWP/DNA), the particle size was decreased and the zeta potential had few change. Agarose gel electrophoresis showed that AVPI-LMWP could fully bind and condense pTRAIL at a mass ratio above 15:1. Cellular uptake efficiency was improved along with the increased ratio of WAVPI-LMWP/WpTRAIL. The in vitro cytotoxicity experiments demonstrated that the AVPI-LMWP/pTRAIL (W:W = 20:1) complexes was significantly more effective than the pTRAIL, AVPI-LMWP alone or LMWP/pTRAIL complexes on inhibition of HeLa cell growth. Our studies indicated that the AVPI-LMWP/pTRAIL co-delivery system could deliver plasmid into HeLa cell and induce tumor cell apoptosis efficiently, which showed its potential in cancer therapy using combination of apoptoic peptide and gene drugs.
Key words: cell penetrating peptide     apoptotic peptide     gene delivery     apoptosis     TRAIL     AVPI     cancer therapy    

促凋亡蛋白SMAC/Diablo能解除凋亡抑制蛋白IAP (inhibitors of apoptosis proteins) 家族对半胱天冬酶 (caspases) 酶原的抑制并激活成熟半胱天冬酶活性,进而激活半胱天冬酶的级联放大效应,从而诱导细胞凋亡及抑制细胞增殖。其N端的AVPI四肽序列是结合IAPS并发挥凋亡作用的关键结构域[1, 2]。但由于AVPI四肽缺乏细胞穿透性,其临床应用受到极大限制。鱼精蛋白是用于拮抗肝素的临床用药[3],由鱼精蛋白酶解得到的低 分子量鱼精蛋白 (LMWP) 富含碱性氨基酸精氨酸,能够高效的介导药物分子进入细胞,是具有克服质膜屏障能力的新型穿膜肽[4, 5]。本实验室构建了具有细胞穿膜能力和致细胞凋亡能力的嵌合型多肽AVPI-LMWP,而LMWP具有较强的结合和压缩DNA的能力,可以介导基因给药[6]。因此,AVPI-LMWP既可作为治疗多肽,亦可作为基因药物载体。在生理pH条件下AVPI-LMWP上的氨基发生质子化,带正电荷的氨基基团和DNA中带负电荷的磷酸基团通过静电吸引形成复合物,在穿膜肽LMWP介导作用下,以细胞内吞的方式进入胞內发挥作用 (路线1)。基因治疗的关键环节在于如何将目的基因有效的导入靶器官和靶细胞中[7],从而纠正补偿基因缺陷并发挥治疗作用,这主要依赖于安全高效的基因载体[8, 9, 10, 11]。AVPI-LMWP是一个多功能型的嵌合穿膜-凋亡治疗肽,同时负载基因药物后构建成一个新型的联合给药系统,有助于提高生物大分子疗效。本实验采用AVPI-LMWP包裹肿瘤坏死因子相 关凋亡诱导配体基因pTRAIL,探讨其在体外抑制肿瘤细胞增殖的能力。

Scheme 1 Schematic illustration of co-delivery of peptide drug AVPI and pTRAIL gene into tumor cells for cancer therapy
材料与方法 药品与试剂

质粒pTRAIL,购自美国Invivogen公司; AVPI-LMWP (氨基酸序列: AVPIVSRRRRRRG GRRRR) 由上海立昂化学有限公司合成; 琼脂糖、二甲基亚砜 (国药集团化学试剂有限公司); 去内毒素质粒大抽试剂盒 (北京天根生化科技有限公司); 胎牛血清 (美国Hyclone公司); Dulbeccco’s Modified Eagle’s Medium培养基 (美国Invitrogen公司); 胰蛋白酶 (上海碧云天生物技术研究所); 实验用水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

仪器

多功能酶标仪 (美国赛默飞公司,Multiskan GO); 凝胶成像系统 (GelDoc XR),核酸电泳仪 (美国伯乐公司); 倒置荧光显微镜 (日本奥林巴斯公司,IX81); 细胞培养箱 (日本三洋公司,MCO-18AIC); 激光粒度分析仪 (英国马尔文公司,ZEN3690); 流式细胞仪 (美国BD公司,FACS Calibur)。

细胞株及细胞培养

人子宫颈癌细胞株 (HeLa) 和人脐静脉内皮细胞株 (HUVEC) 购自中国科学院上海细胞库。采用DMEM培养基 (含10% 胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 µg·mL-1 链霉素),于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中连续培养。每3天用含0.02% EDTA-0.25%胰蛋白酶消化,1∶4传代,繁殖细胞,取对数生长期细胞进行实验。

嵌合型多肽AVPI-LMWP的合成

采用标准固相合成法合成多肽AVPI-LMWP。合成步骤如下: 称量替代度0.3 mmol·g-1的Fmoc-Arg(pbf)-Wang Resin 1 g投入反应器中,用二氯甲烷溶胀30 min后抽去 二氯甲烷,加入配制好的六氢吡啶-二甲基甲酰胺溶液 (PIP∶DMF = 1∶4) 反应20 min,脱除Fmoc基 团,DMF洗涤6次。然后将适量Fmoc-Arg(pbf)-OH 及O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU) 加入反应器中,在弱碱性环境中反应30 min,抽去反应液,加入配制好的六氢吡啶-二甲基甲酰胺溶液 (PIP∶DMF = 1∶4) 反应20 min,脱除Fmoc基团,DMF洗涤6次。依照多肽氨基酸序列按上述步骤重复操作 即可。合成反应完毕,将树脂放入三氟乙酸-三异丙基硅烷-水 (95∶2.5∶2.5) 溶液中,常温下反应3 h,过滤,在滤液中加入过量的乙醚进行沉淀,离心,即得到产物多肽。合成的产物使用制备液相色谱进行 纯化。采用高效液相色谱和电喷雾质谱进行分析鉴定。高效液相色谱条件: Agela Venusil MP C18色谱柱 (250 mm × 4.6 mm,5 µm); 流动相: 水-乙腈-三氟乙酸 (8∶92∶0.1~100∶0∶0.1梯度洗脱30 min); 流速1 mL·min-1; 检测波长220 nm; 柱温30 ℃; 进样量5 µL。质谱检测条件: 电喷雾离子源,正离子模式,喷雾电压: 4.9 kV; 离子传输毛细管温度: 350 ℃。

AVPI-LMWP/pTRAIL复合物的制备

采用不同的质量比制备纳米复合物。精密称取适量AVPI- LMWP,用超纯水配制成所需浓度的AVPI-LMWP溶液。pTRAIL质粒用TE缓冲液稀释到0.2 mg·mL-1。将质粒溶液加入到等体积的不同浓度的AVPI- LMWP溶液中,漩涡混合20 s后于室温静置30 min,即得不同质量比的AVPI-LMWP/pTRAIL复合物。

琼脂糖凝胶电泳实验

采用琼脂糖凝胶电泳实验分析AVPI-LMWP对于质粒pTRAIL的包裹能力。称取适量琼脂糖溶于1×TAE缓冲液中,微波加热制成1% 琼脂糖溶液,待冷却至60 ℃左右,加入作用 浓度的核酸染料gel-red混合均匀,倒入制胶槽制胶。取不同质量比制备的AVPI-LMWP/pTRAIL复合物与上样缓冲液混合后进行电泳实验,设置参数: 80 V,60 min,置于凝胶成像系统进行观察并拍照。

AVPI-LMWP/pTRAIL复合物的表征

取不同质量比制备得到的AVPI-LMWP/pTRAIL复合物,用5% 蔗糖溶液稀释到适当浓度。采用激光粒径分析仪测定复合物粒径大小与zeta-电位。将AVPI-LMWP/ pTRAIL (WW = 20∶1) 复合物滴到覆有碳膜的铜网上,自然晾干后置透射电镜 (TEM) 下观察复合物的形态。

细胞摄取实验

采用核酸染料YOYO-1标记质粒DNA用于分析细胞摄取效率。取对数生长期的HeLa细胞均匀接种于24孔板中,细胞数为2×104个/孔,置于细胞培养箱中培养过夜。弃去培养基,将新鲜制备的AVPI-LMWP/pTRAIL-YOYO-1复合物与含10% FBS的DMEM培养基混合均匀后,每孔加入含1 µg质粒的纳米粒培养基混合溶液500 &micr o;L,每组设置3个复孔,复合物与细胞共孵育2 h。弃去培养基,PBS缓冲液冲洗两遍,再加入PBS 200 µL后于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光的分布情况。采用流式 细胞仪进行半定量分析,用0.25% 胰蛋白酶消化收集细胞,用冷PBS清洗两遍,再用适量PBS反复吹打,混合均匀成单细胞悬液,采用流式细胞仪测定细胞摄取率。

复合物的抗肿瘤细胞增殖实验

采用MTT方法评估复合物的抗肿瘤细胞增殖能力。取对数生长期的肿瘤细胞HeLa和正常细胞HUVEC接种于96孔板中,细胞数为6×103个/孔,置于37 ℃孵育过夜。用含10% FBS的DMEM培养基将AVPI-LMWP/pTRAIL (WW = 20∶1) 复合物稀释成一系列不同浓度的复合物溶液,每孔加入上述混合液200 µL,在细胞培养箱继续培养48 h。每孔加入MTT溶液 (5 mg·mL-1,溶于PBS中) 20 µL,继续孵育4 h后小心吸弃培养液。每孔加入DMSO 200 µL,置于摇床上低速振荡10 min,使甲瓒结晶充分溶解。选用490 nm为检测波长,用酶标仪检测各孔的吸收值。计算细胞存活率:

细胞存活率 (%) = [(AE - AB) / (AC - AB)] × 100%

AE是加药孔的吸光值,AC是对照孔的吸光值,AB是调零孔的吸光值,每组实验做3个复孔。

数据处理

所有数据统计分析均采用SPSS 13.0软件处理,数据采用平均值 ± 标准差表示。

结果与讨论 1 AVPI-LMWP的鉴定

采用高效液相色谱对多肽的纯度进行分析,结果见图 1。固相合成的嵌合型多肽AVPI-LMWP纯度达95%,其理论分子质量为2 260.71,质谱鉴定结果表明,经分子离子峰推算的分子量与理论分子量一致 (图 2)。

Figure 1 HPLC chromatogram of AVPI-LMWP

Figure 2 Mass spectrum of AVPI-LMWP
2 AVPI-LMWP/pTRAIL复合物的理化性质

激光粒度分析仪对AVPI-LMWP/pTRAIL复合物粒径大小和zeta-电位分析结果见表 1。AVPI-LMWP/ pTRAIL复合物的粒径随着二者质量比的增加,粒径有变小的趋势,当质量比为20时,粒径已小于90 nm。这主要是因为随着AVPI-LMWP量的增加,对DNA的压缩能力增强。不同质量比制备的复合物PDI均较小,粒径分布比较集中,大小均匀。但随着AVPI- LMWP/pTRAIL质量比的增加,电位仅有较小的上升趋势,均在 +25 mV左右,体系比较稳定。复合物的形态、粒径大小和表面电位对有效转运目的基因到靶细胞有着非常重要的意义[12, 13]。研究发现粒径较大的复合物较粒径较小的复合物有更高的转染效率,同时结合细胞摄取实验结果,选择质量比为20的AVPI- LMWP/pTRAIL复合物用于抗肿瘤细胞增殖实验。在此比例下透射电镜观察到AVPI-LMWP/pTRAIL (WW = 20∶1) 复合物形状规整,粒径大小较为均一,无颗粒团聚现象 (图 3)。

Table 1 Physicochemical characteristics of nanoparticles. n = 3,± s. PDI: Polydispersity index; ζ: Zeta potential

Figure 3 Transmission electron microscopy (TEM) image of the AVPI-LMWP/pTRAIL (WW = 20∶1) complexes
3 琼脂糖凝胶阻滞电泳实验

琼脂糖凝胶阻滞分析可以直观地反映基因载体包裹压缩质粒DNA的能力,裸DNA带负电,在电场力的驱动下,向正极移动,gel-red是一种非常灵敏的核酸染料,可以与暴露的DNA分子结合,在紫外灯下显现强烈的红色荧光,从而可以观察DNA分子的状态。AVPI-LMWP阳离子多肽与带负电的质粒pTRAIL静电吸附形成致密的复合物。琼脂糖凝胶阻滞电泳实验结果表明,随着WAVPI-LMWP/WpTRAIL质量比的增大,出现迁移的质粒pTRAIL逐渐减少,当质量比大于等于15时,质粒能够完全被包裹,无迁移现象发生 (图 4)。

Figure 4 Agarose gel electrophoresis of DNA mobility retardation assay
4 细胞摄取实验

嵌合型穿膜-凋亡肽AVPI-LMWP富含大量的 碱性氨基酸精氨酸,在生理条件下带正电荷,能与带负电荷的质粒DNA发生静电结合,将大分子DNA 极大地包裹压缩而形成稳定的纳米级复合物。AVPI- LMWP/pTRAIL复合物带正电荷,可与细胞膜表面的负电性基团结合而黏附于细胞膜上,经AVPI-LMWP的穿膜作用介导高效进入细胞内。倒置荧光显微镜 下观察到HeLa细胞中分布有绿色荧光 (图 5),说明AVPI-LMWP能够携载pTRAIL进入细胞,有细胞膜穿透性。利用Flow Jo软件对流式细胞术 (FACS) 结果进行分析,结果表明,随两者质量比的增加,AVPI- LMWP/pTRAIL复合物进入细胞的能力逐渐增强,荧光强度增大。以上实验结果表明AVPI-LMWP是一个高效的、有潜力的基因递送载体。

Figure 5 Fluorescence microcopy images and flow cytometric analysis for investigation of uptake efficiency of the AVPI-LMWP/ pTRAIL complexes in HeLa cells
5 抗肿瘤增殖实验

凋亡抑制蛋白IAP与凋亡酶caspases结合后,可抑制凋亡酶的活化,从而阻止细胞凋亡 (即程序性自杀)。线粒体促凋亡蛋白SMAC/Diablo可与IAP特异性结合,解除IAP对caspases的拮抗作用,从而促进细胞凋亡[14, 15]。Smac/DIABO蛋白的N端四肽AVPI已被证明能与IAP家族结合,诱导细胞凋亡,是近年来研究较多的凋亡肽[16]。但是由于其缺乏细胞穿透性,难以跨膜进入细胞内,无法发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。为了克服这一难题,设计合成了嵌合型穿膜肽AVPI-LMWP。它不仅具有致细胞凋亡的功能,同时也可以作为基因载体使用。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL) 是1995年发现的一个肿瘤坏死因子家族成员。TRAIL可以与肿瘤细胞表面的死亡受体DR4和DR5结合,其胞内区域可以激活 传导细胞凋亡信号,导致细胞死亡。研究结果表明,AVPI四肽可以增强TRAIL的抗肿瘤活性,联合使用AVPI与TRAIL会有协同增效的作用[17, 18]。而正常细胞的细胞膜上有大量的诱骗受体DcR1和DcR2,可以与DR4、DR5竞争性结合TRAIL,但诱骗受体并不能传导凋亡信号,而使正常细胞逃逸TRAIL的凋亡作用。采用MTT法 测试AVPI-LMWP/pTRAIL复合物在转染48 h后肿瘤细胞HeLa和正常细胞HUVEC的增殖能力。结果 (图 6) 显示,AVPI-LMWP/pTRAIL复合物抑制HeLa细胞增殖的效果显著强于单独使用的pTRAIL、AVPI-LMWP和LMWP/pTRAIL复合物。pTRAIL对正常细胞HUVEC无抑制作用。LMWP、AVPI-LMWP、LMWP/pTRAIL和AVPI-LMWP/pTRAIL复合物对HUVEC细胞的增殖抑制作用无明显差异,主要来源于阳离子多肽的毒性作用,但均弱于相应组对肿瘤细胞HeLa的增殖抑制作用。以上实验结果表明,AVPI-LMWP/pTRAIL复合物是一种相对安全有效的基因给药系统,有望用于肿瘤的治疗。

Figure 6 The inhibitory effect on HeLa cell and HUVEC cell growth was evaluated by MTT assay
结论

本实验采用AVPI-LMWP阳离子多肽静电结合质粒pTRAIL制备得到AVPI-LMWP/pTRAIL共给药系统。基于具有穿膜序列的嵌合型多肽AVPI-LMWP,能够显著提高凋亡肽AVPI的入胞效率。所制备的AVPI-LMWP/pTRAIL共给药系统能够高效地运载 质粒进入细胞内。利用凋亡肽AVPI与DNA药物pTRAIL的协同作用,该给药系统对子宫癌HeLa细胞 具有良好的疗效。本实验方法简单可行,易于操作,为肿瘤生物治疗的联合用药以及提高非病毒载体介导的基因给药系统奠定了一定的基础。

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