药学学报  2014, Vol. 49 Issue (11): 1536-1542   PDF    
引用本文
GONG Hua-yun, ZHU Yong, LI Zong-he, FAN Xiao-yan, FAN Rong, WANG Fang-tong. Embryo-fetus development toxicity of a novel PPAR-δ agonist in rat[J]. Acta Pharm Sin, 2014, 49(11): 1536-1542.  
龚华云, 朱勇, 李宗河, 范小艳, 樊荣, 王昉彤. 新型PPAR-δ激动剂对大鼠胚胎-胎仔发育毒性的研究[J]. 药学学报, 2014, 49(11): 1536-1542.  
新型PPAR-δ激动剂对大鼠胚胎-胎仔发育毒性的研究
龚华云1, 朱勇2, 李宗河1, 范小艳1, 樊荣1, 王昉彤1     
1. 成都大学, 四川抗菌素工业研究所中国医药集团安全性评价中心, 四川 成都 610052;
2. 浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所, 浙江 杭州 310058
收稿日期: 2014-5-6;修回日期: 2014-6-18.
* 通讯作者：wft1104@vip.163.com
摘要：考察新型PPAR-δ激动剂HS060098对SD大鼠胚胎-胎仔毒性。将SD孕鼠随机分为溶剂对照组和低、中、高等3个剂量组, 大鼠妊娠6～15天(GD6-15)分别口服灌胃1% 羟丙基甲基纤维素水溶液和10、30、100 mg·kg-1·d-1剂量的HS060098混悬液。GD20处死孕鼠, 计数母体动物黄体数、着床数, 观察胚胎生存死亡情况; 检查生存胎仔的体重、性别、外观、内脏及骨骼等指标。结果显示, 各给药组孕鼠临床症状及胎仔外观、内脏未见明显异常, 但100 mg·kg-1·d-1剂量组的孕鼠体重增长缓慢(P < 0.01)且胎仔骨骼骨化延迟(P < 0.01), 30 mg·kg-1·d-1剂量组第二胸骨节骨化不全的胎仔数和窝数均明显高于溶剂对照组(P < 0.05), 各给药组胎仔均有骨骼畸形发生。结果提示, 在本实验室条件下新型PPAR-δ激动剂HS060098对SD妊娠大鼠有一定母体毒性, 对胎仔骨骼发育有不良影响。
关键词： PPAR-δ     胚胎-胎仔毒性     致畸性     大鼠    
Embryo-fetus development toxicity of a novel PPAR-δ agonist in rat
GONG Hua-yun1, ZHU Yong2, LI Zong-he1, FAN Xiao-yan1, FAN Rong1, WANG Fang-tong1     
1. Chengdu University, Sichuan Antibiotic Industrial Institute Sinopharm Center for Safety Evaluation, Chengdu 610052, China;
2. Institute of Pharmacology and Toxicology, School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
Abstract: The study aims to investigate the embryo-fetus development toxicity of the novel PPAR-δ agonist HS060098 on SD rats. The pregnant rats that were randomly divided into the solvent control group(1% hydroxypropyl methyl cellulose water solution)and HS060098 suspension groups(10, 30 and 100 mg·kg-1·d-1)were orally administered with HS060098 suspension or vehicle during the gestation of 6-15 days(GD6-15). At termination(GD20), female rats were sacrificed. The pregnant females were evaluated by corpora lutea count, implantation sites, existence and death of embryos. Fetal sex, weight, externals, variations and malformations of viscus and skeleton were observed. The results show that there were no significant abnormality in maternal general conditions and fetal appearance as well as viscera, but in the 100 mg·kg-1·d-1 group, the maternal weight gain decreased greatly(P < 0.01)and the skeletal ossification delayed remarkably(P < 0.01); in the 30 mg·kg-1·d-1 group, the fatal and litter number of incompletely ossified sternebrae Ⅱ was higher than those of the control group(P < 0.05); the skeletal malformations occurred in all dose groups, which indicate that the novel PPAR-δ agonist HS060098 had maternal toxicity and adversely effected fetal skeletal development under the experimental conditions.
Key words: PPAR-δ     embryo-fetal toxicity     teratogenicity     rat    

PPARs是配体激活转录因子,属于核素受体超家族,PPAR-α、PPAR-δ和PPAR-γ是目前发现的3 个核素受体亚型,由不同的基因编码,与相应配基 (又称激动剂) 结合后被激活,从而调控目标基因转录表达[1]。研究发现,通过这种调控方式,PPARs在 脂肪形成[2]、糖脂代谢[3, 4],以及在免疫系统[5]中发挥重要生理作用。目前已有PPAR-α和PPAR-γ合成激动剂广泛应用于临床实践,如主要用于治疗糖尿病的PPAR-γ激动剂噻唑烷二酮类 (thiazolidinedione,TZD) 以及用于动脉粥样硬化等方面疾病的PPAR-α激 动剂贝特类药[6,7]。PPAR-δ合成激动剂有L-165041、GW0742、GW501516等,与PPAR-α和PPAR-γ不同的是,目前还没有PPAR-δ激动剂的药物应用于临 床[8]。而PPAR-δ广泛表达于各种组织,包括肝脏、脂肪组织、骨骼肌、肾、肺、脑、丘脑、小脑皮质、肠等[9],尤其在骨骼肌中,表达水平分别要比PPAR-α和PPAR-γ高10倍和50倍[10]。动物实验表明[11],PPAR-δ的活化可以降低体重,增加骨骼肌代谢速率和忍耐力,提高胰岛素敏感性,改善心血管功能以及抑制动脉粥样硬化的炎症。因此PPAR-δ为糖脂代谢疾病提供了新的治疗靶点,新型PPAR-δ激动剂的研究发现则将为治疗动脉硬化、2型糖尿病、心血管疾病等一系列代谢综合征提供更好的手段[12]。HS060098是一类新研制化合物 (结构见图 1),其对PPAR-δ受体有很强激动作用,对高血脂、高血糖、动脉粥样硬化及肥胖等均有明确治疗效果[13],但其生殖发育毒性方面未见报道,为保证合理安全用药,本研究采用年轻性成熟大鼠,以受孕雌鼠的胚胎着床到硬腭闭合为给药疗程[14],初步探讨新型PPAR-δ受体激动剂HS060098对妊娠大鼠及胚胎-胚仔发育的影响。

Figure 1 Chemical structure of HS060098
材料与方法 供试药物

HS060098原料药,白色粉末,批号: S110601,临用时以1% 羟丙基甲基纤维素 (HPMC) 水溶液配制到所需浓度。HPMC药用辅料,白色或灰白色粉末,批号: PD189327,均由浙江某药企友情提供。

实验动物

SPF级Sprague-Dawley (SD) 大鼠,雌鼠120只 (体重141.8～176.4 g),雄鼠80只(体重197.1～258.7 g),由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物生产许可证号: SCXK (京) 2012-0001,饲养于SPF级环境。新购入动物饲养适应1周以上,检疫确定合格后开始实验。

实验方法

将大鼠按雌雄2∶1合笼交配,次日晨检查阴栓或阴道精子涂片,以查见阴栓或精子判为交配成功,记为GD0。孕鼠根据体重和时间随机分为4组,HS060098混悬液设置低、中、高等3个组,分别为10、30及100 mg·kg-1·d-1,溶剂对照组给予1% HPMC水溶液。待各组孕鼠数达到20只以上停止合笼。GD6各剂量组孕鼠开始给药 (连续10天),每天上午分别口服灌胃1次相应剂量药物,对照组给予1% HPMC水溶液,给药体积均为10 mL·kg-1。实验期间观察动物活动状况、外观被毛、有无外伤; 是否死亡、濒死; 阴道口是否有血迹或流产以及粪便情况等一般症状并记录。GD0-15每3天测定1次孕鼠体重,GD18、GD20各测定1次; 摄食量GD0-20每3天测定1次。妊娠20天处死孕鼠,大体观察脏器有无异常,称妊娠子宫重量,记录黄体数、着床点数、吸收胎数、活胎数及死胎数; 称量胎仔体重并标号,检查胎仔外观畸形和变异。按照袁伯俊等[15]介绍的方法每窝取1/2胎仔Bouin’s液固定2周后,徒手切片检查内脏畸形和变异情况; 另1/2胎仔剥皮去内脏脂肪,95% 乙醇固定2周以上,茜素红常规染色,透明后甘油保存,镜下检查骨骼畸形和变异。

统计学分析

实验数据采用SPSS 17.0软件统 计,流产率、早产率、母体死亡率及胎仔外观、内脏和骨骼畸形变异发生率数据用Fisher精确概率计算法分析; 死胎数、吸收胎数用Kruskal-Wallis秩和检验法分析; 其他数据以表示,采用单因素方差分析法分析。

结果 1 HS060098对F0代妊娠大鼠一般状态、摄食量及体重的影响

实验期间,孕鼠未出现死亡,外观状态良好,行为活动基本正常。中剂量组一只孕鼠妊娠第14、15 天,阴道口出血,此后恢复正常,解剖观察无异常。由表 1可见,孕鼠给药后,100 mg·kg-1·d-1剂量组孕鼠GD6-10摄食量比对照组明显减少 (P < 0.01),GD12-13开始恢复 (P < 0.05),给药末期恢复正常; 表 2显示100 mg·kg-1·d-1剂量组孕鼠体重GD9-18相比对照组增长缓慢 (P < 0.01),停止给药后,有所恢复 (P < 0.05),孕鼠增重和校正增重 (孕鼠给药期增重除去妊娠子宫重) 与对照组相比均有显著差异 (P < 0.01); 其余各剂量组未见明显差异。

Table 1 Food consumption of pregnant rats treated with HS060098 during the gestation of 6-15 days. n = 22-25,. P < 0.05,**P < 0.01 vs the solvent control group

Table 2 Body weight and weight changes of pregnant rats treated with HS060098 during the gestation of 6-15 days (GD6-15). aBody weight GD20 minus body weight GD6; bWeight gain minus gravid uterus weight. n = 22-25,. P < 0.05,**P < 0.01 vs the solvent control group
2 HS060098对F0代孕鼠生殖能力 (胚胎形成) 的影响

孕鼠剖腹产数据如表 3所示,各组无妊娠鼠死亡,没有孕鼠流产或早产,未发现死胎; 与对照组相比,各剂量组平均妊娠子宫重量、有活胎的雌鼠数 (窝数)、有吸收胎的雌鼠数及平均每窝黄体数、平均每窝着 床数、平均每窝吸收胎数、平均每窝活胎仔数、死胎数等均未见明显差异; 10 mg·kg-1·d-1剂量组雌雄胎仔体重增加,与对照组相比有显著差异 (P < 0.01),30 mg·kg-1·d-1剂量组雌胎仔体重相比对照组增加 (P < 0.05),高剂量组未见统计差异。

Table 3 Caesarean section data of pregnant rats treated with HS060098. n = 22-25,. P < 0.05,**P < 0.01 vs the solvent control group
3 HS060098对F1代胎仔生长发育的影响

胎仔外观检查: 观察胎鼠头颈部、躯干、尾部及四肢外观,各组均未见外观变异或畸形异常。

胎仔内脏检查: 检查胎仔颚、舌、眼、脑及五脏六腑等内脏器官,各组未见脏器畸形,脏器变异各组均有散在发生,主要表现为第三脑室扩张、胸腺颈项残留 (表 4),右奇静脉残留、脐动脉左行 (表 5) 和输尿管蛇形 (表 6),各剂量组内脏变异窝发生率和胎仔发生率相比对照组均未见明显差异。内脏变异汇总见表 7。

Table 4 Data of fetal viscus examination (cerebrum and thymus)

Table 5 Data of fetal viscus examination (vessel)

Table 6 Data of fetal viscus examination (urinary organs)

Table 7 Summary of fetal viscus variations

胎仔骨骼检查: 检查计数胎仔轴向椎骨、肋骨、胸骨及前后足骨化点数,检查结果见表 8,30 mg·kg-1·d-1剂量组的胎仔尾椎和趾骨骨化点数高于对照组 (P < 0.05),但其他剂量组与对照组相比未见差异。

Table 8 The ossification sites data of F1 generation (fetuses). n = 128-154,. P < 0.05 vs the solvent control group

对胎仔头盖骨、脊椎、胸骨、肋骨、锁骨、肩胛骨、骨盆及四肢等骨骼变异检查见,发现骨骼变异主要表现骨化不全,头盖骨主要发生在前头骨、头顶 骨、顶间骨以及上后头骨 (表 9),相比对照组,各剂量组未见统计学差异。胸骨骨化不全主要为第二、五、六胸骨节骨化不全,100 mg·kg-1·d-1剂量组的胎仔发生率分别15.6%、51.3%、50%,且第二胸骨节骨化不全窝发生率达96%,均显著高于对照组 (P < 0.01),同时30 mg·kg-1·d-1剂量组的第二胸骨节骨化不全胎仔发生数和窝发生数相比对照组有明显差异 (P < 0.05),见表 10和图 2。

Table 9 Data of fetal skull examination

Table 10 Data of fatal sternebrae examination. P < 0.05,**P < 0.01 vs the solvent control group

Figure 2 Examination of sternal ossification in fetal skeleton (alizarin red staining,×12),C: The solvent control group; L: Low dose group (10 mg·kg-1·d-1); M: Middle dose group (30 mg·kg-1·d-1); H1,H2: High dose group (100 mg·kg-1·d-1)

对F1代胎仔骨骼畸形检查,结果如表 11和图 2显示,10及30 mg·kg-1·d-1剂量组均有第三胸骨节不对称骨化,100 mg·kg-1·d-1剂量组1只胎仔第一、三胸骨节骨分裂,对照组未出现骨骼畸形。从骨骼检查汇总数据 (表 12) 可知,100 mg·kg-1·d-1剂量组骨骼变异胎仔总发生率为68.8%,2倍于对照组 (36.7%),10及30 mg·kg-1·d-1剂量组骨骼变异胎仔总发生数均大于对照组。

Table 11 Data of skeletal malformation examination for F1 generation

Table 12 Summary of skeletal examination for F1 generation. **P < 0.01 vs the solvent control group
讨论

根据《药物生殖毒性研究技术指导原则》[16],高剂量组宜选择出现毒性但不致大量死亡的剂量,以便进一步的胎仔内脏和骨骼检查,前期预实验和长期毒性实验证实100 mg·kg-1·d-1剂量已经出现毒性反应,因此本研究设计10、30及100 mg·kg-1·d-1等3个剂量组,分别为临床拟用剂量的60.61、18.18和6.06倍。

研究结果显示,100 mg·kg-1·d-1剂量组妊娠鼠在给药的前3天体重少量下降,此后增长缓慢,妊娠鼠净增体重显著减少,这与文献[17]报道PPAR-δ激动剂可减轻体重有一致性。表明100 mg·kg-1·d-1剂量药 物对孕鼠体重增长有较强抑制作用,对妊娠大鼠表现出一定的母体毒性。而摄食量在给药后明显下降,但于给药末期恢复正常摄食,推测中前期摄食量下降可能是孕鼠对供试药物引起的暂时适口性改变,但文献[18,19]资料显示孕鼠在妊娠6～15天限制或减少摄食量,会降低孕鼠体重,增加胎仔产前死亡,畸形发生以及生长阻滞等的风险,因此尽管不是整个给药期出现摄食量的下降,但摄食水平在主要器官形成期间的大幅下降对孕鼠,尤其对胚胎-胎仔发育仍会产生一定程度的影响,可能增加胎仔畸形等的发生。

终期孕鼠剖腹产检查中,10 mg·kg-1·d-1剂量组雌雄胎仔体重及30 mg·kg-1·d-1剂量组雌胎仔体重相比对照组增加,但未呈现剂量依赖关系。结合本中心以往实验胎仔体重数据及本研究妊娠子宫重数据,可以认为和供试药物无关,推测可能是孕鼠个体原因所致。

为进一步了解该药物对胎仔生长发育的影响,本研究进行了胎仔内脏和骨骼检查。结果显示,30 mg·kg-1·d-1剂量组的胎仔尾椎和趾骨骨化点数高于对照组,其余各剂量组未见差异,无剂量依赖关系,由此可认为100 mg·kg-1·d-1剂量及以下,未出现供试药物相关的F1代胎仔骨化点数的增多或减少; 但骨骼骨化检查中,100 mg·kg-1·d-1剂量组骨骼骨化不全胎仔发生率相比对照组有显著差异,尤其第二胸骨节,其骨化不全胎仔发生率和窝发生率具有明显的剂量依赖关系,提示该药物在30及100 mg·kg-1·d-1剂量会一定程度延迟胎仔骨骼骨化。同时10、30及100 mg·kg-1·d-1剂量组均有骨骼畸形发生,对照组无畸形,畸形发生率虽低,但总的骨骼骨化变异数呈现一定程度的剂量依赖关系,结合本中心以往试验胎仔骨骼检查数据数据,不排除药物所致畸形的可能,推测畸形发生可能与药物有关。

综上所述,本研究结果提示100 mg·kg-1·d-1剂量的新型PPAR-δ激动剂HS060098有一定母体毒性和胎仔骨骼发育毒性,表现为较强抑制妊娠SD大鼠体重增长和延迟胎仔骨骼骨化,在10～100 mg·kg-1·d-1剂量内,对胎仔发育有一定的骨骼致畸性,无毒剂量水平在10 mg·kg-1·d-1以下。此次实验给药期仅涉及孕鼠妊娠阶段胚胎主要器官形成期,未包括整个胚胎发育过程,亦未进行激素水平、分子水平等方面指标的检测,因此需进一步扩大研究范围和研究深度,以做出更准确,全面的评价。

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