2. 四川大学, 生物治疗国家重点实验室, 四川 成都 610041
2. State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, Chengdu 610041, China
附子是毛茛科乌头属植物卡氏乌头 (Aconitum carmichaeli Debx.) 侧根(子根) 的加工品,是多种传统中药方剂的重要组成部分。附子性大热,味辛、甘,有毒,具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效。附子主产于四川江油,目前在其他地区也有广泛种植。因附子毒性很大,在临床使用之前需经炮制处理以达到减毒的目的。《中国药典》2010版一部附子项下收载的品种有白附片、黑顺片和盐附子。现代研究表明,附子具有强心作用[1],但是其强心活性物质一直没有公认的结果。在过去的几十年里,学者们研究报道了多个强心成分,如dl-去甲乌药碱[2]、氯化棍掌碱[3]、去甲猪毛菜碱[4]、尿嘧啶[5, 6]和附子苷[7]。然而,用HPLC法测定附子中的以上成分时发现其含量极低,附子中的主要强心成分仍有待进一步研究。
目前公认附子中含有大量的C19-二萜生物碱类成分。根据C8和C14位酯型取代基结构的不同,C19-二萜生物碱分为双酯型、单酯型和胺醇型三种。双酯型二萜生物碱的C8为乙酰基取代,C14为苯甲酰基取代,单酯型二萜生物碱仅有C14的苯甲酰基取代,胺醇型二萜生物碱无酯基取代。在毒性方面,双酯型有剧毒,单酯型毒性较弱,而胺醇型毒性最弱。以乌头原碱为例,小鼠的LD50 (iv) 为0.12 mg·kg-1,而苯甲酰乌头原碱的LD50为23 mg·kg-1 [8]。
除了对附子中C19-二萜生物碱的化学性质和毒性进行大量研究外,多种分析方法也成功运用于二萜生物碱的测定,例如,用RP-ion-pair HPLC-UV法[9]和LC-DAD法[10]同时测定多种双酯型和单酯型二萜生物碱,用ESI-Ion Trap-MS/MS法[11, 12]、ESI-FTICR-MS法[13]和MALDI-TOF/MS法[14]对二萜生物碱的裂解途径进行研究,用LC-TOF/MS法[15]、HPLC-ESI-MS/ MSn法[13]、UPLC-Linear Ion Trap-Orbitrap MS法[16]和UPLC/Q-TOF-MS法[17]对附子及其制剂中的多种乌头碱类成分进行鉴定。超高效液相色谱 (UPLC) 法是对复杂化学成分进行快速分析和有效分离的一种强有力的工具。UPLC法与质谱法联用可对小分子物质进行快速、灵敏和可靠的检测和分析。目前虽有多种LC-MS法研究二萜类生物碱 ,但其研究重点都在于双酯型和单酯型生物碱,对胺醇型二萜生物碱的研究极少。
本实验室的前期研究[18]从附子中分离得到5种具有强心作用的C19-二萜生物碱,均为胺醇型二萜生物碱。为验证附子中的强心成分是否为一组胺醇型二萜生物碱,本文运用UPLC-MS法和对照品比较法对附子中的胺醇型二萜生物碱进行鉴定,测定了7批不同产地和炮制方法的附子样品,使用蛙心灌流实验评价了13个胺醇型二萜生物碱的强心活性。通过对附子中的胺醇型二萜生物碱的全面研究,本文确认了附子中含有多种胺醇型二萜生物碱,且具有不同程度的强心作用,对附子中胺醇型二萜生物碱及强心作用的研究具有重要的参考意义。
材料与方法 仪器Acquity超高效液相色谱仪与Quattro Premier XE质谱仪联用 (Waters公司,美国),配备ESI离子源及MassLynx V4.1数据采集与处理系统; 成都泰盟软件有限公司BL-420 E+生物机能实验系统,包括FT-100张力传感器。
药材与试药江油白附片 (A)、安县白附片 (B)、江油黑顺片 (C)、安县黑顺片 (E)、江油盐附子 (F) 和云南盐附子 (G) 购自成都荷花池中药材市场,江油黑顺片 (D) 购自成都御麟堂药店,经过四川大学华西药学院王曙教授鉴定。北乌宁 (beiwutinine)、中乌宁 (mesaconine)、多根乌头碱 (karakoline)、异塔拉定 (isotalatizidine)、乌头原碱 (aconine)、8-甲氧基中乌宁 (8-methoxymesaconine)、次乌宁 (hypaconine)、附子灵 (fuziline)、3-去氧乌头原碱 (3-deoxyaconine)、尼奥灵 (neoline)、8-甲氧基次乌宁 (8-methoxyhypaconine)、塔拉萨敏 (talatisamine)、查斯曼宁 (chasmanine) 对照品由四川大学华西药学院天然药物化学系王锋鹏教授实验室提供,结构见图 1。去乙酰毛花苷注射液购自上海旭东海普药业有限公司 (批号: AF121004,浓度: 0.2 mg·mL-1)。DIKMA公司固相萃取小柱 (ProElut PXC 150 mg/6 mL)。甲醇 (Fisher Scientific)、甲酸 (中国科龙化学试剂有限公司) 为色谱纯,水为超纯水 (18.2 MΩ·cm),其他试剂均为分析纯。
牛蛙购自四川大学实验动物中心,许可证号: SCXK (川) 2009-045。
色谱和质谱条件色谱柱为Acquity UPLC BEH C18 (2.1 mm × 100 mm,1.7 μm,Waters,USA) 柱; 柱温为30 ℃; 流动相A: 0.1% 甲酸水溶液,流动相B: 甲醇,线性梯度洗脱 0~20 min: 10%~15% B; 20~30 min: 15%~70 % B; 30~32 min: 70% B; 32~35 min: 10% B; 流速为0.25 mL·min-1; 进样量为1 μL。质谱条件: 毛细管电压: 2.8 kV,锥孔电压: 20 V,二级锥孔电压: 5 V,离子源温度: 100 ℃,脱溶剂温度: 250 ℃,脱溶剂气 (N2) 流速: 600 L·h-1,锥孔气 (N2) 流速: 38 L·h-1。ESI+模式检测,质量扫描范围: m/z 200~800,二级串联质谱碰撞能量: 30 eV。
对照品溶液的制备取13种对照品各约6.5 mg,精密称定,分别置10 mL量瓶中,以甲醇溶解并稀释至刻度,即得各对照品储备液。精密量取13种对照品储备液各1 mL混合,摇匀,即得混合对照品溶液Mix-13 (50 µg·mL-1)。
供试品溶液的制备将附子药材粉碎,过3号筛,取粉末约1 g,精密称定,加甲醇-氨水 (50∶2) 20 mL,密塞,放置过夜,超声处理30 min,滤纸滤过,50 ℃以下旋蒸挥干,残留物加0.1 mol·L-1盐酸溶液溶解 并转 移至锥形瓶中,得约10 mL附子酸水溶液。将固相萃取小柱依次以甲醇、水活化,加附子酸水溶液样品,流速控制在约1.0 mL·min-1,再依次以水、甲醇-水 (1∶1) 溶液洗脱,最后以氨水-甲醇 (5∶95) 溶液10 mL淋洗并进行收集。将收集的洗脱液于50 ℃减压挥干,残渣以10 mL甲醇溶解后离心 (8 000 r·min-1,10 min),取上清液进行UPLC-MS分析。
离体蛙心灌流实验待测样品配制成浓度约为0.01 mol·L-1的水溶液。参考文献[19]所述方法对13种胺醇型二萜生物碱和去乙酰毛花苷注射液进行离体蛙心灌流实验,测试其强心活性,以蛙心平均振幅增长率 (%) 进行评估。
结果与讨论 1附子中胺醇型二萜生物碱的鉴别在选定的色谱条件下,总分析时间为35 min,各成分均能得到良好的分离。根据出峰的先后顺序对 附子样品总离子流图中的各色谱峰进行编号。附子样品和混合对照溶液的总离子流图 (TIC) 见图 2。在 正离子扫描模式下,所有的化合物均产生高丰度的[M+H]+准分子离子。从附子样品的TIC图谱中可见,共分离41种成分,一级质谱数据见表 1。通过与对照品的保留时间和质谱数据进行对比鉴定了其中最主要的13个成分。峰4 (tR = 2.97 min) 的MS图谱中分子离子峰m/z 502.57。峰10~12 (tR = 6.65、6.91和7.70 min) 的分子离子峰分别为m/z 486.50、378.33和408.51。峰14~16 (tR = 9.78、10.69和13.47 min) 的分子离子峰分别为m/z 500.49、500.43和470.37。峰18~22 (tR =15.00、15.55、16.72、17.94和18.92 min) 的分子离子峰分别为m/z 454.43、484.42、438.43、484.49和422.43。附子样品总离子流色谱图中的13个主要色谱峰 的保留时间和质谱数据与混合对照品溶液的总离子流色谱图中相应色谱峰的数据一致。以上13个色谱峰可确定为北乌宁、中乌宁、多根乌头碱、异塔拉定、乌头原碱、8-甲氧基中乌宁、次乌宁、附子灵、3-去氧乌头原碱、尼奥灵、8-甲氧基次乌宁、塔拉萨敏、查斯曼宁。对这13个色谱峰进行二级串联质谱分析,得到的碎片离子结果见表 1,胺醇型二萜生物碱的二级串联质谱一般规律是失去一个或多个H2O (-18) 或CH3OH (-32) 分子。
对附子样品中其他色谱峰进行二级串联质谱分析,因有些成分含量低,没有检测到二级串联质谱的碎片离子。分析一级和二级串联质谱数据,与文献报道进行比对,初步确认了其他8个色谱峰的归属,即峰3、7、8、17、25和34~36依次为10-羟基多根 乌头碱 (karakolidine)、9-羟基森布星甲 (9-hydroxysenbusine A)、16β-hydroxycardiopetaline、10-羟基塔拉萨敏 (10-hydroxytalatisamine)、翠雀碱 (delphinine)、苯甲酰次乌头原碱 (benzoylhypaconine)、苯甲酰乌 头原碱 (benzoylaconine)、苯甲酰去氧乌头原碱 (benzoyldeoxyaconine)。其中前4个成分是胺醇型二萜生物碱,二级串联质谱为失去一个或多个H2O或CH3OH分子,符合胺醇型二萜生物碱二级串联质谱的一般规律。另外,有些化合物产生了相同的分子离子峰,例如峰6和11,峰17、20、23和26,这表明峰6和多根乌头碱为同分异构体,峰23和26与尼奥灵和10-羟基塔拉萨敏为同分异构体。可推测,这3个成分 (峰6、23、26) 也为胺醇型二萜生物碱,仅仅是 -OH或 -OCH3取代位置不同。根据以往诸多文献所报道的关于C19-二萜生物碱的化学信息,胺醇型二萜生物碱的相对分子质量一般小于500。除以上已确定的20个成分为胺醇型二萜生物碱外,还有11个成分的相对分子质量小于500,极有可能是胺醇型二萜生物碱。综合以上数据,表明附子中含有至少20种胺醇型二萜生物碱。
2七批附子样品中胺醇型二萜生物碱分析七批附子样品中相同保留时间色谱峰的质谱数据一致,表明七批附子所含主要化学成分种类相同。各批附子中均检出胺醇型二萜生物碱,但由于炮制方法不同,各成分的相对含量差别较大。黑顺片 (C~E) 中的中乌宁、次乌宁、附子灵和尼奥灵为主要成分,TIC图中相应色谱峰具有较高的丰度。白附片 (A,B) 中则含有较大量的中乌宁和附子灵。而盐附子 (F~G) 中含量较高的为附子灵和3-去氧乌头原碱。北乌宁和多根乌头碱在所有批次中含量均较低甚至未检出。以上结果表明不同产地和不同炮制方法制备的附子中含有大量的胺醇型二萜生物碱且生物碱的种类具有高度相似性,但不同样品中各成分的相对含量差别较大。
3胺醇型二萜生物碱的强心作用采用离体蛙心灌流实验对胺醇型二萜生物碱的强心作用进行研究,测定了13种胺醇型二萜生物碱,每个化合物平行测定两次。对心脏的作用效果采用 蛙心的平均振幅增长率 (%) 进行评估,根据其值大小将强心作用分为以下4类: 0~15% (-,无); 16%~30% (+,中等); 31%~60% (++,显著); >60% (+++,强)。测定结果见表 2,结果显示北乌宁和中乌宁具有强活性,多根乌头碱、异塔拉定、乌头原碱、次乌宁和3-去氧乌头原碱有中等活性。同时发现在反相色谱上表现为强极性的化合物其强心作用较强。
为确定附子中的强心有效成分,本文建立了分离检测附子中胺醇型二萜生物碱的UPLC-MS法,测定了7批附子样品,并对其中的成分进行了强心活性研究。分离并检测到附子提取物中的41种成分,其中至少20种为胺醇型二萜生物碱。不同产地、不同炮制方法的附子所含成分的种类高度相似,但各成分的含量差别较大。离体蛙心灌流实验结果表明,13种被测胺醇型二萜生物碱中有6种具有明显的强心作用,其强心活性大小极有可能与化合物的极性有关。综合以上结果,本文认为附子中含有的多种胺醇型二萜生物碱是其强心活性成分。
[1] | Rao MR. Study on cardiac action of Chinese Aconite [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 1966, 13: 195-203. |
[2] | Kosuge T, Yokota M. Letter: Studies on cardiac principle of aconite root [J]. Chem Pharm Bull, 1976, 24: 176-178. |
[3] | Konno C, Shirasaka M, Hikino H. Cardioactive principle of Aconitum carmichaelii roots [J]. Planta Med, 1979, 35: 150-155. |
[4] | Chen DH, Liang XT. Studies on the constituents of Lateral Root of Aconitum carmichaeli Debx. (FUZI) Ⅰ. Isolation and structural determination of salsolinol [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 1982, 17: 792-794. |
[5] | Han GY, Liang HQ, Liao YZ, et al. A new cardiac principle isolated from Jiangyou Fuzi (Aconitum carmichaeli Debx.) [J]. Acad J Sec Mil Med Univ (第二军医大学学报), 1991, 12: 10-13. |
[6] | Han GY, Liang HQ, Zhang WD, et al. Studies on the alkaloids and a new cardiac principle isolated from Jiangyou Fuzi (Aconitum carmichaeli Debx.) [J]. Nat Prod Res Dev (天然产物研究与开发), 1997, 9: 30-34. |
[7] | Xu TH, Zhao HF, Xu YJ, et al. Cardiotonic constituents of Aconitum carmichaeli [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2004, 35: 964-966. |
[8] | Huang TK. Handbook of Composition and Pharmacological Action of Commonly-used Traditional Chinese Medicine (常用中药成分与药理手册) [M]. Beijing: China Medical Science Press, 1994: 921. |
[9] | Liu XX, Chao RB. Determination of alkaloids in Radix Aconiti Lateralis Praeparata by RP-ion-pair HPLC [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2006, 41: 365-369. |
[10] | Xie Y, Jiang ZH, Zhou H, et al. Simultaneous determination of six Aconitum alkaloids in proprietary Chinese medicines by high-performance liquid chromatography [J]. J Chromatogr A, 2005, 1093: 195-203. |
[11] | Wang Y, Liu ZQ, Song FR, et al. Electrospray ionization tandem mass spectrometric study of the aconitines in the roots of aconite [J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2002, 16: 2075-2082. |
[12] | Li R, Wu ZJ, Zhang F, et al. Differentiation of three pairs of aconite alkaloid isomers from Aconitum nagarum var. lasiandrum by electrospray ionization tandem mass spectrometry [J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2006, 20: 157-170. |
[13] | Yue H, Pi ZF, Song FR, et al. Studies on the aconitine-type alkaloids in the roots of Aconitum carmichaeli Debx. by HPLC/ESIMS/MSn [J]. Talanta, 2009, 77: 1800-1807. |
[14] | Wu W, Liang ZT, Zhao ZZ, et al. Direct analysis of alkaloid profiling in plant tissue by using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry [J]. J Mass Spectrom, 2007, 42: 58-69. |
[15] | Hu R, Zhao J, Qi LW, et al. Structural characterization and identification of C19-and C20-diterpenoid alkaloids in roots of Aconitum carmichaeli by rapid-resolution liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry [J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2009, 23: 1619-1635. |
[16] | Zhang J, Huang ZH, Qiu XH, et al. Neutral fragment filtering for rapid identification of new diester-diterpenoid alkaloids in roots of Aconitum carmichaeli by ultra-high-pressure liquid chromatography coupled with linear ion trap-orbitrap mass spectrometry [J]. PLoS One, 2012, 7: e52352. |
[17] | Zhou SS, Ma ZC, Liang QD, et al. UPLC/Q-TOF-MS based chemical profiling approach to evaluate chemical composition of augmentation toxicity in combination of Radix Aconiti and Pinellia Praeparata [J]. Acta Chim Sin (化学学报), 2012, 70: 284-290. |
[18] | Liu XX, Jian XX, Cai XF, et al. Cardioactive C19-diterpenoid alkaloids from the lateral roots of Aconitum carmichaeli "Fu Zi" [J]. Chem Pharm Bull, 2012, 60: 144-149. |
[19] | Ding H. Experimental Pharmacology (实验药理学) [M]. Beijing: Science Press, 2008: 504. |