药学学报  2014, Vol. 49 Issue (12): 1705-1710   PDF    
川乌与白芍配伍对CYP450酶活性影响及其代谢指纹的研究
毕云枫1,2, 郑重1, 皮子凤1, 刘志强1, 宋凤瑞1     
1. 中国科学院长春应用化学研究所, 国家质谱中心 (长春), 吉林省中药化学和质谱重点实验室, 吉林 长春 130022;
2. 吉林农业大学食品科学与工程学院, 吉林 长春 130118
摘要:利用UPLC-MS/MS的多反应监控 (MRM) 技术, 结合多探针底物方法, 评价川乌-白芍配伍对肝脏主要药物代谢酶CYP 1A2、CYP 2C、CYP 2E1、CYP 2D、CYP 3A的活性影响.结果表明: 与川乌单煎液相比, 白芍与川乌不同配比溶液均能降低川乌对CYP3A、CYP2D、CYP2C及CYP1A2的抑制作用, 而对CYP2E1基本无影响.制川乌组分-白芍配伍溶液的CYP代谢指纹图谱分析结果表明, 与川乌单煎液相比, 共煎液经CYP代谢后双酯型生物碱的丰度明显降低, 而单酯型生物碱的丰度明显增加.表明白芍与川乌共用, 能使川乌中的双酯型毒性生物碱加快降解, 生成抗炎活性较好的单酯型生物碱, 起到减毒增效的作用.
关键词川乌     白芍     CYP450     代谢指纹图谱     减毒     增效    
The metabolic fingerprint of the compatibility of Radix Aconite and Radix Paeoniae Alba and its effect on CYP450 enzymes
BI Yun-feng1,2, ZHENG Zhong1, PI Zi-feng1, LIU Zhi-qiang1, SONG Feng-rui1     
1. National Center of Mass Spectrometry in Changchun and Key Laboratory of Chinese Medicinal Chemistry and Mass Spectrometry in Jilin Province, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Science, Changchun 130022, China;
2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract: Using a UPLC-MS/MS (MRM) and cocktail probe substrates method, the metabolic fingerprint of the compatibility of Radix Aconite (RA) and Radix Paeoniae Alba (RPA) and its effect on CYP450 enzymes were investigated. These main CYP isoforms include CYP 1A2, CYP 2C, CYP 2E1, CYP 2D and CYP 3A. Compared with the inhibition effect of RA decoctions on CYP450 isoforms, their co-decoctions of RA and RPA with different proportions can decrease RA' inhibition on CYP3A, CYP2D, CYP2C and CYP1A2, but can not reduce RA' effect on CYP2E1. The metabolic fingerprints of RA decoction and co-decoctions with different proportions of RPA in CYP450 of rat liver were analyzed by UPLC-MS. Compared with the metabolic fingerprints of RA decoction, the intensity of diester-diterpenoid aconitum alkaloids decreased significantly, while the intensity of monoester-diterpenoid alkaloids significantly increased in the metabolic fingerprints of co-decoctions of RA and RPA. The results suggest that RA coadministration with RPA increased the degradation of toxic alkaloid and show the effect of toxicity reducing and efficacy enhancing.
Key words: Radix Aconite     Radix Paeoniae     cytochrome P450     metabolic fingerprint     toxicity reducing     efficacy enhancing    

中医理论认为,两种或两种以上药物配伍应用产生的相互作用包含在药物的“七情”中。两种药 物合用,可以增强其原有疗效,或其中一种能提高君药的疗效,即“七情”中的“相须”和“相使”。川乌为毛茛科乌头属植物乌头 (Aconitum carmichaeli. Debx) 的母根,具有抗炎和镇痛等多种药理作用[1],在临床上常被用于治疗风寒湿痹、关节疼痛及坐骨神经痛等症[2]。二萜类生物碱被认为是川乌中主要的生物活性物质。而其中的双酯型生物碱是川乌毒性的主要来源[3, 4]。作为临床上常用的传统药对,川乌与白芍配伍主要用于风湿关节炎等风湿痹证。有文献[5]报道,制川乌与白芍配伍后,总生物碱含量呈现升高趋势。也有研究表明,川乌与白芍配伍合煎后,乌头碱的煎出量降低,芍药苷的煎出量增加[6]。川乌与白芍配伍后灌胃给药能显著降低川乌对小鼠的毒性[7]。可部分增加制川乌镇痛、抗炎、免疫调节等作用[8]

肝脏作为药物代谢的最重要器官,在解毒和排除异源物质方面发挥着重要作用。其中,药物的代谢主要通过肝脏中细胞色素P450的CYP1A2 (13%)、CYP2C (20%)、CYP2D (2%)、CYP2E1 (7%)、CYP3A (29%) 等亚型酶来完成[9, 10, 11, 12]。白芍与川乌配伍是否会对上述CYP450亚型酶产生影响,是否会影响川乌生物碱的代谢,本文对此进行了初步研究。

材料与方法 实验动物

清洁级雄性SD大鼠6只,体重 (200 ± 20) g,由吉林大学实验动物中心提供,合格证号: (吉) 2008-0005。

仪器

Waters Xevo-TQ三级四极杆质谱仪,配备Acquity UPLC系统,同时配有Waters Masslynx V4.1数据工作站 (美国Waters公司,USA); Finnigan LTQ XL离子阱质谱仪,美国Thermo公司产品。Sanorius BSl10S分析天平 (北京赛多利斯有限公司产品); Optima L-100×P制备型超速离心机 (贝克曼库尔特实验系统 (苏州) 有限公司); DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机 (宁波新芝生物科技股份有限公司); Milli-Q超纯水仪; Eppendorf 5810R台式高速冷冻离心机 (德国Eppendorf公司); MDF-382E型超低温冰箱 (日本SANYO公司)。

试剂与药材

安替比林、非那西丁、对乙酰氨基酚、氯唑沙宗、6-羟基氯唑沙宗、睾酮、6-羟基睾酮、甲苯磺胺丁脲、4-羟基甲苯磺胺丁脲、右美沙芬、去甲右美沙芬、G-6-P、G-6-PDH、β-NADP均购自Sigma公司。乙腈、甲醇、磷酸 (色谱纯): 美国Fisher公司产品; 水为二次去离子水。白芍购自长春市吉林大药房; 生川乌与制川乌购自四川江油饮片厂。所用药材经长春中医药大学王淑敏教授鉴定。

肝微粒体制备

大鼠肝微粒体制备及蛋白含量测定按文献[13]方法完成。

川乌与白芍单煎液、共煎液的制备

生川乌、制川乌、白芍各5 g,粉碎过40目筛。

单煎液

将生川乌、制川乌、白芍各5 g药粉加10倍量水浸泡20 min,微沸提取2次,提取时间分 别为20 min和10 min,经3 500 r·min-1离心15 min,提取液冻干,冻干粉加入10倍乙醚,超声20 min。离心,上清液导入新离心管中挥干。沉淀再加入10倍 甲醇 (白芍加入一半水) 超声20 min,离心。上清液用氮气吹干。用甲醇与乙醚混合液(50∶50) 定容至2 mL,得到2.5 g生药·mL-1的单煎液。样品置 -80 ℃冰箱中保存备用。

共煎液

川乌∶白芍、制川乌∶白芍共煎,配对比例均分别为1∶1、1∶2、和2∶1。煎煮方法与单煎液煎煮及处理方法相同。

样品配制

取制备好的单煎液按川乌∶白芍、制川乌∶白芍,分别按配对比例1∶1、1∶2、和2∶1配制。各配制液置 -80 ℃冰箱中保存备用。

制川乌总生物碱组分的制备

制川乌用15倍量95% 乙醇超声提取6次,每次30 min。合并提取液,浓缩近干,用10倍量无水乙醇分多次超声提取浸膏,合并无水乙醇液,抽滤去不溶物,将滤液浓缩定容,得到制川乌总生物碱组分 (制川乌组分)。

川乌、白芍共用对CYP450亚型酶影响的确定

200 μL酶反应体系,用100 mmol·L-1 Tis-HCl缓冲 液(pH 7.4) 配制,其中含有0.5 g·L-1微粒体蛋白、NADPH生产系统 (10 mmol·L-1葡萄糖-6-磷酸、 1 U·mL-1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1 mmol·L-1 NADP+、4 mmol·L-1氯化镁) 及混合探针底物 (终浓度分别为甲苯磺丁脲0.4 mmol·L-1; 右美沙芬0.02 mmol·L-1; 氯唑沙宗0.6 mmol·L-1; 睾酮0.1 mmol·L-1; 非那西丁0.05 mmol·L-1) 构成[14]。孵育反应分对照组和抑制组进行,对照组加入等体积的水或甲醇。抑制组分别加入终浓度为1 000、100、10、1、0.1 μg·mL-1的各单煎液,以及生川乌与白芍 (或制川乌与白芍) 单煎液的各配比液及相同配比共煎液样品。37 ℃预孵 5 min后。37 ℃孵育反应30 min后加入含有内标安 替比林 (终浓度5 μmol·L-1) 的200 μL冰乙腈溶液 终止反应,然后将孵育混合物在12 000×g条件下离 心30 min。取上清液用于UPLC-MS/MS分析。

制川乌组分、白芍对CYP450亚型酶影响的确定

反应体系和浓度与川乌、白芍单煎液单独混合相同。

用于CYP450活性抑制实验的UPLC-MS/MS实验条件[13]

色谱柱: UPLC® BEH Shield RP 18 column (50 mm × 2.1 mm ID,1.7 μm; Waters Corp.,Milford,MA,USA); 流动相A为甲醇-乙腈 (1∶1),流动相B为0.1% (v/v) 甲酸水; 洗脱条件为: 0~5 min: 10%~40% A; 5~5.5 min: 40%~50% A; 5.5~6 min: 50% A; 6~6.5 min: 100% A; 6.5~8 min: 100% A。流速: 0.3 mL·min-1。柱温: 28 ℃。采用串联质谱的多反应监测 (MRM) 方式定量,质谱仪的毛细管电压3.0 kV,离子源温度350 ℃,脱溶剂气体 (N2) 流速700 L·h-1,锥孔气 (N2) 流速50 L·h-1,碰撞气 (Ar) 流速0.15 mL·min-1

用于代谢指纹图谱分析的ESI-MS条件

LTQ线性离子阱质谱仪。电喷雾离子源,正离子模式,喷雾电压4.5 kV,金属毛细管温度250 ℃,鞘气 (N2) 流速40.5 L·h-1,辅助气 (N2) 为90 L·h-1; 扫描范围m/z 150~1 000 Da。

统计分析

本实验的抑制率I (%) 按照文献[15]方法计算。IC50值利用Graphpad Prism V5.0软件拟 合求得。

结果 1 特异性底物的代表性代谢产物及内标的色谱-质谱行为

对所有探针底物的代表性代谢产物及内标进行母离子及产物离子扫描,选择丰度最大的子离子进行MRM监测,其中6-羟基氯唑沙宗采用负离子模式时灵敏度最高,其他化合物采用正离子模式进行检测。

对混合探针底物在大鼠肝微粒体体外孵育之后的样品进行分析,内标及混合探针底物的代表性代谢产物的离子流图[13]图 1,安替比林 (内标)、对乙酰氨基酚、6-羟基氯唑沙宗、6-羟基睾酮、4-羟基甲苯磺胺丁脲、去甲右美沙芬的保留时间分别为1.85、4.16、2.71、4.15、2.94、3.01 min。

Figure 1 UPLC-MS/MS chromatograms of each substrate and internal standard from sample
2 川乌、白芍单煎液对CYP450的作用

表 1中列出了生川乌、制川乌、白芍单煎液在酶反应体系预孵5 min,对各CYP450亚型酶的抑制作用的IC50值。从中可以看出白芍单煎液对CYP2E1的抑制能力最强,IC50值为13.53 μg·L-1,其次对CYP1A2的抑制能力也较强。而对CYP3A、CYP2C、CYP2D的抑制能力则很弱。制川乌单煎液对CYP2C、CYP2D的抑制能力较强,IC50值分别为19.40和21.60 μg·L-1,对CYP3A、CYP1A2的抑制能力相对稍弱,IC50值分别为89.60和87.38 μg·L-1。生川乌单煎液对CYP3A、CYP2C、CYP2D的抑制能力较强,IC50值分别为61.16、59.34和38.65 μg·L-1。其余抑制反应较弱。

Table 1 IC50 of decoction of Radix Paeoniae Alba (A),Radix Aconite preparata (B) and Radix Aconite (C) for the inhibition of CYP450 activity
3 生川乌、制川乌与白芍单煎混合液及共煎液对CYP450的作用

图 2为白芍单煎液分别与生川乌单煎液及制川乌单煎液按1∶2、1∶1、2∶1混合及白芍与生川乌及制川乌按1∶2、1∶1、2∶1配伍共煎液对CYP450各亚型酶的作用。从图中可以看出,对于CYP3A,白芍和生川乌不同配比的单煎混合液的IC50值均比其对应的生川乌单煎液 (61.16 μg·L-1) 和制川乌单煎液 (89.60 μg·L-1) 的IC50值稍高,而白芍和生川乌不同配比共煎液的IC50值随着白芍量的增加而增加 (287.29、333.91、389.17 μg·L-1),是生川乌单煎液IC50值的4~6倍。白芍和制川乌不同配比共煎液 (198.31、196.01、221.29 μg·L-1) 的IC50值也是制川乌单煎液 IC50值的2倍以上,上述结果表明,与生川乌、制川乌的单煎液相比,生川乌、制川乌与白芍单煎混合液及共煎液对CYP3A的抑制作用减小,即白芍的加入减小了生川乌或制川乌对CYP3A的抑制作用。

Figure 2 The effect of decoction mixtures of Radix Aconite,Radix Aconite preparata and Radix Paeoniae Alba (RPA) and their co-decoction on the activity of cytochrome P450. A: RPA combined with Radix Aconite; B: RPA combined with Radix Aconite preparata

不同配比的白芍和生川乌的单煎混合液及白芍和制川乌单煎混合液对CYP2D的IC50值均比对应的生川乌 (38.65 μg·L-1) 和制川乌的 (21.60 μg·L-1) 的IC50值略高,即与生川乌、制川乌的单煎液相比,白芍和生川乌或制川乌的单煎混合液对CYP2D影响相当。而白芍和生川乌不同配比共煎液的IC50值随着白芍量的增加而增加 (154.02、220.36、278.84 μg·L-1),是生川乌单煎液的3.98到7.21倍。白芍和制川乌不同配比共煎液的IC50值分别为 (98.021、130.49、127.34 μg·L-1),是制川乌单煎液的4.53到6.04倍,即与生川乌、制川乌的单煎液相比,白芍和生川乌或制川乌共煎后对CYP2D影响较大,说明在共煎过程中发生的化学或物理变化导致对CYP2D的抑制减弱。

与生川乌、制川乌的单煎液相比,不同配比的白芍和生川乌的单煎混合液与白芍和制川乌单煎混合液对CYP2C的影响较小。而对应配伍比例的共煎液除白芍∶生川乌为1∶2配比时的IC50值 (348.59 μg·L-1) 略低于白芍单煎液的IC50值外,其他各配比共煎液均高于白芍单煎液的IC50值,同时是生川乌单煎液IC50值的5~8倍,即白芍与生川乌或制川乌共煎后过程中发生的化学或物理变化导致对CYP2C的抑制减弱。

与白芍、生川乌、制川乌的单煎液相比,不同配比的白芍和生川乌、制川乌不同配比单煎混合液对于CYP1A2的IC50值均小于白芍、生川乌和制川乌单煎液的IC50,即增加了对CYP1A2的抑制作用。而白芍与生川乌3种配比共煎液的IC50值则略高于生川乌和制川乌单煎液的IC50值,即对CYP1A2的抑制作用有所减弱,但总体影响较小。

由于白芍单煎液对CYP2E1的抑制能力较强 (IC50为13.53 μg·L-1),而生川乌和制川乌对CYP2E1的抑制能力较弱,IC50值分别为812.35和163.47 μg·L-1。白芍与川乌配伍后对CYP2E1影响的IC50值介于15.67~68.47 μg·L-1间,均高于白芍单煎液而低于川乌单煎液,即对CYP2E1的抑制作用略低于白芍,高于制川乌与生川乌。

4 制川乌总生物碱组分、白芍对CYP450的作用

图 3为白芍与制川乌总生物碱组分 (制川乌组分) 按1∶2、1∶1、2∶1混合后对CYP450各亚型酶的作用。从图中可以看出,与对应的白芍和制川乌组 分相比,白芍与制川乌组分配伍对CYP3A、CYP2D、CYP2C的IC50值变化不大。各配比溶液的IC50值与制川乌组分的IC50值非常接近。而对于CYP1A2,所有配比溶液的IC50值均比制川乌组分的IC50值71.38 μg·L-1低,各配比溶液的IC50值分别为40.97、30.59和29.41 μg·L-1,即白芍与制川乌总生物碱组分配伍后对于CYP1A2的抑制作用增强。而白芍与制川乌总生物碱组分配伍后对CYP2E1的影响与制川乌组分相比 (148.54 μg·L-1),抑制作用更强,IC50值分别为11.37、10.19和10.74 μg·L-1

Figure 3 The effect of Radix Aconite preparata components,RPA decoction and their compatible samples on the activity of cytochrome P450
5 制川乌组分及与白芍配伍的CYP代谢指纹图谱

图 4显示了制川乌组分在CYP中代谢前后的质谱变化图。从图中可以看出,经CYP代谢后双酯型生物碱峰的丰度降低,乌头碱和新乌头碱在图中已经检测不到,次乌头碱 (m/z 616) 的丰度明显降低,而单酯型生物碱的丰度明显增加,如苯甲酰乌头碱 (m/z 604)、苯甲酰中乌头碱 (m/z 590)、苯甲酰次乌头碱 (m/z 574) 的丰度与代谢前相比,分别增加7.38%、10.14%、8.49% (表 2)。

Figure 4 Mass spectra of Radix Aconitepreparata components before (A) and after (B) metabolism in CYP450

Table 2 The changes of monoester-diterpenoid alkaloids of compatible samples of Radix Aconite preparata and Radix Paeoniae Alba with different proportions before and after metabolism on cytochrome P450. A: Radix Aconite preparata components,B: The mixtures of Radix Aconite preparata components and the decoction of Radix Paeoniae (1∶1); C: The mixtures of Radix Aconite preparata components and the decoction of Radix Paeoniae (1∶2),D: The mixtures of Radix Aconite preparata components and the decoction of Radix Paeoniae (2∶1)

表 2列出了制川乌总生物碱组分 (制川乌组分)及制川乌组分-白芍不同配比溶液经CYP代谢前后单酯型生物碱的丰度变化情况。从表中可以看出,与制川乌组分代谢后单酯型生物碱丰度增加相比,制川乌组分与白芍各配比液的变化更加明显,尤其是白芍与川乌组分为2∶1时,苯甲酰乌头碱、苯甲酰中乌头碱和苯甲酰次乌头碱的丰度分别增加10.59%、13.94% 和10.82%。

讨论

从实验结果可以看出,白芍对CYP1A2及CYP2E1的抑制能力较强,对其他CYP亚型酶的抑制能力较弱,这正好与川乌及制川乌相反,川乌对CYP1A2及CYP2E1的抑制能力较弱,而对其余亚型酶的抑制能力较强。白芍和不同比例的生川乌或制川乌单煎液混合后,对不同的CYP450亚型酶的影响不同,这种影响是因为白芍成分的加入。而白芍和生川乌或制川乌不同配比共煎液除对CYP2E1影响较小外,对其余几种CYP450亚型的IC50值均高于对应的单煎液。上述结果表明,白芍与川乌配伍使用,均能降低川乌对CYP3A、CYP2D、CYP2C及CYP1A2的抑制作用。而这种降低作用源于白芍与川乌配伍合煎后,乌头碱的煎出量降低,芍药苷的煎出量增加[6]。并且川乌中毒性较大的双酯型生物碱的代谢主要经过这几种亚型酶的代谢[16, 17, 18],尤其是CYP3A和CYP2D的代谢。白芍与制川乌组分配伍溶液与制川乌组分相比,经CYP代谢后,均能使单酯型生物碱的生成量明显增加。而川乌中双酯型生物碱的毒性远远大于单酯型生物碱,单酯型生物碱的生物活性又大于双酯型生物碱[19],这充分说明白芍与川乌共用,可以加速川乌中毒性生物碱的降解,最终起到减毒增效的作用。

参考文献
[1] Li TSC. Chinese and Related North American Herbs-Phytopharmacology and Therapeutic Values [M]. Boca Raton: CRC Press, 2002: 6.
[2] Wang DP, Lou HY, Huang L, et al. A novel franchetine type norditerpenoid isolated from the roots of Aconitum carmichaeli Debx with potential analgesic activity and less toxicity [J]. Bioorg Med Chem Lett, 2012, 22: 4444-4446.
[3] Chen JH, Lee CY, Liau BC, et al. Determination of aconitine-type alkaloids as markers in fuzi (Aconitum carmichaeli) by LC/(+)ESI/MS(3) [J]. J Pharm Biomed Anal, 2008, 48: 1105-1111.
[4] Cao V, Chen XF, Lü DY, et al. Using cell membrane chromatography and HPLC-TOF/MS method for in vivo study of active components from roots of Aconitum carmichaeli [J]. J Pharm Anal, 2011, 1: 125-134.
[5] Yu CH, Peng C, Yu CC, et al. The effect on the total alkaloids of Radix Aconiti Preparata (RAP) combined with Radix Aconiti Preparata (RAP) in different ratios [J]. Lishizhen Med Mat Med Res (时珍国医国药), 2008, 19: 1-2.
[6] He W, Wang N, Qin L, et al. Determination of aconitine and paconiflorin before and after Radix Aconiti concomitant with Radix Paeoniae Alba boiled with water [J]. Chin Pharm J (中国药学杂志), 2002, 39: 680-683.
[7] Qin L, Peng X, Li XL, et al. Acute toxicity experiment of white peony root and Radix Aconiti together or singleuse [J]. J Shandong Univ TCM (山东中医药大学学报), 2000, 24: 453-455.
[8] Wu QG, Yao HY, Lan SL, et al. Analysis of slowly make poison compatibility of Radix Paeoniae Alba [J]. Pharm Clin Chin Mater Med (中药与临床), 2012, 3: 36-37.
[9] Ioannides C, Lewis DF. Cytochromes P450 in the bioac­tivation of chemicals [J]. Curr Top Med Chem, 2004, 4: 1767-1788.
[10] Ghanayem BI, Hoffler U. Investigation of xenobiotics metabolism, genotoxicity, and carcinogenicity using CYP2E1 (-/-) mice [J]. Curr Drug Metab, 2007, 8: 728-749.
[11] Huttunen KM, Mahonen N, Raunio H, et al. Cytochrome P450-activated prodrugs: targeted drug delivery [J]. Curr Med Chem, 2008, 15: 2346-2365.
[12] Cedric G, Rachel B, Sarah W, et al. Inhibition of human P450 enzymes by multiple constituents of the Ginkgo biloba extract [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 318: 1072-1078.
[13] Bi YF, Zhu HB, Pi ZF, et al. Effects of flavonoides from the leaves of acanthopanax on the activity of CYP450 isozymes in rat liver microsomes by a UPLC-MS/MS and cocktail probe substrates method [J]. Chem J Chin Univ (高等学校化学学报), 2013, 34: 1067-1071.
[14] Otten JN, Hingorani GP, Hartley DP, et al. An in vitro, high throughput, seven CYP cocktail inhibition assay for the evaluation of new chemical entities using LC-MS/MS [J]. Drug Metab Lett, 2011, 5: 17-24
[15] Cai T, Zhang L, Wang H, et al. Assisted inhibition effect of acetylcholinesterase with n-octylphosphonic acid and application in high sensitive detection of organophosphorous pesticides by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform mass spectrometry [J]. Anal Chim Acta, 2011, 706: 291-296.
[16] Tang L, Ye L, Lü C, et al. Involvement of CYP3A4/5 and CYP2D6 in the metabolism of aconitine using human liver microsomes and recombinant CYP450 enzymes [J]. Tox Lett, 2011, 202: 47-54.
[17] Bi YF, Li X, Pi ZF, et al. Analysis of hypaconitine's metabolites and related metabolic CYP isoforms in rat liver microsomal by using UPLC-MS/MS method [J]. J Chin Mass Spectrom Soc (质谱学报), 2013, 34: 330-337.
[18] Bi YF, Liu S, Zhang RX, et al. Studies on the metabolites and the metabolic pathways of mesaconitine in rat liver microsomal by using UPLC-MS/MS method in vitro [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48: 1823-1828.
[19] Zhu HB, Liu S, Li X, et al. The bioactive fingerprint analysis of cyclooxygenase-2 ligands from Radix Aconiti by ultrafiltration-UPLC-MSn [J]. Anal Bioanal Chem, 2013, 405: 7437-7445.