药学学报  2014, Vol. 49 Issue (12): 1650-1657   PDF    
RNA-Seq与道地药材研究
王晓玥1, 宋经元1, 谢彩香1, 韩建萍1 , 陈士林2     
1. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193;
2. 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700
摘要:RNA-Seq是一种新崛起的转录组学研究方法, 利用新一代测序技术能够更为准确、快速地为人们提供更多的生物体转录信息, 已广泛应用于多种生物领域.道地药材以质优、疗效好的优势历来被各医家所推崇, 其道地性形成的根本是其基因型在特定时空表达的产物.因此通过转录组测序来解析其生物合成机制, 已成为当前药用植物次生代谢研究的热点.本文主要介绍了RNA-Seq技术及其优势, 并就其在道地药材形成机制研究方面的应用进行了讨论, 为今后该技术的研究与应用提供参考.
关键词RNA-Seq     道地药材     次生代谢    
RNA-Seq and genuine traditional Chinese medicine
WANG Xiao-yue1, SONG Jing-yuan1, XIE Cai-xiang1, HAN Jian-ping1 , CHEN Shi-lin2     
1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China;
2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
Abstract: RNA-Sequencing (RNA-Seq) is a newly-developed method in transcriptome research, it can afford more accurate transcription information and be more quickly by using Next-generation Sequencing (NGS) technology. RNA-Seq has been widely used in various biological fields. Genuine traditional Chinese medicines (TCM), with good quality and therapeutic effect, were always praised highly and used by famous physicians. The geo-herbalism formation of TCM is based on the product of the gene expression at specific space and time. So it has been a research hotspot to analyze the mechanism of biosynthesis through RNA-Seq in the study on the secondary metabolism of medicinal plant. This article mainly illustrates the RNA-Seq and its advantages, it also discusses the potential application in genuine TCM, and it can provide useful information for other researchers.
Key words: RNA-Seq     genuine traditional Chinese medicine     secondary metabolism    

道地药材是指在特定自然条件、生态环境的地域内所产的药材,由于其生长环境的特殊性,其品质优于同种其他地区的药材,且疗效好,为世人所公认且久负盛名[1]。优良的种质资源、适宜的生态环境、悠久的栽培生产加工技术和传统的文化理念等构成了中药材道地性理论发生与发展的基本要素。历代医家对中药性味的认识和运用都是基于道地药材,许多临床常用方剂的疗效也均是建立在道地药材的基础之上。因此道地药材的研究对继承和发扬中医药理论具有非常重要的意义。陶弘景的《本草经集注》中曾有云: “诸药所生,皆有境界”。此处境界指的便是药用植物的生长环境,说明道地药材与其产地有着相当密切的关系。据报道,国内市场出现多品种、大宗的劣质中药材,全都是因异地引种而造成的品质变异。其中5个大宗品种分别是黄芪 (东北、河北、山东等省区引种)、白芷 (河北安国引种)、天麻 (湖南、湖北、安徽等省区引种)、桔梗 (山东淄博地区引种) 和麦冬 (安徽、湖北等省区引种)[2]。这5种劣质药材,无论是药材和饮片的外观形、色、气、味等方面还是内在质量组织形态、有效成分含量以及流浸膏提取率等多项指标均与传统习用的道地药材差别很大。盲目引种扩种削弱了药材的道地性,导致药材品质大幅下降,为解决这一问题,国内学者基于道地产区气候特征开发了中药材产地适宜性分析地理信息系统 (TCMGIS-I),利用该系统分析了中药材的产地适宜性[3, 4, 5, 6, 7, 8],研究结果有效地指导了中药材生产的合理布局。

道地药材研究一直以来都是中药研究的热点问题之一,国内学者最先提出了本草基因组计划[9]和应用宏基因组的研究手段来研究道地药材[10],完成了药用模式物种灵芝的全基因组测序[11],同时开展了道地药材丹参和人参等的全基因组测序工作,为道地药材基因组学研究开辟了道路。近年来在道地药材有效成分与生态因子的相关性以及分子机制等方面已有多篇研究报道[12, 13, 14, 15, 16, 17]。如韩建萍等[18]应用AFLP技术分析了不同产地栀子的亲缘关系,证明道地性的产生是基因型和环境饰变共同作用的结果。谢彩香等[19]研究了人参皂苷与生态因子之间的相关性,发现了多个温度因子与人参皂苷含量呈强负相关性。黄林芳等[20]对肉苁蓉化学成分、分子地理标识及生态因子进行了研究; 基于PLS分析了石斛品质与生态因子的相关性[21]; 考察了羌活主产地生态气象因子对其主要化学成分含量的影响,探讨气象因子与羌活品质的关系[22],为不同生态区域中药生态型及品质变异的生物学本质提供了一种新思路[23]。中药材生态变异与生态型的分化和形成是物种对不同环境生态条件的长期适应与自然选择的结果。这种种内变异是中药材品质优劣和疗效差异的实质[23]。道地药材具有道地性的根本原因是药材基因型在特定环境中表达产生的次生代谢产物不同造成的。利用基因工程技术进行植物次生代谢的遗传改良、提高次生代谢物的含量、筛选和培育优质新品种是近年来国际生物学界研究的热点,故研究道地药材次生代谢物合成途径很有必要。RNA-Seq是一项新兴的转录组学研究方法,它突破了传统转录组学研究遇到的瓶颈,凭借其自身优势,现已在生物领域得到了广泛应用。本文将RNA-Seq技术与道地药材分子机制有机的结合起来,为进一步推动道地药材形成的分子机制的研究提供了参考。

1 RNA-Seq概述 1.1 转录组学

近年来,功能基因组学迅速发展,随着后基因组学时代的来临,转录组学、代谢组学、蛋白质组学等技术相继出现,转录组学的研究是其中应用最为广泛的技术之一[24]。转录组广义上是指某个物种或特定细胞类型在某个特定时间所有转录产物的集合,主要包括编码蛋白质的信使RNA (messenger RNA,mRNA) 以及非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA); 在狭义上仅指特定细胞在某一时间某一功能状态下所转录出来的全部mRNA的总和。转录组与基因组相比,定义中强调了时间和空间的限制,即使是同一细胞处于不同时期以及不同生长环境之下,其基因表达也不会完全相同。如将道地药材引种到其他地区种植,即使引种成功,某些基因也会产生差异性表达,导致药材产生的次生代谢物发生变化,药效亦与原产地道地药材不同。

基因测序技术尤其是高通量测序技术的蓬勃发展,使转录组学研究得到了革命性的进展[25, 26]。自2005年以来,以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术以及ABI (Apply Biosystems) 公司的SOLID技术为代表的第二代测序技术或称新一代测序 (next-generation sequencing,NGS) 技术应运而生, 且几个测序平台先后实现了商业化运营[27]。测序技术的飞速发展使得转录组学技术在生物领域得到了广泛的应用。转录组学研究方法主要有两类: 基于杂交技术的芯片技术,如cDNA芯片、DNA宏阵列以及寡聚核苷酸芯片; 基于直接测序与序列分析的技术,如基因表达序列分析 (serial analysis of gene expression,SAGE)、大规模平行信号测序系统 (massively parallel signature sequencing,MPSS)、表达序列标签技术 (expressed sequence tags,EST)、数字基因表达谱 (digital gene expression tag profiling,DGE) 以及最新发展起来的RNA-Seq技术等。

1.2 RNA-Seq技术原理及优势

RNA-Seq (数字基因表达谱升级版) 是新崛起的转录组学研究技术,用来研究某一生物对象在特定生物过程中基因表达差异,该技术结合了转录组测序建库的实验方法与数字基因表达谱 (digital gene expression profiling,DGE) 的信息分析手段,可以从整体上对参与生长发育和次生代谢基因进行系统的研究。通过构建药用植物不同组织部位、不同生长时期的转录组文库,可以全方位地研究生物体基因在不同时期、不同发育状态下的表达水平,从而有效地发掘和鉴定次生代谢产物生物合成及调控相关的基因。目前,该技术已被用于分析表达谱、鉴定差异表达基因[28, 29]

RNA-Seq比以往任何转录组分析方法都有优 势[28, 29, 30] (几种转录组分析方法见表 1): ① 过程中没有克隆步骤,故需要RNA样品较少,降低了测序的成本以及复杂性,并极大地增加了覆盖深度; ② 无需利用已知序列注释来预先设计特异性探针,而采取直接测序的方式,故不需要有基因组序列信息,可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析; ③ 对表达存在差异的基因能够灵敏的检测其表达差异,能够检测出低丰度的表达基因; ④ 采用数字化信号,具有单核苷酸分辨率的精确度,可以揭示单碱基变异SNP(单碱基核苷酸多态性),同时避免了传统微阵列杂交技术的荧光信号所带来的背景噪音与交叉反应的问题。相比基因芯片来讲,RNA-Seq几乎没有任何背景信号,对表达水平检测达到与定量反转录聚合酶连锁反应 (quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 一样准确[31]。另外,RNA-Seq技术具有通量高、可重复性高、检测范围宽、定量准等特点。

表 1 几种主要转录组学研究方法比较[28, 29, 30]

RNA-Seq的优势不仅局限于已知基因组序列信息的物种,对于未知基因组序列的物种也同样适用。数字基因表达谱 (DGE) 的原理与RNA-Seq相同,但是所要求的读长更短,适用于基因表达差异的研究。RNA-Seq采用转录组建库流程,可以最大限度的获取样品中的所有带有poly (A) 的转录本信息,而DGE检测到的转录本或基因必须包括CATG这4个碱基的识别位点,对不含该位点的基因无法检测到。因此RNA-Seq比DGE检测的基因数目更多,定量更准确,且DGE只能分析真核生物的基因表达情况,RNA- Seq可以通过去除rRNA的办法分析原核生物的基因表达情况。RNA-Seq通过构建药用植物不同组织部位、不同生长时期的转录组文库,可以全方位地研究生物体基因在不同时期、不同发育状态下的表达水平,通过比较分析基因表达谱,可以从整体水平研究道地药材生物合成机制,并可有效地发掘新的基因或转录本。因此,利用RNA-Seq技术挖掘参与次生代谢产物生物合成的基因信息是一个有利的选择。

1.3 RNA-Seq技术基本步骤

首先,提取RNA并进行高通量测序: 分别提取各不同样品的总RNA,使用poly (T) 寡聚核苷酸分离得到编码基因所转录的带poly (A) 的mRNA,使用随机引物和反转录酶反转录成cDNA,随机打断制备均一的cDNA文库,并使用高通量测序技术进行测序。

其次,进行序列组装及分析: 使用Newbler或celera等软件将测序结果组装成contig序列。通过搜索已知核酸和蛋白数据库进行序列注释。用soap软件将测序后的数据比对到参考基因或参考基因组上,比对后的数据进行过滤,统计过滤后数据信息并计算基因的表达量、覆盖率、长度等,查看reads在参考基因组上的分布情况,计算不同样本之间基因表达量的相关性,在不同样本之间筛选差异基因,对筛选出来的差异基因进行聚类分析、GO功能富集分析和Pathway功能富集分析。

然后,对差异表达基因进行数目统计: 使用RPKM (Reads per kb per million reads) 法计算Unigene的表达量,RPKM法可以消除基因长度和测序量差异对计算基因表达量的影响,计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。利用RPKM法对各样品相应基因的表达量进行分析,筛选出差异表达基因,如果一个基因存在多个转录本,则用该基因的最长转录本计算其测序覆盖度和表达量。

最后,对差异基因进行表达模式聚类分析: 使用cluster软件,以欧式距离为距离矩阵计算公式,对差异表达基因进行聚类分析。

1.4 RNA-Seq在生物领域中的应用

随着高通量测序技术的发展,RNA-Seq已广泛应用到医学、生态学、药用植物等多个研究领域。Mizrachi等[32]应用RNA-Seq技术对桉树进行转录组测序,分析木质素含量高的组织与无木质素的组织间基因表达差别,并对表达差异基因进行比对分析。Zhang等[33]应用RNA-Seq技术探讨了盐胁迫下黄瓜侧根发育的分子机制。Villar等[34]通过RNA-Seq技术对不同基因型 的桉树在水分胁迫后的基因表达差异进行了分析。张婷等[35]对多年生长雄野生稻耐冷及冷敏感品种进行比较转录组学分析,发现了大量基因型特异、时空特异的冷胁迫相关基因及调控路径。刘寒强等[36]利用RNA-Seq技术从基因表达水平等方面对HBV相关肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC) 的转录组进行了全面分析,为阐明其分子病理机制提供了重要线索; Ferreira De Carvalho等[37]对盐泽地生存能力不同的互花米草和海岸米草的根和叶的转录组进行比较,鉴定2个物种内与盐胁迫、氧化胁迫等相关的基因,并根据2个物种与其他杂交种基因表达差异,筛选与生态适应能力相关的基因; Tao等[38]对营养胁迫下浮萍的高淀粉积累机制进行了比较转录组学研究。由上述可以看出,RNA-Seq技术虽然是刚刚起步,但是技术本身的优势已显现出来,正在以惊人的速度应用于生命科学各领域。

2 RNA-Seq在道地药材研究中的应用 2.1 转录组测序在道地药材次生代谢产物生物合成和代谢途径中的应用

道地药材的道地性是基因型与其生活的特定自然条件相作用的结果,是某个特定时空的反应。而其中主要药用成分为药材在生长发育和适应生长环境过程中,受到环境中特定因子的诱导产生的一类次生代谢产物 (secondary metabolism),这类物质是其药材品质鉴定的重要指标之一,也是其药材的物质基础。道地药材次生代谢产物生物合成途径十分复杂,既受到其自身遗传因素控制,也与环境中各种生物及非生物因子的诱导有关[39]。植物次生代谢物涉及范围较广,种类繁多,现已被发现的有黄酮类、酚类、香豆素等。多数次生代谢物结构复杂,难以通过化学合成方法大量获得,通过基因工程手段提高植物源次生代谢物的含量为今后解决道地药材资源紧缺问题提供了可能。

通过调节关键酶基因的表达可以激活特定代谢支路中多个基因的协同表达,从而调节特定次生代谢物的合成。如吲哚生物碱合成过程中的关键酶——异胡豆苷合成酶 (strictosidine synthase,STR) 能催化裂环马钱子苷 (secologanine) 和色胺 (tryptamine) 生成异胡豆苷,将异胡豆苷合成酶基因 (STR) 在大肠杆菌 (Escherichia coli,E.coli) 昆虫培养细胞和植物中表达,可产生大量的吲哚生物碱[29]。通过对次生代谢物合成途径关键酶基因的功能解析,将为推进道地药材的遗传改良打下基石,为利用生物技术手段生产次生代谢产物奠定理论基础。目前,多种次生代谢物生物合成途径尚不明确,合成过程中涉及到的酶及代谢途径中间体的基础性研究较少,缺乏对其代谢途径的整体研究。

随着新一代测序技术的快速发展,高通量测序技术被广泛用于非模式植物的分子生物学研究,其中通过转录组测序来挖掘药用植物特有生物合成关键酶的基因,解析其生物合成机制,已成为当前道地药材功能基因研究的发展趋势。孙超等[40]通过西洋参转录组测序,结合荧光定量PCR技术,挖掘西洋参皂苷合成相关基因,鉴定了一批与皂苷合成相关的糖基化和P450基因。由于药用植物基因组的复杂性及其表达调控方式的多样性,单纯利用荧光定量PCR分析技术已经难以对高通量测序获得的生物合成基因进行批量分析,从技术上制约了生物合成途径代谢调控基因的挖掘和鉴定。目前,陈士林等[41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51]采用高通量测序技术已经对人参 (Panax ginseng)、西洋参 (P. quinquefolius)、三七 (P. notoginseng)、东北红豆杉 (Taxus cuspidata)、银杏 (Ginkgo biloba)、喜树 (Camptotheca acuminata)、丹参 (< i>Salvia miltiorrhiza) 等主要药用植物的大规模转录组研究,发现200多个参与生物碱、萜类、黄酮、酚酸类骨架合成相关的酶基因,及2 000多个参与上述化合物骨架修饰的修饰酶候选基因; 并对5年生甘草 (Glycyrrhiza uralensis) 营养器官的转录组进行测序,获得59 219条原始序列,序列平均长度409 bp,与GenBank甘草EST合 并拼接,获得27 229条独立基因。通过生物信息学 分析获得了参与甘草酸合成途径中18个步骤中的16个关键酶基因,此外还发现细胞色素P450序列125条,糖基转移酶关键基因172条[52]。利用高通量测序技术对川贝母 (Fritillaria cirrhosa) 进行了转录组研究,获得了 45 073条单一序列。发现了许多编码川贝母生物碱生物合成途径关键酶的相关基因,包括编码参与甲羟戊酸 (MVA) 途径所有酶和可能对下游反应进行修饰的酶的相关基因[53]。魏来等[54]建立了MeJA诱导人参悬浮细胞皂苷生物合成24 h的比较转录组图谱,筛选差异表达基因72个,为下一步鉴定与克隆人参皂苷生物合成相关基因提供了重要的实验依据。Soetaert等[55]通过高通量测序技术对黄花嵩 (Artemisia annua) 转录组进行研究,发现了控制青蒿素产量的关键数量性状基因。吴宏清等[56]利用RNA-Seq技术对国产沉香各组织进行数据基因表达谱分析,结果表明结香组织与白木组织基因表达差异明显。该技术作为道地药材功能基因组研究的重要手段在发现次生代谢产物生物合成关键酶基因、阐明生物合成途径及调控机制等方面发挥着重要作用。

2.2 利用RNA-Seq研究道地药材形成的分子机制

从道地产区和非道地产区药材特定时期和特定部位取样,提取总RNA进行RNA-Seq测序,将两种样 本的测序结果序列进行比对可以筛选出代谢相关的差异表达基因 (包括有效成分关键合成酶表达、转录调控等差异),具体流程如图 1所示。应用RNA-Seq技术检测同一时期道地药材和非道地药材的差异表达基因,并进行表达模式聚类分析、GO功能分析和pathway显著性富集分析,以次生代谢途径为主线,揭示这些基因的表达规律和功能特点,多路径筛选鉴定与道地性相关的差异表达基因。将同一时期道地药材和非道地药材次生代谢途径的差异表达基因与主要药效成分进行关联分析,揭示基因表达量与药效成分含量之间的相关性。运用RNA-Seq的研究手段对道地药材的分子机制进行研究,可以得到样品间的表达差异,准确、灵敏的捕捉到不同样品间代谢途径相关的差异表达的基因,揭示药材道地性形成的内在机制,并为进一步研究提供证据。已有较多报道利用RNA-Seq研究作物在不同环境条件下的差异表达基因,阐释了次生代谢产物的形成机制。如Lei等[57]应用比较转录组学分析了烟草不同栽培地区的差异表达基因,阐明了芳香类胡萝卜素在烟草中的形成机制。Koenig等[58]应用RNA-seq对野生和家种番茄的转录组进行了比较,发现50个与环境胁迫相关的基因,环境因子在基因表达过程中的作用被突现出来。以上所述均为日后利用RNA-Seq研究道地药材形成的分子机制提供了指导。

图 1 RNA-Seq在道地药材形成机制研究应用中的技术路线图
3 展望

近20年来,我国先后对常用道地中药的品种与质量开展了较为深入系统的研究,分别对大约300种中药材进行了包括品种考证、生态、性状、显微特征、理化特性、化学成分、药理、质量控制等方面的系统研究。尤其是“九五”、“十五”期间,国家通过“973”计划、“863”计划、国家攻关计划、公益性研究专项、科技资源平台建设专项、自然科学基金等计划支持了部分道地中药材的研究与创新,对道地中药材品种规范化种植关键技术、中药材现代质量标准、中药化学对照品、中药材和中药饮片等有害物质限量标准进行了研究,涉及了中药材的种质、生态、环境、生理、栽培、加工,以及化学、药理、质控等方面的内容。这些研究为揭示中药道地性的实质,规范道地中药材的生产和质量控制奠定了基础。近年来,运用现代科学技术的理论、方法和手段对“中药道地性”进行研究,已取得了一些成绩,但并没有真正阐明“中药道地性”的科学内涵。

RNA-Seq作为一项新崛起的转录组学研究方法,已显示其无可比拟的优越性能,广泛应用于生命科学各个领域,使生命科学的研究得到了前所未有的巨大发展。道地药材所产生的次生代谢产物是其物质基础,同样为其道地性的根本。利用RNA-Seq技术可捕捉到道地药材与非道地药材不同样品间差异表达的基因,从整体上对参与生长发育和次生代谢基因进行系统的研究,进一步阐释药材道地性形成的分子机制,将为道地药材的研究开辟新的道路。

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