药学学报  2014, Vol. 49 Issue (11): 1600-1606   PDF    
双环醇磷脂复合物制备、复合机制及其对口服吸收的影响
李琳1, 董武军1, 盛莉2, 夏学军1, 李燕2, 刘玉玲1     
1. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所 药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室, 北京 100050;
2. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所 药物代谢室, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 活性物质发现与适药化研究北京市重点实验室, 北京 100050
摘要:本文探讨了具有苄醇结构的双环醇与磷脂的复合机制及对难溶性药物双环醇理化性质和口服吸收的影响。采用溶剂挥发法制备, 以复合率为指标, 通过正交试验设计优化工艺参数; 采用差示扫描量热法(DSC)、X-射线粉末衍射(XRD)、红外光谱(FTIR)及磷核磁共振波谱(31P-NMR)等方法, 研究复合物的药物晶型及物相状态, 探讨复合机制; 以原料药为参比, 考察复合物在水和正辛醇的表观溶解度, 以及大鼠灌胃后的血药浓度和肝组织分布。结果表明, 优化条件下双环醇与磷脂酰胆碱以摩尔比1:2完全复合, 两者系通过磷脂酰胆碱的磷氧双键(P=O)与双环醇苄醇羟基两个极性端之间的电荷迁移作用形成分子间氢键而复合, 药物以无定形状态分散。与原料药相比, 复合物水和正辛醇的表观溶解度分别提高了5.75和7.72倍。大鼠口服给药血药浓度及肝组织分布以1 h增加最为明显, 分别为原料药的43和13倍, 显示了良好的促进药物吸收的作用。本研究亦为其他苄醇类化合物磷脂复合物的研究提供了理论指导与参考。
关键词双环醇     磷脂复合物     理化性质     血药浓度    
Preparation, formation mechanism and preliminary evaluation of oral absorption of a Bicyclol-phospholipid complex
LI Lin1, DONG Wu-jun1, SHENG Li2, XIA Xue-jun1, LI Yan2, LIU Yu-ling1     
1. Beijing Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulations, State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China;
2. Department of Drug Metabolism, Beijing Key Laboratory of Active Substances Discovery and Drug Ability Evaluation, State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: Bicyclol with benzyl alcohol structure, is a poorly water-soluble drug, used for the treatment of chronic hepatitis B. To increase the drug solubility and oral bioavailability, a Bicyclol-phospholipid complex was studied on its preparation, formation mechanism, and the influence on drug physicochemical properties and oral absorption. The complex was prepared by a solvent evaporation method. The optimal formulation was selected by orthogonal experimental design, and a reasonable evaluating method of the complexation rate was established. Various methods, such as differential scanning calorimetry(DSC), X-ray diffraction(XRD), Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)and 31P nuclear magnetic resonance(31P-NMR), were used to explore the phase state and formation mechanism of the complex. The solubility of drug in complex was investigated in water/n-octanol. Preliminary study of its absorption and liver tissue distribution in rats was also carried out. The results showed that Bicyclol and phosphatidylcholine can be complexed entirely in the molar ratio 1:2. Bicyclol was dispersed in phospholipids as amorphous state. They were combined by intermolecular hydrogen bond due to charge transfer effect which occurred between the two polarities of the double bond between phosphorus and oxygen(P=O)of phosphatidylcholine and benzalcohol group of Bicyclol. The solubility of the complex compared to the active pharmaceutical ingredient(API)was effectively enhanced 5.75 times in water and 7.72 times in n-octanol, separately. In addition, drug concentrations were also enhanced 43 times in plasma and 13 times in liver with one hour after administering the complex to rats via oral gavage. All of these indicated that Bicyclol with benzalcohol group can interact with phospholipids to form complex, improving drug's physicochemical properties, thus further increasing its absorption and target tissue distribution. This study also provided theoretical reference for the research of other benzalcohol derivatives complexed with phospholipids.
Key words: Bicyclol     phospholipid complex     physicochemical characteristic     plasma concentration    

双环醇 (Bicyclol,BY,图 1),商品名百赛诺,是我国第一个具有国际自主知识产权的一类化学新药,它是在五味子素基础上人工合成的治疗慢性病毒性肝炎药物,具有明显的肝细胞保护作用及抗肝炎病毒活性,长期服用无明显不良反应[1, 2, 3],目前已在美国、欧盟等15个国家和地区取得专利保护,产生了良好的社会效益和经济效益[4]。双环醇系难溶性药物,利用现代药剂学技术提高其溶解度和生物利用度值得深入研究[5]

Figure 1 Chemical structure of Bicyclol

磷脂复合物是近年来研究较多的提高难溶性 药物生物利用度制剂新技术。磷脂是构成生物膜的 基本成分,生物相容性好,其主要成分为磷脂酰胆碱 (phosphatidylcholine,PC,图 2)。由于其结构中与磷 原子双键相连的氧原子有较强的得电子倾向,而氮原子有较强的失电子倾向。因此,在一定条件下,它可与一定结构的药物分子形成复合物[6],具有改变药物溶解性特别是脂溶性、促进胃肠道吸收、提高生物利用度和增强药理作用的特性[7, 8]。目前,国内外研究和报道较多的是黄酮或多酚类结构的天然活性成分[9],因为酚羟基易于以氢键方式与磷脂极性端发生相互作用,如姜黄素[10]、柚皮素[11]、黄芩苷[12]、水飞蓟宾[13]、灯盏花素[14]、葛根素[15]及槲皮素等[16]

双环醇为多取代联苯类化合物,结构中无酚羟基,但含有苄醇基团,该基团上氢原子具有一定的正电性,理论上有与磷脂磷氧双键上具强负电性的氧原子发生电荷迁移作用形成复合物的可能,但尚未见苄醇类化合物制成磷脂复合物的相关文献报道。

本研究旨在通过双环醇磷脂复合物研究,探讨苄醇类化合物制备磷脂复合物的可行性及其分子间复合机制,评价磷脂复合技术对双环醇理化性质及口服吸收的影响,为发展双环醇高效口服制剂奠定制剂学基础,同时为其他苄醇类化合物磷脂复合物的研究提供理论指导与参考。

Figure 2 Chemical structure of Bicyclol
1 材料与方法 1.1 仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪 (美国Agilent公司); LABOROTA4000型旋转蒸发仪 (德国Heidolph公司); INOVA-500核磁共振谱仪 (美国瓦里安公司); Exstar6200型热分析测定仪 (日本精工公司); Nicolet5700傅立叶变换红外光谱仪 (美国热电公司); Rigaku D/max-2500粉末衍射仪 (日本理学公司)。

双环醇 (北京协和药厂,含量99.67%); 双环醇对照品 (北京协和药厂,精制品,含量99.7%); 磷脂 (德国Lipoid S45,口服级,磷脂酰胆碱含量≥45%); 磷脂 (德国Lipoid S75,注射级,磷脂酰胆碱含量≥75%)。

1.2 实验动物

SPF级雄性SD大鼠,体重为200~220 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号: SCXK (京) 2007-0001。

双环醇磷脂复合物的制备 采用溶剂挥发法,精密称取一定比例的双环醇和大豆磷脂置于梨形烧瓶中,加入适量四氢呋喃使溶解完全,在一定温度水浴中搅拌作用一段时间,旋转蒸发除去溶剂,收集所得沉淀物,并真空干燥过夜,即得双环醇磷脂复合物,室温下密闭保存,备用。

1.3 复合率的分析方法及验证

双环醇在正己烷中几乎不溶,磷脂和双环醇磷脂复合物均易溶于正己烷,因此可使用正己烷进行复合率的测定。精密称取磷脂复合物适量 (相当于双环醇约20 mg),加正己烷适量,振摇使充分溶解后定容至10 mL,摇匀,用微孔滤膜过滤,将不溶于正己烷的游离双环醇滤除,取续滤液,用无水乙醇稀释至适合浓度,液相色谱分析求得与磷脂复合的药物量 (Wc); 另取磷脂复合物适量,用四氢呋喃10 mL溶解后,无水乙醇稀释,同法求得总药物量 (Wt)。按下式计算双环醇和磷脂的复合率 (complexation rate,CR) 。

CR (%) = Wc/Wt×100%

1.4 色谱条件

色谱柱ODS C18柱 (250 mm × 4.6 mm,5 μm); 流动相: 乙腈-水 (55∶45,醋酸调节pH至4.2); 检测波长228 nm; 流速1.0 mL·min-1; 柱温为室温; 进样量10 μL。对该方法的线性范围、回收率及精密度进行了方法学验证。

1.5 制备工艺优化和正交试验设计

考察了两种规格磷脂材料Lipoid S45 (口服级,磷脂酰胆碱含量≥45%) 和Lipoid S75 (注射级,磷脂酰胆碱含量≥75%),以不同投料比制备双环醇磷脂复合物的复合率,结果见表 1,其中WBY/WLipoid为双环醇与磷脂的质量比,molBY/molPC为双环醇与磷脂酰胆碱的摩尔比。结果显示,复合率与双环醇和磷脂酰胆碱的摩尔比呈正相关,磷脂材料的规格对其无影响。

Table 1 The complexation rate of Bicyclol-phospholipid complex made by different phospholipids. CR: Complexation rate

在此基础上,选取磷脂Lipoid S45,以双环醇与磷脂酰胆碱的摩尔比、反应温度、反应时间和药物浓度作为考察因素,采用4因素3水平正交表L9(34) 设计试验,以复合率为指标,根据极差分析,优化磷脂复合物的处方和制备工艺,因素水平表见表 2

Table 2 Factors and levels in orthogonal design L9(34)
1.6 物相状态和复合机制

差示扫描量热法 (DSC) 采用差示扫描量热法考察药物制备成磷脂复合物后的物理状态。分别取 适量的双环醇、磷脂、双环醇磷脂复合物和物理混合物进行DSC扫描。升温速率: 10 ℃·min-1,扫描范围: 20~200 ℃,氮气流速: 60 mL·min-1

X-射线粉末衍射 (XRD) 分别取适量双环醇、磷脂、双环醇磷脂复合物和物理混合物进行XRD分析,观察晶体衍射峰。检测条件: Cu-Kα辐射源,石墨单色器,测定管压40 kV,管流200 mA,衍射范围为3° < 2θ < 60°。

红外光谱 分别取适量双环醇、磷脂、双环醇磷脂复合物和物理混合物进行红外光谱扫描,比较光谱特征。采用溴化钾压片法,压力600 kg,扫描范围400~4 000 cm-1

31P核磁共振波谱 (31P-NMR) 取适量磷脂和双环醇磷脂复合物,分别溶于二甲基亚砜中,进行31P-NMR分析,考察药物制备成磷脂复合物后对磷脂中磷原子的影响。

1.7 溶解性

比较双环醇、双环醇磷脂复合物及物理混合物在水和正辛醇中的溶解度。分别以无水乙醇-水 (9∶1) 和无水乙醇-正辛醇 (9∶1) 为溶剂,配制药物质量浓度分别为5、10、20、40和80 μg·mL-1的系列标准溶液,液相色谱分析,验证方法的线性范围和日内日间精密度。

取过量的双环醇、双环醇磷脂复合物和物理混合物置于磨口三角瓶中,加入10 mL水使成过饱和溶液,于25 ℃水浴中振荡,经2、3、4、5、6和7 h时分别取样,移至离心管中,4 000 r·min-1离心15 min,取上层液过滤。取续滤液,用无水乙醇稀释成适当浓度进样分析,计算双环醇在水中不同时间的表观溶解度。同法操作,测定双环醇在正辛醇中不同时间的表观溶解度。根据测定结果,确定药物在水和正辛醇中达到溶解平衡的时间。

按照上述方法,分别测定双环醇、双环醇磷脂复合物及物理混合物在水和正辛醇中达到溶解平衡时的表观溶解度。

1.8 稳定性

以复合率为指标,考察双环醇磷脂复合物的稳定性。按优化工艺参数,分别采用磷脂Lipoid S45和Lipoid S75制备双环醇磷脂复合物,密闭于室温下保存3个月,分析复合率并与初始比较。

1.9 体内初步评价

在前期大鼠口服双环醇的药代动力学研究[17]基础上,选择代表吸收、分布和消除相的3个时间点 (1、3和6 h) 进行初步评估,比较双环醇原料和双环醇磷脂复合物在大鼠体内不同时间的血药浓度和肝组织分布,初步评价复合物对药物口服吸收的影响。

以甲醇为溶剂,配制药物浓度分别为0.5、5、10、30和50 μg·mL-1的系列标准溶液。分别取大鼠空白血浆或肝组织匀浆180 μL,依次加入不同浓度的双环醇标准溶液20 μL,使双环醇终质量浓度分别为0.05、0.5、1、3和5 μg·mL-1,以等体积乙腈沉淀蛋白后,液相色谱分析,以药物峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,进行线性回归。色谱条件: 色谱柱Aichrom C18 (250 mm × 4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水 (66∶34),检测波长230 nm,流速0.7 mL·min-1,柱温为30 ℃,进样量40 μL。

取SD大鼠18只,随机分为两组,参比组为双环醇原料药,受试组为双环醇磷脂复合物,临用时以0.5% CMC-Na溶液配制成混悬液。实验动物禁食20 h后 (自由饮水),按50 mg·kg-1 (以双环醇计) 分别口服灌胃给药,并于1、3和6 h断头取血 (每个时间点3只动物),分离血浆,取肝组织。用盐水冲洗各组织后,滤纸吸去水分并称重,加入生理盐水制成25% 组织匀浆。组织匀浆液和血浆样品以等体积乙腈沉淀蛋白后,取上清液进样分析。

体内数据的统计学分析,采用Student’s t-test检验,比较两组数据的显著性差异(P < 0.05)。

2 结果 2.1 复合率的分析方法验证

该色谱条件下,双环醇保留时间约为4.9 min,其他组分对测定无干扰。经HPLC测定的双环醇的峰 面积 (A) 与浓度 (C,μg·mL-1) 的标准曲线回归方程为: A = 56.755C + 10.196,r = 1。表明双环醇在5~80 μg·mL-1内与峰面积线性关系良好。低、中、高 (10、20和40 μg·mL-1) 3个浓度,分别于1日内重复测定 5次,RSD均小于0.30%; 平均回收率为99.63% (n = 9),RSD小于1%。方法回收率和精密度均符合要求,可用于双环醇复合率测定。

2.2 制备工艺优化和正交试验设计

按照L9(34) 正交试验设计,以复合率为指标,进行极差分析,试验结果见表 3。由表 3可知,双环醇与磷脂的投料比对复合物的制备影响最大,反应温度、反应时间和药物浓度影响较小。当双环醇与磷脂酰 胆碱的摩尔比为1∶2时,复合率为97.5%~99.13%,已接近完全复合。为保证处方工艺完全复合,适当增加投料比,优化后的最佳条件确定为A3B1C1D3,即双环醇与磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶2.2、反应温度: 40 ℃、反应时间: 30 min、药物质量浓度为20 mg·mL-1。按此工艺制备3批磷脂复合物,平均复合率为 (101.3 ± 0.6) % (n = 3),RSD小于1%。

Table 3 Orthogonal test results
2.3 物相状态和复合机制 2.3.1 DSC图谱    DSC分析结果见图 3。图中显示,双环醇在139.2 ℃存在特征吸热峰。物理混合物中仍可见药物的吸热峰,但可能受到磷脂的干扰,峰位略前移至137.3 ℃。而复合物中双环醇的特征吸热峰完全消失,DSC曲线趋近于磷脂,物相状态发生了变化。
Figure 3 DSC thermograms of phospholipids (a),the Bicyclol- phospholipid complex (b),physical mixture (c),and Bicyclol (d)
2.3.2 XRD图谱    XRD分析结果见图 4。图中显示,双环醇有许多特征晶体衍射尖峰,表明其为结晶态,磷脂呈现为无定性态; 物理混合物中药物的晶体衍射峰和磷脂的无定形特征峰均可见,且没有其他新生成的峰,表明二者之间只是简单混合,没有发生相互作用。而在磷脂复合物中,药物的晶态衍射峰完全消失,呈现出与磷脂类似的无定性态,提示药物与磷脂分子发生了某种相互作用而高度分散于磷脂中,双环醇自身晶体特征被抑制。
Figure4 XRD of physical mixture (a),Bicyclol (b),phospholipids (c),and the Bicyclol-phospholipid complex (d)
2.3.3 红外光谱    双环醇的红外光谱显示,其形成分子内氢键[18]的基团: 苄醇羟基 (O-H) 和酯键上羰基 (C=O) 的伸缩振动峰位分别在3 445.9 cm-1和1 703.7 cm-1,分别较自由态向低频发生了位移。磷脂的磷氧双键 (P=O) 和脂肪酸酯 (C=O) 的伸缩振动峰位分别为1 237.4 cm-1和1 739.7 cm-1。药物与磷脂物理混合物的红外光谱是两者图谱的叠加,各自的特征吸

收峰保持不变,仅部分吸收峰因位置靠近而发生了相互重叠,峰体变宽。

磷脂复合物的红外图谱与物理混合物有所不同,双环醇苄醇羟基 (O-H) 的峰位进一步向低频位移,由3 445.9 cm-1移至3 294.1 cm-1,峰形也由尖峰变为了钝宽峰,而酯键羰基 (C=O) 的伸缩振动峰1 703.7 cm-1消失; 磷脂磷氧双键 (P=O) 的 伸缩振动峰位略移至1 241.9 cm-1,而脂肪酸酯 (C=O) 的伸缩振动峰1 739.6 cm-1未发生变化。由此推测,两者的复合机制是因为双环醇的苄醇羟基与磷脂的磷氧双键两个极性端之间发生了分子间的相互作用,并且被磷脂非极性端的脂肪酸链所包裹,导致药物特征峰位发生了位移或被掩蔽。

2.3.4 磷核磁共振分析    磷核磁共振 (31P-NMR) 分析结果见图 5。磷脂磷核磁共振谱的峰位在复合物中几乎未变,仅峰型略微变宽,显示磷脂极性端 (P=O) 上的磷原子未发生根本性变化,没有新的化学键生成。峰型变宽可能是由于磷脂磷氧双键上的氧原子与药物发生了某种电荷迁移作用,磷原子受其电荷变化影响所致。 2.4 溶解性

双环醇在水和正辛醇中达到溶解平衡的时间均约为6 h。双环醇、双环醇磷脂复合物和物理混合物在水和正辛醇的表观溶解度见表 4。结果显示,双环醇的水溶性仅28.95 μg·mL-1,脂溶性也小于1 mg·mL-1。物理混合物对水溶性和脂溶性均无显著改善。而双环醇磷脂复合物在水和正辛醇中的表观溶解度均较原料药有显著提高,分别为5.75和7.72倍。

Figure5 31P-NMRs of phospholipids (a) and the Bicyclol-phospholipid complex (b)

Table 4 Solubilities of Bicyclol,the phospholipid complex and physical mixture in water/n-octanol at 25 ℃. n = 3,± s
2.5 稳定性

采用磷脂Lipoid S45和Lipoid S75分别制备双 环醇磷脂复合物室温留样3个月的稳定性考察。结 果显示,室温放置3个月: Lipoid S45制备的3批复 合物的平均复合率为 (95.3 ± 2.5) % (n = 3),较初始 [(101.6 ± 0.57) %] 略有降低; Lipoid S75制备的两批复合物的平均复合率为 (97.8 ± 0.3) %,较初始 [(99.64 ± 0.94) %] 未见明显降低,说明双环醇磷脂复合物复合稳定性良好。

2.6 体内初步评价

在0.05~5 μg·mL-1内血浆样品中双环醇的峰面积 (A) 与浓度 (C,μg·mL-1) 的线性关系良好,回归方程为A = 147.84C - 7.914 2,r = 0.998 9; 在0.15~15 μg·g-1内肝组织中双环醇的峰面积 (A) 与浓度 (C,μg·g-1) 线性关系良好,回归方程为A = 52.607C - 6.238 6,r = 0.997 1。

大鼠口服双环醇原料药和双环醇磷脂复合物 (50 mg·kg-1) 后,血浆及肝组织的药物浓度—时间数据见表 5。结果显示,大鼠口服双环醇磷脂复合物的血药浓度和肝组织分布,以给药后1 h增加最为明显,分别为对照组的43和13倍,显示了良好的促药物吸收作用。

Table 5 Concentrations of Bicyclol in the plasma and liver at various time by oral drug administration of Bicyclol (control) and Bicyclol-phospholipid complex,separately. n = 3,± s. P < 0.05 vs control
3 讨论

本研究经过处方设计和工艺优化制备了一种双环醇磷脂复合物,复合完全,制备工艺简单,易于控制; 探讨了双环醇与磷脂复合机制,磷脂磷氧双键上的氧原子由于吸电子作用显示较强的电负性,双环醇苄醇羟基上的氢原子带有部分正电性,推测正电性的氢与负电性的氧之间发生电荷迁移作用并定向结合,两者之间产生的电荷迁移力形成了分子间氢键,使药物与磷脂形成了一种复合物超分子。

尽管双环醇分子中含有1个苄醇羟基,磷脂中含有1个磷氧双键,但两者并未以1∶1摩尔进行复合,而是2 mol磷脂酰胆碱才能完全复合1 mol双环醇。可能是由于氢键的强弱一般与电子受体和供体的电负性大小相关,磷脂P=O上氧原子周围电子云密度较大,具有很强的电负性,而双环醇的苄醇羟基,其氢原子作为电子受体的能力较弱,因此需要足够数目的氧原子共同与其作用,才能形成稳定的分子间氢键,这也是苄醇类化合物不同于一般黄酮或多酚类化合物的特点。关于该类化合物与磷脂酰胆碱的微观复合机制还有待进一步深入研究。

形成复合物后,双环醇高度分散于磷脂中,呈现为无定型态,亲水性和亲脂性都得到显著改善。亲水性的改善,可能是由于磷脂携带药物分子在水中形成了外观类似脂质体的微团,使其易于分散[19],而亲脂性的改善,则是由于药物与磷脂的极性端发生了相互作用,抑制了该部分单链的自由转动,而磷脂的脂肪酸长链等非极性部分并不参与复合反应,可自由移动,包裹磷脂的极性部分形成一个亲脂性表面,使复合物表现出较强的亲脂性。

经体内初步实验证实,大鼠口服双环醇磷脂复合物后血药浓度和肝组织分布均显著高于双环醇原料药,显示了良好的促药物吸收作用。首先与双环醇的理化性质改善有关,其次,基于磷脂与细胞膜的高度亲和性,可促进药物分子与细胞膜结合,提高胃肠道的吸收[20]。此外,磷脂也是构成肝细胞膜的主要成分,进入体内可替代内源性磷脂与肝细胞结合,有利于携带药物更多分布于肝脏组织[21]

双环醇的苄醇羟基结构,为其磷脂复合物的构建提供了分子基础,药物与磷脂形成的复合物能够明显改善双环醇的理化性质,促进生物吸收和肝组织分布,有望发展成为双环醇高效口服制剂的良好载体。

致谢: 本课题的研制过程中得到了北京协和药厂的大力支持。

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