eIF4E (eukaryotic translation initiation factor 4E)为真核细胞翻译起始因子,可以与mRNA 5' 端帽子结构结合,是蛋白合成翻译起始中的重要蛋白^[1]。在哺乳动物中已经明确有eIF4E-1、eIF4E-2和elF4E-3三种不同家族成员,三者在结构标记、功能特征以及表达形式上都有所不同,eIF4E-1存在于真核生物,eIF4E-2限于后生动物,elF4E-3则仅见于脊索动物。三者均可与mRNA帽结构结合,从而介导蛋白合成翻译的起始^[2,3]。通常所说的eIF4E即eIF4E1^[4]。鉴于eIF4E在细胞内蛋白合成翻译起始中的重要作用,所以eIF4E在细胞内必然存在着多种调控^[5,6,7]。已有研究表明,4E-BPs具有抑制eIF4E活性的功能,4E-BPs作为竞争性抑制者并不干涉eIF4E与5' 帽子结 构结合,而是阻止eIF4F的组装^[8]。在生长因子与激素信号及其受体激活的数条信号通路中,最常研究的包括Grb2、SOS和Ras,其中Ras激活MAP激酶。激活的MAPK使得4E-BPs与eIF4E分离,增加游离的eIF4E,同时激活的MAPK激活MNk1和MNk2,使eIF4E第209号丝氨酸磷酸化,磷酸化eIF4E更容 易与mRNA 5' 帽子结构结合进而增加mRNA翻译^[9]。鉴于eIF4E在细胞中的重要的生物功能,细胞内对eIF4E的蛋白量的调控一定是精密而严谨的。细胞内的蛋白稳定性的调控大多数通过泛素化调节。目前关于eIF4E的泛素化修饰等研究还很少,而介导eIF4E泛素化的E3连接酶目前还没有报道。作者研究的目的是希望通过酵母双杂交筛选得到能够介导eIF4E泛素化的E3连接酶。

近年来研究显示,在人类诸多恶性肿瘤中发现癌组织和癌旁组织中存在eIF4E的过度表达,并且与肿瘤的侵袭转移能力呈正相关^[10]。eIF4E在肿瘤的整个演进过程中起重要作用。一方面eIF4E过表达改变了细胞形态,增强细胞增殖能力,并诱导细胞转化、肿瘤生成和转移^[11,12]; 另一方面eIF4E通过多方面调控恶性肿瘤相关mRNAs的翻译,包含细胞有丝分裂过程、激活原癌基因、血管形成、增强自分泌、细胞存活、侵袭及与细胞外环境的交通^[13]。

本文利用酵母双杂交系统从人cDNA文库筛选eIF4E蛋白相互作用蛋白质,并用免疫共沉淀验证这种相互作用。希望能筛选到与eIF4E蛋白有特异相互作用的蛋白质,为阐明eIF4E蛋白诱导肝癌的分子机制提供重要的线索和启示。

菌株AH109,质粒pGBKT7、pGAD、pCMV-HA、pCMV-Myc及人骨髓cDNA文库均购自Clontech公司。

各种限制性内切酶均购自TaKaRa和Promega公司; Myc单克隆抗体 (鼠源) HA多克隆抗体 (兔源) 和酵母用培养基均购自Clontech公司; Flag M2单克隆抗体 (鼠源) 及X-gal、PEG3350、3-AT、溶细胞酶 (lyticase) 和放线菌酮均购自Sigma公司; DMEM、LipofectAMINE转染试剂为Gibco BRL公司产品; 化学发光底物试剂为Pierce公司产品; 其他试剂均为国产试剂。

将eIF4E基因定向克隆至酵母双杂交系统中的诱饵载体pGBKT7,构建重组质 粒pGBKT7-eIF4E。采用LiAC方法将质粒pGBKT7- eIF4E转化至酵母菌株AH109,β-半乳糖苷酶活性显色反应鉴定转录激活活性。扩增人骨髓cDNA文库,采用LiAC法转化pGBKT7-eIF4E和文库质粒至酵 母菌株AH109,涂布于50块Leu-/Trp-/His-SD培养基 + 3AT平板上。30 ℃培养至菌落长出 (7～10天)。分析和证实假定的阳性克隆。阳性克隆序列分析,通过国际互联网络进行同源性分析,以美国国立生物信息中心 (NCBI) 的BLAST作为主要的检索工具,对比数据库主要NR库和ESTs库。检索主要程序采用BLASTn。

① 将细胞接种到60 mm细胞培养皿,达到密度后转染相应质粒,36 h后吸净培养液,可用PBS小心漂洗1次。用裂解液400 µL裂解细胞。收集上清液。② 上清液中加入相应的抗体约1 µg,4 ℃孵育过夜。③ 然后往裂解液中再加入蛋白A/G 30 µL,4 ℃孵育1～4 h。④将免疫沉淀后的溶液于4 ℃、3 000 r·min^-1离心3 min,去上清液,加入1×裂解缓冲液500 µL洗涤琼脂糖珠,于冷冻离心机4 ℃、3 000 r·min^-1离心3 min,弃上清液,共洗涤3～5次。⑤ 最后一次洗涤完毕,弃上清液,管中只剩Beads,加入2×SDS样品缓冲液混合振荡,于100 ℃煮沸10 min,稍离心后上样到PAGE胶,进行电泳。

首先构建重组质粒pGBKT7-eIF4E,验证eIF4E诱饵质粒在AH109细胞中的表达,用标准醋酸锂法将pGBKT7-eIF4E转入AH109,待菌落长出后,裂解酵母提取蛋白质,用蛋白质免疫印迹法检测诱饵质粒pGBKT7-eIF4E是否表达及表达大小是否正确。图 1显示,用Myc抗体可以检测到诱饵质粒的表达,大小正确,可以进行酵母双杂交筛选。

图 1(Figure 1)

Figure 1 Expression of pGBKT7-P53 (73-393aa) in yeast

转化pGBKT7-EIF4E至酵母菌株AH109,待菌落长出后,作β-半乳糖苷酶活性显色实验,结果为阴性无颜色反应,表明EIF4E蛋白在该酵母系统中无转录激活活性,可作为诱饵蛋白质利用酵母双杂交系统进行文库的筛选,经过文库筛选和验证 (图 2,3),得到多个与eIF4E蛋白有特异相互作用的克隆,核苷酸序列分析及同源性检索表明其中的一个克隆包含约0.4 kb的DNA插入片段与HUWE1基因高度同源 (图 4),即包含了HUWE1的4069-4374Aa编码序列。

图 2(Figure 2)

Figure 2 The growth condition of yeast colonies on SD/-Trp/ -Leu/-His/3-AT plate on the 10th day after transfection of cDNA library

图 3(Figure 3)

Figure 3 The re-selection of yeast colonies on SD/-Ade/-His/ -Leu/-Trp plates and β-gal activity retests

图 4(Figure 4)

Figure 4 The blast results of HUWE1 clone

为了进一步研究两者在哺乳动物细胞水平的 相互作用,构建pCMV-MYC-EIF4E和pCMV-Flag- HUWE1。利用LipofectAMINE (2 g·L^-1) 将pCMV- MYC-eIF4E和pCMV-Flag-HUWE1两个质粒转染至293T细胞。48 h后收集裂解细胞,上清液用Flag M2单抗进行免疫沉淀。然后进行Western blotting检测。结果见图 5,表明eIF4E蛋白与HUWE1在哺乳动物水平也存在特异的相互作用。

图 5(Figure 5)

Figure 5 Co-immunoprecipitation of eIF4E and HUWE1

为了进一步研究两者在哺乳动物细胞中的作用位点,构建重组质粒pCMV-HA-HUWE1 (3 760～4 374 Aa) (含有HECT结构域)。将上述质粒与pCMV-MYC- eIF4E共转染293T细胞,用HA多抗沉淀,用MYC的单抗检测。结果见图 6, 结果表明HUWE1 (3 760～4 374 Aa) 可以与eIF4E蛋白相互作用。

图 6(Figure 6)

Figure 6 Co-immunoprecipitation of eIF4E and HUWE1 HECT domain

利用酵母双杂交系统以凋亡蛋白为诱饵蛋白 从人骨髓cDNA文库中筛选到一个长0.4 kb左右与HUWE1基因高度同源的核酸序列。该序列包含部分HUWE1编码序列,蛋白质序列分析表明: 其在文库质粒中编码的蛋白质与HUWE1蛋白一致。直接将其与eIF4E蛋白免疫共沉淀并得到了证实,即二者在哺乳动物细胞水平也存在特异相互作用。相互作用位点实验表明,含有WWE和BH3结构域的突变体和含有HECT结构域的突变体都可以与EIF4E蛋白相互作用。

HUWE1是一个含有4 374个氨基酸的蛋白,其分子质量约为500 kD。HUWE1的羧基端有负责E3连接酶催化活性的HECT结构域。在其氨基端有两个ARLD结构域,关于HUWE1的此结构域的功能还不太清楚。有文献^[14]报道,HECT结构域的E3连接 酶的氨基端负责底物的识别,其中间含有一个BH3结构域、UBA结构域和WWE结构域。BH3结构域负责与其底物MCL1结合,但HUWE1的BH3结构域与BCL-2家族的其他成员如BCL-2、BCL-xl和BAX都没有结合。在含HECT结构域的E3中,WWE结构域负责蛋白与蛋白的结合。在哺乳动物细胞中HUWE1是高度保守的。在人与鼠细胞中有大于90% 的相似度,而且所有的结构域都高度一致。作为E3连接酶,HUWE1的底物有p53、c-Myc、MCL-1等^[15,16,17],最近有研究表明,在皮肤癌中,HUWE1作为肿瘤抑制因子能够通过抑制Myc/MIZ1复合体促进抑癌基因p21CDKN1A (p21) 和p15INK4B (p15) 的表达从而抑制肿瘤的形成^[18,19]。而eIF4E在癌症的发生发展中也发挥了重要作用,HUWE1对eIF4E的调控及对肿瘤发生的调控是将来的研究重点。