药学学报  2014, Vol. 49 Issue (11): 1621-1624   PDF    
含有机硼的小分子药物硼替佐米
郭宗儒    
中国医学科学院药物研究所, 北京 100050
1 靶标: 蛋白酶体的确定

蛋白酶体 (proteasome) 是具有多元催化作用的蛋白酶,广泛存在于哺乳动物胞浆与核内,通过对蛋白分子的水解,将受损伤的、被氧化的或错误折叠的蛋白质降解,调节细胞周期和凋亡。构成蛋白酶体的催化核心是20S多亚基复合物,分子质量大约为700 kDa。例如从酵母中分离的蛋白酶体的晶体结构表明是由28个蛋白亚基 (α1~α7,β1~β7)2构成,成为4个叠合环形成的颗粒,活性中心在颗粒的内部,底物经窄长的通道进入 (Groll M,et al. Nature,1997,386: 463-471)。蛋白酶体与细胞内NF-κB信号传导途径密切相关,由于NF-κB在炎症过程以及肿瘤细胞的发生和发展中扮演重要角色,干扰NF-κB活化过程,可间接或直接地阻断炎症和促成肿瘤细胞的死亡。所以蛋白酶体是研发抗炎和抗肿瘤药物的靶标。 2 先导物三肽醛的确定

最早以蛋白酶体为靶标研究药物的是哈佛大学的Goldberg博士,在研究蛋白酶体抑制剂对细胞生长和增殖以确定其催化功能的过程中,发现了抑制剂三肽化合物苄氧羰-亮氨酰-亮氨酰-亮氨醛 (1,MG-132)。Tsubuki等用化合物1对小鼠PC12细胞进行神经生长的研究,在最适浓度30 nmol·L-1下,可引起PC12细胞的神经生长,1抑制蛋白酶体的活性Ki = 4 nmol·L-1 (Tsubuki S,et al.Biochem Biophys Res Commun,1993,196: 1195-1201)。进而Adams等合成了1的类似物苄氧羰-亮氨酰-亮氨酰-亮氨酰-4-甲基香豆素-7-酰胺(2),去除了醛基,化合物2成为蛋白酶体的底物,从而证明了蛋白酶体参与了调节PC12细胞的神经纤维的生长,确定了蛋白酶体的功能,同时也发现了抑制蛋白酶体的先导化合物。显示了化学生物学确定靶标的功能和发现苗头 (先导) 化合物的一石二鸟作用。

化合物1与蛋白酶体的复合物单晶结构分析表明,它连接在活性中心β亚基的N端(Lowe J,et al. Science,1995,268: 533-539),醛基与苏氨酸残基的羟基发生亲核加成,生成具有共价键结合的半缩醛,虽然是可逆性结合,但酶的活性受到强效抑制。 3 先导物的优化 3.1 三肽侧链的变换

化合物1的结构域P1、P2 和P3都是异丁基,变换这些疏水片段以优化抑制活性,发现P1位置仍以异丁基为最佳,P2和P3分别 变换为萘基,增强了活性,例如化合物3Ki = 0.24 nmol·L-1,4Ki = 0.015 nmol·L-1,提示增加P2和P3结构域的疏水性有利于提高活性。

3.2 亲电基团的优化: 醛基的变换

醛基的化学性质活泼,可与亲核基团发生加成反应,例如与氨基形成西佛碱,也容易被氧化。化合物1虽是蛋白酶体的强效抑制剂,但选择性不高,例如对组织蛋白B (cathepsin B) 和钙蛋白酶 (calpain) 也有抑制作用。而且由于醛基的吸电子效应,使α位H呈弱酸性,可发生互变异构,导致P1侧链的构型不能固定。此外,化合物1代谢不稳定性和较低的生物利用度,使其体内活性不佳。

为了克服醛基的缺陷,将用于设计酶抑制剂的其他亲电性基团替换醛基,例如常用于丝氨酸蛋白酶抑制剂的氯甲基酮和三氟甲基酮替换醛基,然而化合物56却未显示出活性。苯并噁唑酮 (7) 和二酮酯 (8) 显示的活性低于化合物1。用硼酸置换醛基得到的化合物9,活性显著提高,强于先导物1大约100倍。硼元素处于周期表第3族,外层电子有一p空轨道,可与O和N的孤电子对形成配位键。化合物9与蛋白酶体的活性中心N端的苏氨酸侧链的羟基发生特异性配位结合,而抑制组织蛋白酶B的活性很低,Ki = 6 100 nmol·L-1,弱于蛋白酶体20万倍。这是因为硼酸难于与半胱氨酸蛋白酶的巯基结合,因为B←S配位键不稳定,成为三肽硼酸具有选择性抑制蛋白酶体的重要依据。表 1列出了含有不同亲电基团的化合物结构及其活性。

表 1 化合物159的化学结构和与蛋白酶体结合的离解常数
3.3 降低分子尺寸: 二肽硼酸的设计与硼替佐米

三肽硼酸9抑制蛋白酶体的活性达到1×10-11 mol·L-1,这样高的活性意味着为改善成药性而变换结构可有较大的结构空间和余地,例如降低三肽的分子尺寸。其实,减少一个氨基酸残基成二肽醛 (10),仍有抑制蛋白酶体活性,Ki = 1 600 nmol·L-1,而且对丝氨酸蛋白酶不显示活性,提示二肽醛仍具有选择性作用,尤其是当P2结构域为萘环时,化合物11的活性提高,Ki = 97 nmol·L-1。而当化合物1011的醛基被硼酸基替换,活性和选择性显著提高,化合物1213Ki值为0.62和0.18 nmol·L-1。由三肽 9 (MW = 491) 简化为二肽12 (MW = 384),相对分 子质量降低了107,活性虽然有所减小,但仍呈现高活性,而且对人的其他蛋白酶如白细胞弹性酶、凝 血酶和组织蛋白酶等活性很低,表明对蛋白酶体 具有高选择性抑制作用。由于化合物12具有优良的活性和成药性,确定为候选化合物,命名为硼替佐米 (bortezomib),经临床前和临床研究,硼替佐米于2003年FDA批准上市治疗多发性骨髓瘤 (Adams J ,et al. Bioorg Med Chem Lett,1998,8: 333-338)。

4 转化研究: 基础研究—应用研究组织管理的互动

从1993年Goldberg开始以蛋白酶体为靶标研究药物到2003年FDA批准硼替佐米上市,用了10年时间完成了一个首创药物的研发链,这其中有许多值得总结的经验,也彰显了新药研究的许多不确定性。 4.1 研发目标不断的变换

Goldberg是在哈佛大学从事蛋白酶体研究的学者,预见到可研发新药的潜在用途,1993年与哈佛同事找到投资公司HealthCare Ventures,吸纳了外部有研发药经验的专家 (如聘用CEO和药物化学家) 组建了公司,旨在干扰泛素-蛋白酶体途径阻止肌肉蛋白的降解,治疗肌肉萎缩 (cachexia),因而公司名称为Myogenics。该公司的特点是有深厚的学术研究背景,紧密地与基础研究结合。公司允许其他大学的学者自由地使用合成的化合物进行学术研究,这种开放型的研究,很快发现了抑制剂的作用特点: 在动物体内并不立刻干扰正常的细胞周期; 蛋白酶体对激活NF-κB的功能起重要作用,而后者又参与了炎症反应,揭示了抑制剂干预炎症的可能性。由于抑制剂对大鼠关节炎模型的显著抑制作用,公司将研究目标转向为治疗风湿性关节炎,因而改名为ProScript。1994年又以蛋白酶体为靶标启动了抗肿瘤药物的研究。这样不断地改变研究方向,导致公司内部的不断调整,引起内部关系的紧张。1995年公司与某肿瘤研究所合作,对合成的化合物开展了在酶、细胞和小鼠水平上的活性评价。 4.2 与大公司的合作

1997年,以硼替佐米为代表的二硼酸肽化合物显示出优良的抗肿瘤作用,并颠覆了因杜邦/默克曾研究丝氨酸蛋白酶抑制剂治疗肿瘤而夭折 (终止于II期) 导致硼酸类药物的负面名声,一些大药厂在此之前就与ProScript合作,例如1995年与Hoechst Marion Roussel (HMR) 签订合作开发口服抗炎和抗肿瘤药物协议(3 800万美元),一年后与Nippon Roche签订开发治疗肌萎缩药物 (2 000万美元),弥补了资金的缺乏。 4.3 与政府部门和大学的合作

1996年ProScript 与美国国家肿瘤研究所 (NCI) 合作,对大量的肿瘤细胞系进行研究后,公司决定将研发重点转移到抗肿瘤领域 (仍继续抗炎研究),硼替佐米在动物模型上获得良好的结果,因而得到了NCI的基金资助以及纪念Sloan-Kettering癌症中心 (MSKCC) 和北卡大学 (UNC) 资助,进行了I期临床研究,并获得满意结果。 4.4 被大公司兼并

以硼替佐米为代表的蛋白酶体抑制剂在动物抗炎 (风湿性关节炎) 和抗癌作用、以及临床I期 (血液病) 的效果虽然令人兴奋,但它的治疗指数 (窗口) 不宽,作为长期用药仍有风险,以至于合作方不看好硼替佐米的前景,投资公司HMR终止合作停止了资助,50个与ProScript合作的公司也纷纷失去了兴趣。到1999年ProScript到了濒临资金短缺无法开展硼替佐米II期临床研究的境地。投资方以270万美元将ProScript卖给了LeukoSite公 司,三个月后Millennium公司以6.35亿美元收购了LeukoSite,收购原因并不是因为硼替佐米项目,而是LeukoSite的其他项目。 4.5 转化研究促进了硼替佐米的成功

ProScript公司这样被卖来卖去遭到很大的挫折,但该团队没有放弃。药化专家Adams以一位患有多发性骨髓瘤的女患者使用硼替佐米治疗后所有症候消失的病例为契机,说服了Millennium的CEO,公司遂将硼替佐米作为优先研发的项目,并与多发性骨髓瘤专家Anderson合作,开始了II期临床研究。通过公司与临床之间的交换数据和意见,探索了多发性骨髓瘤对硼替佐米敏感性的机制,通过基础研究—临床设置—患者反馈—基础研究的循环,对发病和治疗的分子机制有了深入的认识。此外,公司还与国际多发性骨髓瘤基金会联系,使硼替佐米项目得到更大的支持,加速了项目的成功。硼替佐米作为以蛋白酶体为靶标的首创药物,也是第一个问世的含有机硼酸的小分子化合物,硼酸特异性地与蛋白酶体的重要残基发生共价键结合,是硼替佐米高选择性的结构基础。在不断地改换研究目标和研究缺乏资金的条件下,用10年时间得以研发成功,一个重要的因素是基础研究—应用研究—临床实践的紧密结合和互动反馈,转化研究在成功的道路上起到促进作用 (Sánchez-SerranoI. Nat Rev Drug Discov,2006,5: 107-115)。