2. 南京中医药大学 药学院, 江苏省植物药深加工工程研究中心, 江苏 南京 210023
2. Jiangsu Botanical Medicine Refinement Engineering Research Center, College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
汉防己甲素 (tetrandrine,TET) 能有效的抗炎、降血压、抗肺癌和矽肺[1],但存在服用剂量大、生物利用度低等缺点。近年来,在提高其生物利用度方面出现了很多新剂型,如乳剂[2]、固体脂质纳米粒[3]、脂质体[4]和微球等[5],但以注射给药为主。本文以肺靶向吸入给药为研究目标,利用快速膜乳化技术将其制备成PLGA纳米粒,再利用喷雾干燥技术将其制备成微米级的纳米复合粒子。
肺部吸入给药可有效实现肺靶向给药、大分子 给药和全身给药,具有良好的发展和应用前景。肺内吸收面积大 (成人肺内面积约为140 m2),而且毛细血管的上皮细胞膜与肺泡的上皮细胞膜是紧紧贴在一起的,总厚度仅0.5~1 μm[6],因此肺部对药物有极薄的吸收屏障。对于肺部疾病,肺部给药能直接将药物输送到病灶区,减少给药剂量和在其他组织中的分布,提高了疗效,降低了全身毒副作用,优于其他给药方式。药物包载于载体之中,如微球、纳米粒和脂质体能够保护药物不被酶降解和控制药物的释放,从而提高药物的生物利用度[7,8],肺部吸入纳米粒后,可以克服呼吸道的黏毛清除[9],同时能逃过肺泡巨噬细胞的吞噬,从而被癌细胞或上皮细胞等摄取[10,11,12,13]。然而,单纯的纳米粒吸入后,大部分将随气流呼出,只有少数沉降。1 μm以下颗粒由于低惯性的原因,会随气流被呼出体外,通常有80% 被排出,基本不能在呼吸道沉积[14]。肺部吸入粒子的理想粒径为1~5 μm,其中,粒径在1~2 μm时,肺部对其吞噬作用最为显著,当粒子的几何粒径更大或更小时,吞噬作用减弱[15,16,17]。肺泡中的粒子粒径应小于1 μm[18],才能避免巨噬细胞的吞噬。为了克服纳米粒的粒径较小不适合肺部给药,同时利用其能够逃避肺泡巨噬细胞吞噬、增加癌细胞摄取的优点。本文以汉防己甲素为模型药物,将其制备成纳米复合粒子,当其吸入沉降于肺部后,可以释放出纳米粒。
快速膜乳化技术利用较高压力使预乳液通过粒径均一的微孔膜。在膜孔的作用下,初乳被破碎成粒径更小、分布更窄的液滴。液滴粒径主要由膜孔控制,因而乳化过程更易于控制,制备的微球粒径均一,批次间重复性好[19,20]。
材料与方法 实验材料和仪器汉防己甲素对照品 (粉防己碱,批号110711-200708,中国食品药品检定研究院); 汉防己甲素提取物 (南京泽朗医药有限公司,纯度98%); 乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA,LA/GA = 50∶50,相对分子质量15 000,山东省医疗器械研究所); 聚乙烯醇1788 (PVA1788,上海阿拉丁试剂有限公司); 尼罗红 (Nile red,美国Sigma-Aldrich公司); 醋酸乙酯 (EA,上海国药集团); 乙腈为色谱纯,水为超纯水。
快速膜乳化装置(自制); SPG膜 (日本SPG Technology公司,亲水性,膜长12.5 cm,膜孔径1 μm); Waters-2695高效液相色谱仪 (美国Waters公司); S-4800型场发射扫描电镜 (日本日立公司); 差热分析仪CPY-1P (上海精密科学仪器); Zetasizer Nano型马尔文激光粒度分析仪,Mastersizer 2000 (英国马尔文公司); Buchi B-290小型喷雾干燥仪 (瑞士步琪公司); Leica TCS-SP5激光共聚焦显微镜 (德国); Bruker Axs D8 Advance X-射线粉末衍射仪 (瑞士ARL公司)。
一级粒子的制备 载药粒子的制备采用快速膜乳化法[20,21]制备汉防己甲素纳米粒。具体流程如下: 将1 gPLGA与0.25 g TET溶于50 mL醋酸乙酯中作为油相,2% PVA水溶液250 mL为水相,均质乳化制备油/水型 (O/W) 预乳液 (12 000 r·min-1,45 s)。将其倒入快速膜乳化装置中,在1.15 MPa氮气压力下过1 μm膜3次,将所得乳液加入6倍体积0.5% PVA水溶液中,常温下磁力搅拌6 h,悬浮分散液先于2 000 r·min-1离心5 min,除去聚集物,再于16 000r·min-1离心10 min,水洗涤3次,将沉淀物超声分散于50 mL蒸馏水中,低温保存备用。
空白粒子的制备与载药粒子制备相同,但不加模型药物TET。
包载尼罗红PLGA粒子的制备[22,23,24] 与空白粒子制备相同,只是在有机相中加入适量尼罗红。
PLGA微球体外释放与吸附尼罗红研究由于本实验使用的激光共聚焦显微镜无法对几百纳米的微粒进行有效观察,为此使用了常规磁力搅拌制备包载尼罗红微球及空白PLGA微球 (其他条件同上),将包载尼罗红微球混悬于水中,常温放置2 h,PLGA空白微球加入到尼罗红饱和水溶液中,常温放置2 h,离心水洗3次,再将其置于水中平衡2 h,取微球溶液于激光共聚焦显微镜下观察。
二级粒子的制备 采用喷雾干燥法制备汉防己甲素复合粒子,将上述所制备的混悬液喷雾干燥,喷雾干燥条件如下[25]: 进口温度: 70 ℃,喷雾速度: 1.25 mL·min-1,氮气流量: 536 L·h-1,抽气速度: 21.88 m3·h-1,喷头直径: 1.5 mm。
扫描电镜观察 喷雾干燥前粒子形态用吸管吸取少量喷干前混悬液滴在铝箔 (锡纸) 上,均匀摊开,自然晾干,剪下一小块铝箔用导电胶固定在样品台上喷金70 s后,利用扫描电子显微镜观察。
喷雾干燥后粒子形态取喷干后的纳米复合粒子,其他操作同上,扫描电镜观察。
复合粒子遇水分散形态取少许纳米复合粒子于锡纸上,用0.45 mm针头注射器,滴少量蒸馏水至复合粒子表面,让其自然摊开,分散复合粒子。自然晾干,其他操作同上,扫描电镜观察。
干法、湿法激光粒度分析 干法粒径测量取适量喷雾干燥后的纳米复合粒子,采用Mastersizer 2000型粒度分析仪测定其干法粒径。
湿法粒径测量分别取适量喷雾干燥前混悬液、喷干后复合粒子,使其均匀分散在水中,采用Zetasizer Nano型马尔文激光粒度分析仪测定其平均粒径及多分散系数 (PDI),PDI越小代表纳米粒粒径分布越均匀。
含量测定 色谱条件Waters Symmetry C18色谱柱 (200 mm × 4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水 (含0.2% 三乙胺) = 80∶20,检测波长为282 nm,柱温: 30 ℃,流速: 1.0 mL·min-1,进样量: 10 μL。
溶液的制备① 对照品溶液的制备。精密称取TET对照品适量,加乙腈制成每毫升含TET 0.443 mg的对照品储备液。将对照品储备液分别稀释5、10、25、50和100倍制成标准曲线溶液,进样10 μL。以TET浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,得线性回归方程Y = 7 000 000 X (R2 = 0.999 8),表明TET在0.004 43~0.443 mg·mL-1内与峰面积呈良好线性关系。该方法的重复性、精密度及稳定性RSD分别为0.19%、0.6% 和0.25% ,均符合相关要求。② 载药量与包封率的测定。精密称取适量复合粒子,以乙醇快速淋洗3次,室温晾干,加入乙腈超声30 min,室温放置过夜,于8 000 r·min-1离心5 min,取上层液体进样。
载药量 = 微球中药物质量 / 微球质量 × 100%
包封率 = 微球中药物质量 / 投入总质量 × 100%
X射线衍射分析采用ARLX-TRA型X射线衍射仪分别对TET原料药、空白复合粒子、TET原料药与PLGA空白纳米粒1∶9物理混合、载药复合粒子进行分析 [载药量为 (9.22 ± 0.46) %],进样量分别为15 mg,观察TET在载体材料PLGA中的分散状态。分析条件如下: Cu-Kα射线,衍射角度 (2θ) 扫 描范围为5°~50°,扫描速度: 10°·min-1,温度: 20 ℃,管压: 50 kV,管流: 150 mA。
差示扫描量热法 (DSC) 分析分别称取汉防己甲素原料药、空白复合粒子、TET原料药与PLGA空白纳米粒1∶9物理混合及载药复合粒子 [载药量为 (9.22 ± 0.46) %],依次进行DSC分析。分析条件 如下: 进样量: 5 mg,扫描范围: 25~300 ℃,升温速度: 10 ℃·min-1,气氛为高纯氮气。
红外图谱分析利用傅里叶红外光谱仪,采用KBr压片,在4 000~400 cm-1内对原料药TET、空白PLGA复合粒子、TET原料药与PLGA空白纳米粒 1∶9物理混合和载药复合粒子进行红外图谱测定。
内部结构观察采用激光共聚焦显微镜对粒子内部结构进行观察,设定Z轴方向上采集的第一张和最后一张确定扫描区域,设置Z轴步进,进行随机断层扫描,同时进行计算机图象分析。尼罗红的激发波长为543 nm、发射波长为588~688 nm。
结果 1 粒子的表面形态、粒径分布与含量扫描电镜如图 1所示,喷干前一级纳米粒子大小均一; 喷干后二级复合粒子成类球形; 二级粒子上一级粒子清晰可见,没有发生形态改变; 二级粒子遇水后发生侵蚀、坍陷,分散,释放出一级粒子,且释放后的一级粒子与喷干前无明显差别; 可见二级粒子只是一级粒子简单的聚集组合,这为其逆向释放出一级纳米粒子提供基础。同时一级粒子与原料药相 比,显著降低了原料药的粒度。
干法粒径分布如图 2所示,二级粒子体积平均粒径为 (3.675 ± 0.16) μm。湿法粒径如图 3所示,一级粒子平均粒径 (337.5 ± 6.2) nm,PDI为0.014 ± 0.004,复合粒子遇水再分散后平均粒径 (530.6 ± 24.6) nm,PDI为0.24 ± 0.09。复合粒子载药量为 (9.22 ± 0.46) %,包封率为 (55.31 ± 2.76) %。
如图 4所示,TET原料药和物理混合的特征图谱在8°~30°有很强的TET结晶衍射峰,8.68°和15.66°为其中两个较强峰,在空白复合粒子和载药复合粒子中均不见TET的衍射尖峰,PLGA为无定形结构,其特征峰主要呈现为一个矮胖峰,推测TET以无定形状态分散于载体中。
如图 5所示,汉防己甲素原料药在226 ℃有1个尖锐的吸热峰,这与汉防己甲素的熔点接近,空白粒子与TET物理混合、空白微球和载药 微球在50 ℃附近出现吸热峰,这与PLGA的玻璃化温度相近。物理混合物中可以看到汉防己甲素的吸收峰,而在载药粒子中无汉防己甲素的特征吸收峰,且与物理混合物明显不同,说明汉防己甲素在复合粒子中改变了原有的晶型,以非结晶形式分散于载体骨架中,而非吸附在载体材料表面。
如图 6所示,PLGA在1 758 cm-1附近出现酯C=O吸收峰; TET原料药、物理混合物在1 505 cm-1处有很强的峰,为汉防己甲素中苯环特征吸收峰; 物理混合物中,PLGA 1 350~1 100 cm-1峰被汉防己甲素烷基芳香醚C-O-C和C-N振动峰掩盖。空白微球、载药微球中2 994、2 946、1 459、1 430和1 400 cm-1为PLGA中饱和碳氢伸缩振动吸收峰,3 448 cm-1为PLGA中羟基吸收峰,从图中可以看出两者的特征峰没有明显差异,在物理混合物中也未见新的峰,可见将TET与PLGA制备成纳米粒再喷雾干燥,并没有产生新的化学键。
如图 7A所示: 包载尼罗红微球溶液在放置2 h后,溶液环境中无尼罗红的荧光干扰; 体外释放研究表明,在4 h内,包载尼罗红PLGA纳米粒的累积释放率低于1%。不仅如此,脂溶性的PLGA微粒可以吸附水中少量的尼罗红,如图 7B、C所示,粒径较小的空白PLGA已被尼罗红完全浸透,粒径较大的尚未完全浸透,而造成中空假象,离心前微球溶液内荧光强度已高于背景,离心静置后整个溶液环境中几乎无荧光现象。该现象从反面进一步说明PLGA与尼罗红具有较强亲和性,能吸附水中少量尼罗红,且短时间内未见尼罗红泄露干扰背景。表明尼罗红可以示踪纳米粒,研究纳米粒在二级粒子内的分布情况。
图 8A为二级粒子切面图,图 8C为二级粒子Z轴方向从上到下不同位置切面图,图 8B是由图 8C经计算机处理而得,X-Y轴切面为类圆形,而Y-Z、X-Z轴由于扫描层数有限叠加而成椭圆形。结合扫描电镜可推测二级粒子为实心类球形粒子。
制备PLGA纳米粒子的常用方法有纳米沉淀法[24]、液中干燥法[26]等 (又称自乳化溶剂分散技术)。本实验采用快速膜乳化法制备PLGA纳米粒,其尺寸均 一、粒径可控,可以通过调节膜孔径和过膜压力等因素,得到相应大小的纳米粒。由于喷雾干燥所需样品 量大,而实验室超声等设备处理量有限,若增加超声处理量,势必影响超声效果,快速膜乳法则可以根据不同样品量选择不同规格的膜管,样品处理量大。
喷雾干燥过程中,当进口温度为70 ℃时,其出口温度低于40 ℃,结合PLGA差示扫描分析可知,PLGA的玻璃化温度在50 ℃左右,高于出口温度,这可能是喷干后纳米复合粒子能较好再分散的前提。然而,复合粒子遇水再分散后,其对应的平均粒径和PDI均有所增大,可能是由于少量纳米粒遇水后不能分散所致。湿法粒径分析的原理是通过动态光散射测量粒子的布朗运动,并将此布朗运动与粒径相结合,即通过照射粒子,分析散射光的光强波动实现的,粒子间的聚集比单个粒子散射更多的光 (粒子散射光强与其直径的6次方成正比),所以,即使少量的聚集,即可显著影响粒子的粒径分布。本课题组也在尝试加入不同保护剂,以改善其“再分散性”。
观察粒子形态常用方法有光学显微镜、扫描电子显微镜和透射电镜,这些技术难以看到粒子的内部结构,不能提供微球构成的信息[27,28]。激光共聚焦可使聚焦平面外结构的散射光减到最低,提高成像质量,可实现对较厚样品的光学切面和三维重组[29],并可通过不同的荧光标记物识别微球表面及内部结构[30,31]。实验室采用的荧光标记方法有化学合成法[12]、物理包载法[22]等,用物理包载法进行体内外示踪时,要求标记物稳定、不易泄漏。一般需要通过微球的体外释放来考察荧光物质的释放行为[32]。本实验二级混悬喷干短时间内即可完成,因此也将包载尼罗红的PLGA微球定点释放2 h,观察溶液中是否有背景荧光干扰,同时从微球释放的逆向出发,考察其是否能吸附水中少量的荧光素及其逆向释放行为,反推PLGA微球与荧光剂的亲和行为,实验现象推测尼罗红与脂溶性物质PLGA具有较强亲和性,同时体外释放研究表明尼罗红在水溶液中短时间内不会有泄漏现象,因而可以作为示踪剂观察二级粒子的内部结构。文献[33]也报道了类似现象,以缓冲盐为混合释放介质,研究包载尼罗红PLGA纳米粒的体外释放发现,尼罗红释放缓慢,3 h内释放不到1%。在二级粒子再分散性研究中,本文以水为释放介质,而粒子吸入体内后,将面临少量、高黏度肺泡液,其释放行为可能极为复杂,还需进一步研究。
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