华蟾素注射液中蟾毒配基类化学成分研究

引用本文

HAN Ling-yu, SI Nan, LIU Jun-qiu, ZHAO Hai-yu, YANG Jian, BIAN Bao-lin, WANG Hong-jie. Chemical constituents of bufadienolides in cinobufacino injection[J]. Acta Pharm Sin, 2014, 49(11): 1574-1577. 复制到剪切板

韩玲玉, 司南, 刘俊秋, 赵海誉, 杨健, 边宝林, 王宏洁. 华蟾素注射液中蟾毒配基类化学成分研究[J]. 药学学报, 2014, 49(11): 1574-1577. 复制到剪切板

华蟾素注射液中蟾毒配基类化学成分研究

韩玲玉, 司南, 刘俊秋, 赵海誉, 杨健, 边宝林, 王宏洁

中国中医科学院中药研究所, 北京 100700

收稿日期: 2014-5-21;修回日期: 2014-9-11.

基金项目：科技部重大新药创制专项资助项目(2013zx09102025).

* 通讯作者：wang66397@sina.com

摘要：华蟾素注射液是中华大蟾蜍皮经精制加工制成的水溶性制剂, 临床应用广泛, 具有良好的抗肿瘤活性, 疗效较好, 蟾毒配基类化合物为其中抗肿瘤的主要活性成分。本研究针对华蟾素注射液中蟾毒配基类化合物进行了分离, 得到6个化合物, 分别鉴定结构为3-表-假蟾毒精(1)、假蟾毒精(2)、3-表-沙蟾毒精(3)、沙蟾毒精(4)、3-表-日蟾毒它灵(5)和3-氧代-沙蟾毒精(6)。其中1、3为新化合物, 5、6为新天然产物, 1、2和3、4分别为两对C-3羟基构型异构体。

关键词：华蟾素注射液化学成分蟾毒配基类 3-表-假蟾毒精 3-表-沙蟾毒精

Chemical constituents of bufadienolides in cinobufacino injection

HAN Ling-yu, SI Nan, LIU Jun-qiu, ZHAO Hai-yu, YANG Jian, BIAN Bao-lin, WANG Hong-jie

Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

Abstract: Cinobufacino injection is purified from water extraction of the skin of Bufo bufo gargarizans, which has been widely used for various cancers in clinic with significant anti-tumor effects. Bufadienolides were regarded as the main active constituents of cinobufacino injection in previous reports. In present study, 6 bufadienolides were isolated and purified from Cinobufacino injection. Their structures were identified as 3-epi-ψ-bufarenogin(1), ψ-bufarenogin(2), 3-epi-arenobufagin(3), arenobufagin(4), 3-epi-gamabufotalin(5), and 3-oxo-arenobufagin(6), separately. Among them, 1 and 3 were new compounds, 5 and 6 were new natural products. Compounds 1, 2 and compounds 3, 4 were two pairs configuration isomers at C-3, separately.

Key words: cinobufacino injection chemical constituent bufadienolide 3-epi-ψ-bufarenogin 3-epi-arenobufagin

华蟾素注射液是中华大蟾蜍皮经过加工制成的水溶性制剂,具有解毒、消肿、止痛功能。体内外药理实验证明华蟾素注射液具显著抗肿瘤、镇痛及免疫增强作用,临床上多用于治疗原发性肝癌、肺癌、肠癌等疾病^[1,2],为“国家基本药物目录”、“国家基本医疗保险目录”和中药保护品种。华蟾素注射液主要含蟾毒配基类、吲哚生物碱类、蟾蜍毒素类、多肽类、核酸类、氨基酸类等成分,其中蟾毒配基类成分被认为是主要抗肿瘤活性成分^[3]。本研究对华蟾素注射液

中间体的氯仿部位进行了研究,从中分离得到6个蟾毒配基类化合物,其中化合物1、3为新化合物,化合物5、6为新天然产物,1、2和3、4分别为两对C-3羟基构型异构体。

化合物1白色粉末 (甲醇)。显示负的旋光性[[α]²⁰_D -16.0 (c 0.25,MeOH)]; 紫外最大吸收波长为298 nm。HR-ESI-MS给出其准分子离子峰m/z[M+H]⁺ 417.226 3 (Calcd. 417.227 2),确定分子式为C₂₄H₃₂O₆。¹H NMR (600 MHz,DMSO-d₆) 谱中可见δ 7.54 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-21)、7.67 (1H,dd,J = 9.6,2.4 Hz,H-22) 和6.24 (1H,d,J = 9.6 Hz,H-23) 3个烯氢信号 (表 1),结合¹³C NMR (150 MHz,DMSO-d₆) 谱中δ161.2处内酯羰基碳信号和δ 150.8,148.1,119.9,113.3四个不饱和碳信号,提示化合物中存在α吡喃环结构。与假蟾毒精 (化合物2) ¹³C NMR谱数据比较,C-11位羰基取代,C-12 位α羟基取代,C-14位β羟基取代化学位移值一致。但C-1至C-5的数据不符,推测C-3位可能与假蟾毒精存在构型异构。与3-表-日蟾毒它灵 (化合物5) ¹³C NMR谱数据比较,C-1至C-5的数据基本一致,推测C-3位可能为α羟基取代。具体数据见表 2。同时进行了二维核磁共振相关谱的测定,结果如下: HSQC二维核磁共振相关谱中显示δ_H 3.42与δ_C 69.4直接相关,¹H-¹H COSY二维核磁共振相关谱中显示H-3 (δ_H 3.42) 与H-2 (δ_H 1.50)、H-4 (δ_H 1.02) 相关,HMBC二维核磁共振相关谱显示δ_C 69.4与δ_H 1.53 (H-1)、1.50 (H-2)、1.37 (H-5) 等氢信号存在远程相关,证明δ_C 69.4为C-3信号。又NOESY二维核磁共振相关谱中H-3 (δ_H 3.42) 与H-5 (δ_H 1.37)、H-19 (δ_H 0.95) 存在相关,说明H-3为β构型,即证明C-3为α羟基取代。命名为3-表-假蟾毒精 (图 1)。此外,在NOESY二维核磁共振相关谱中H-12和14-OH均显示与H-18存在相关,证明了C-12位为α羟基取代和C-14位为β羟基取代。

Table 1 NMR spectra data of compound 1 (in DMSO-d₆)

Position	δ_C	δ_H (J in Hz)
1	36.7	1.53 (1H,m),1.44 (1H,m)
2	30.9	1.62 (1H,m),1.50 (1H,m)
3	69.4	3.42 (1H,m)
4	35.1	1.99 (1H,m),1.02 (1H,m)
5	41.5	1.37 (1H,m)
6	27.2	1.61 (1H,m),1.34 (1H,m)
7	21.0	1.81 (1H,m),1.21 (1H,m)
8	39.2	2.24 (1H,m)
9	45.6	2.52 (1H,m)
10	36.5	-
11	213.7	-
12	82.0	3.90 (1H,br s)
13	54.0	-
14	82.0	-
15	33.4	1.82 (1H,m),1.61 (1H,m)
16	27.5	1.91 (1H,m),1.52 (1H,m)
17	45.0	2.40 (1H,m)
18	18.2	0.77 (3H,s)
19	23.6	0.95 (3H,s)
20	119.9	-
21	150.8	7.54 (1H,d,2.4)
22	148.1	7.67 (1H,dd,9.6,2.4)
23	113.3	6.24 (1H,d,9.6)
24	161.2	-

Table 1 NMR spectra data of compound 1 (in DMSO-d₆)

化合物3 白色粉末 (甲醇)。显示正的旋光性[[α]²⁰_D +80 (c 0.10,MeOH)]; 紫外最大吸收波长为298 nm。HR-ESI-MS: m/z [M+H]⁺ 417.226 0 (Calcd. 417.227 2),确定分子式为C₂₄H₃₂O₆。核磁的波谱数据 (DMSO-d₆) (表 2) 与所分离得到的沙蟾毒精 (4) 比较,发现除C-1至C-5的数据有较大出入外,其他数据基本一致,同化合物1类似,推测化合物3为沙蟾毒精的构型异构体,C-3位羟基可能为α构型。经查阅文献,已有相同结构的报道^[4],为比对方便,更换溶剂为CD₃OD (表 3),但仍然存在较多差异。为确定结构,进行了二维核磁共振相关谱的测定,结果如下: HSQC (以下溶剂皆为CD₃OD) 二维核磁共振相关谱中显示δ_H 3.58与δ_C 72.4直接相关,¹H-¹H COSY二维核磁共振相关谱中显示H-3 (δ_H 3.58) 与H-2 (δ_H 1.47)、H-4 (δ_H 1.66) 相关,HMBC二维核磁共振相关谱显示δ_C 69.4与δ_H 1.03 (H-1)、1.50 (H-5)、1.66 (H-2和H-4) 等氢信号存在远程相关,证明δ_C 69.4 为C-3信号。又NOESY二维核磁共振相关谱中H-3 (δH 3.58) 与H-5 (δ_H 1.50)、H-19 (δ_H 1.15) 存在相关,说明H-3为β构型,即证明C-3所连羟基为α构型。命名为3-表-沙蟾毒精 (图 1)。

Table 2 ¹³C NMR spectra data of compounds 2-6 (in DMSO-d₆)

Position	2	3	4	5	6
1	29.6	37.2	31.6	37.6	37.5
2	28.0	31.2	28.4	31.3	38.8
3	64.4	69.9	64.6	70.2	212.2
4	33.7	36.0	33.6	36.8	42.0
5	36.1	43.1	37.4	43.1	45.1
6	26.8	26.9	26.5	27.4	27.7
7	20.8	21.5	21.4	21.3	20.9
8	39.2	39.1	39.0	41.7	38.9
9	45.4	39.5	39.5	40.5	39.9
10	37.1	36.6	36.7	35.6	36.3
11	213.9	73.4	73.3	67.1	73.1
12	82.0	213.3	213.5	50.4	213.0
13	54.0	62.2	62.1	48.3	62.3
14	82.1	84.1	84.2	82.8	84.2
15	33.4	31.9	31.9	32.2	31.9
16	27.3	27.7	27.7	28.3	26.3
17	45.0	40.1	40.1	49.9	40.1
18	18.3	17.3	17.3	17.8	17.3
19	24.2	22.9	23.5	23.5	22.0
20	119.8	120.8	120.9	122.3	120.9
21	150.8	150.2	150.2	149.3	150.2
22	148.1	147.1	147.2	147.3	147.2
23	113.3	114.6	114.6	114.2	114.6
24	161.2	161.1	161.1	161.3	161.2

Table 2 ¹³C NMR spectra data of compounds 2-6 (in DMSO-d₆)

Figure 1 The main ¹H-¹H COSY,HMBC and NOE correlations of compounds 1 and 3

以DMSO为溶剂得到化合物3的波谱数据如下: ¹H NMR (600 MHz,DMSO-d₆) δ: 7.80 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-21) ,7.57 (1H,dd,J = 9.6,2.4 Hz,H-22),6.32 (1H,d,J = 9.6 Hz,H-23),4.97 (1H,s,14-OH),4.54 (1H,d,J = 4.8 Hz,11-OH),4.36 (1H,d,J = 4.8 Hz,3-OH),4.26 (1H,dd,J = 11.4,4.8 Hz,H-11),3.96 (1H,m,H-17),3.39 (1H,m,H-3),1.04 (3H,s,H-19),0.79 (3H,s,H-18)。¹³C NMR谱数据见表 2。

化合物3虽有文献报道,但所报道的核磁数据与该化合物结构不符,本研究通过高分辨质谱及二维核磁实验,确定该化合物为3-表-沙蟾毒精,其波谱数据为首次报道。为方便比对,本研究同时报道3-表-沙蟾毒精以DMSO-d₆作为溶剂的¹H NMR和¹³C NMR波谱数据。通过两对C-3羟基构型异构体 (1和2、3和4) ¹³C NMR谱数据比较,发现C-3位由β-OH (2和4) 变为α-OH (1和3) 会导致C-1至C-5不同程度地向低场位移。实验部分

华蟾素注射液中间体,批号: 120209/09-10 (安徽金蟾生化股份有限公司); 柱层析硅胶100～200目 (试剂级,青岛海洋化工厂); C18反相硅胶 (德国Merk公司); GF254薄层硅胶 (青岛海洋化工); Bruker AVIIIHD 600核磁共振波谱仪 (瑞士Bruker公司,¹H NMR 600 MHz,¹³C NMR 150 MHz); LC3000型高效液相色谱仪 (北京创新通恒有限公司); LTQ Orbitrap Velos pro液质联用仪,ESI离子源; 柱色谱硅胶板 (青岛海洋化工); Kromasil 100-5C18制备柱 (250 mm × 4.6 mm,E10025,瑞典NOBEL公司); 乙腈 (HPLC级,Fisher Scientific)。 1 提取与分离

取华蟾素注射液中间体1 L,3倍体积氯仿萃取,得氯仿层和水层。氯仿层经C18柱色谱用10%、30% 和50% 甲醇洗脱,得到相应的洗脱物分别为Fr.1、Fr.2、Fr.3。取Fr.3部分经硅胶柱色谱分离,氯仿-甲醇溶液 (20∶1～2∶1) 梯度洗脱,得到8个组分 (Fr.3.1～3.8)。Fr.3.1经C18柱色谱及HPLC,得到了化合物6 (10.1 mg)。Fr.3.2经C18柱色谱及HPLC,得到了化合物1 (3.4 mg)、2 (5.0mg)、3(14.1 mg)、4 (15.0 mg)。Fr.3.3经C18柱色谱及HPLC,得到了化合物5 (14.5 mg)。 2 结构鉴定

化合物1 白色粉末 (甲醇)。[α] -16.0 (c 0.25,MEOH),HR-ESI-MS: m/z 417.226 3 [M+H]⁺。NMR数据见表 1。

化合物2 白色粉末 (甲醇)。HR-ESI-MS: m/z 417.226 3 [M+H]⁺ (Calcd. C₂₄H₃₃O₆,417.227 2),确定分子式为C₂₄H₃₂O₆。¹H NMR (600 MHz,DMSO-d₆) δ: 7.64 (1H,dd,J = 9.6,2.4 Hz,H-22),7.51 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-21),6.21 (1H,d,J = 9.6 Hz,H-23),5.11 (1H,br s,12-OH),4.41 (1H,s,14-OH),4.22 (1H,d,J = 3.0 Hz,3-OH),3.92 (1H,d,J = 3.0 Hz,H-12),3.88 (1H,br s,H-3),0.93 (3H,s,H-19),0.79 (3H,s,H-18)。¹³C NMR谱数据见表 2。以上数据与文献^[5]报道基本一致,鉴定化合物2为假蟾毒精。

化合物3 白色粉末 (甲醇)。[α] +80.0 (c 0.10,MEOH),HR-ESI-MS: m/z 417.226 0 [M+H]⁺。NMR数据见表 3。

Table 3 NMR spectra data of compound 3 (in CD₃OD)

Position	δ_C	δ_H (J in Hz)
1	38.5	2.76 (1H,m),1.03 (1H,m)
2	31.9	1.66 (1H,m),1.47 (1H,m)
3	72.4	3.58 (1H,m)
4	37.4	1.66 (1H,m),1.51 (1H,m)
5	45.0	1.50 (1H,m)
6	28.3	1.95 (1H,m),1.41 (1H,m)
7	22.9	1.94 (1H,m),1.41 (1H,m)
8	40.9	2.09 (1H,m)
9	42.1	1.88 (1H,m)
10	37.5	-
11	75.1	4.36 (1H,d,11.4)
12	214.9	-
13	63.8	-
14	86.1	-
15	33.2	1.83 (1H,m),1.75 (1H,m)
16	29.1	2.01 (1H,m),1.74 (1H,m)
17	42.0	4.14 (1H,m)
18	18.1	0.90 (3H,s)
19	23.5	1.15 (3H,s)
20	123.1	-
21	151.6	7.51 (1H,d,2.4)
22	149.1	7.90 (1H,dd,9.6,2.4)
23	115.9	6.30 (1H,d,9.6)
24	164.4	-

Table 3 NMR spectra data of compound 3 (in CD₃OD)

化合物4 白色粉末 (甲醇)。HR-ESI-MS: m/z 417.226 4 [M+H]⁺ (Calcd. C₂₄H₃₃O₆,417.227 2),确定分子式为C₂₄H₃₂O₆。¹H NMR (600 MHz,DMSO-d₆) δ: 7.80 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-21),7.57 (1H,dd,J = 9.6,2.4 Hz,H-22),6.31 (1H,d,J = 9.6 Hz,H-23),4.95 (1H,s,14-OH),4.46 (1H,d,J = 4.8 Hz,11-OH),4.25 (1H,dd,J = 11.4,4.8 Hz,H-11),4.13 (1H,d,J = 3.0 Hz,3-OH),3.97 (1H,m,H-17),3.84 (1H,br s,H-3),1.06 (3H,s,H-19),0.79 (3H,s,H-18)。¹³C NMR谱数据见表 2。以上数据与文献^[5]报道基本一致,鉴定化合物4为沙蟾毒精。

化合物5 白色粉末 (甲醇)。HR-ESI-MS: m/z 403.247 8 [M+H]⁺ (Calcd. C₂₄H₃₅O₅,403.247 9),确定分子式为C₂₄H₃₄O₅。¹H NMR (600 MHz,DMSO-d₆) δ: 7.87 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-21),7.53 (1H,dd,J = 9.6,2.4 Hz,H-22),6.27 (1H,d,J = 9.6 Hz,H-23),4.36 (1H,d,J = 4.8 Hz,3-OH),4.13 (1H,s,14-OH),4.05 (1H,d,J = 6.0 Hz,11-OH),3.48 (1H,m,H-11),3.38 (1H,m,H-3),0.92 (3H,s,H-19),0.60 (3H,s,H-18)。¹³C NMR谱数据见表 2。以上数据与文献^[6]报道基本一致,鉴定化合物5为3-表-日蟾毒它灵。

化合物6 白色粉末 (甲醇)。HR-ESI-MS: m/z 415.211 7 [M+H]⁺ (Calcd. C₂₄H₃₁O₆,415.211 5),确定分子式为C₂₄H₃₀O₆。¹H NMR (600 MHz,DMSO-d₆) δ: 7.80 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-21),7.56 (1H,dd,J = 9.6,2.4 Hz,H-22),6.30 (1H,d,J = 9.6 Hz,H-23),5.00 (1H,s,14-OH),4.64 (1H,d,J = 5.4 Hz,11-OH),4.34 (1H,dd,J = 11.4,4.8 Hz,H-11),1.11 (3H,s,H-19),0.80 (3H,s,H-18)。¹³C NMR谱数据见表 2。以上数据与文献^[7]报道基本一致,鉴定化合物6为3-氧代-沙蟾毒精。

参考文献

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药学学报 2014, Vol. 49 Issue (11): 1574-1577	PDF