基因治疗是通过特定的基因递送载体,将目的基因输送至患者体内进行有效表达,从而预防或治疗疾病的新技术。但是目的基因在人体内的表达并不总是处于理想状态,表达不足就不能达到治疗效果,而表达过量又可能产生副作用。因此,基因表达的紧密调控对基因治疗具有十分重要的意义。依靠转录 因子调节基因表达,是基因治疗研究最常用且非常有效的方法[1]。但是,这种调节方式需要在转基因载体内共同表达嵌合反式转录激活因子和专门的启动子。而嵌合反式激活因子是人体异源蛋白,具有潜在的免疫毒性; 专门的启动子则难以进行细胞内源性基因调节,限制了其临床应用。
与依靠转录因子的调控系统相比,基于非编码RNA的调控系统可以直接嵌入转基因表达框而发挥顺式作用[2],不需要表达任何反式激活因子蛋白,也不依赖专门的启动子元件,结构更简单,构建更容易。其中核糖开关是最原始、最简单的基因表达调控元件[3],仅包括适体域和表达平台两个部分[4]。配体与适体域的结合引起表达平台的构象改变,从而改变相关基因的表达水平[5]。而核酶核糖开关以核酶为表达平台,仅通过自身裂解反应就可以调控mRNA的转录或翻译[6],为基因治疗的基因表达调控提供了有效手段。
1 转基因表达调控在哺乳动物细胞内发挥调节作用,是基因表达调控系统应用于基因治疗的前提[5]。Yen等[7]最早开展了核酶核糖开关调控哺乳动物细胞基因表达的研究。他们将具有自我裂解活性的核酶序列插入基因表达载体的转录子内,只要插入位置得当,所转录产生的mRNA即可随核酶自我裂解。在细胞培养基中加入与核酶序列互补的寡核苷酸,或特定的小分子化合物,均可以高效抑制mRNA的自我切割,从而调控基因表达。从此,基于核酶核糖开关的基因表达调控成为研究热点。研究结果显示,核酶核糖开关具有基因表达调控的可调节性、结构的可组装性、靶基因的特异性等特点,且与各种常用基因治疗载体相容性良好,在基因治疗中应用前景广阔。
1.1 基因表达的可调节性核酶核糖开关对基因表达的调控作用有赖于3个属性: 即配体与适体域之间结合的特异性和高亲和性,功能不同的表达平台构象之间的可转化性,核酶介导的mRNA去稳定性 (自身裂解)。核酶核糖开关将配体浓度的变化,转化为mRNA转录水平的高低,继而改变靶蛋白的表达。若靶蛋白的表达随配体浓度的增加而升高,则称该核酶核糖开关为ON开关,反之则称为OFF开关 (表 1)[8,9,10,11,12,13,14,15,16]。
基因表达调控的动态范围 (η) 是评价核酶核糖开关性能的重要指标,即有无配体存在时靶蛋白表达水平的最大差值。对于ON开关,适体饱和浓度条件下的配体从理论上应引起核酶活性的完全丧失,但实际上由于配体与开关的结合具有可逆性,仍然会存在部分核酶活性泄漏,造成η值降低。如将多个核酶核糖开关串联,则可显著扩大基因调控的η值[8],因为仅需其中一个核酶具有活性即可降解mRNA。实验结果表明,连续串联3~4个开关,无配体时的基础表达量可以达到最低,η值可达最大值。对于OFF开关,多个开关串联则可进一步降低配体加入后的靶蛋白表达量,同样可以增大η值。
1.2 结构的可组装性与其他核糖开关类似,核酶核糖开关的结构包含适体域与表达平台两部分。其中适体域的功能都是感应配体的变化,并诱导表达平台的构象转化。而核酶核糖开关的表达平台则由可以自我剪切的核酶构成[17]。适体域与表达平台通过通讯模块相连接。核酶核糖开关的结构清晰,各元件功能明确,为设计即插即用的可组装开关提供了可能。
首先,分别发挥配体结合和自我剪切作用的适体和核酶元件的功能主要依赖自身的独立结构,具备可移植属性。其次,核酶核糖开关的适体和核酶元件还具备可更换属性。适体虽然通过体外SELEX方法筛选[18]获得,只要其在体内仍然保留与特定配体的结合能力,就可以应用于核酶核糖开关的组装和更替。如将核酶核糖开关适体域内的茶碱适体更换为四环素适体[19],开关的基因调控功能仍然存在。而核酶属于催化型RNA分子,通过催化自身结构中磷酸二酯键的水解反应,对自身进行剪切和加工无需宿主细胞其他细胞器或蛋白的参与,目前已有多种来源不同的锤头状核酶 (表 1) 应用于该系统。第三,核酶核糖开关的可组装性,需要通讯模块的参与。能否在不同的功能域之间可靠地传输信息,是通讯模块设计的关键[19]。基于链置换机制设计的通讯模块,可以通过RNA分子的构象动力学特性进行合理的从头设计,实现基因表达响应于配体的灵活控制。但基于螺旋滑移机制设计的通讯模块,则必需通过细胞筛查实验,对组装的开关进行功能验证。故使用螺旋滑动机制的开关系统不易实现可组装性。基于核酶核糖开关的可组装性质,根据临床的不同需要,可以实现开关系统的订制。
1.3 靶基因的特异性核酶核糖开关是顺式作用元件,仅可以调控与其处于同一表达框内的目的基因。若同一表达框内含有多个基因[8],核酶核糖开关同样可以实施表达调控。但其插入表达框内的位置对其调控作用有明显影响。实验结果表明,核酶核糖开关无论插入靶基因的5' 非翻译区 (UTR),还是3' UTR,甚至基因内部,都可以发挥调控作用[15],但调控效率各有不同,且各实验室所得结果迥异[7]。
1.4 与基因治疗载体的兼容性基因治疗的应用离不开转基因载体,核酶核糖开关能否与各种转基因载体兼容,也是其发挥基因表达调控作用的关键。重组腺病毒载体 (rAd,recombinant adenovirus) 是基因疫苗、肿瘤基因治疗和溶瘤病毒的常用载体,已被广泛地应用于临床前和临床研究。无论是复制缺陷型rAd (rAAV,recombinant adeno- associated virus),还是在宿主细胞内可复制的溶瘤型rAd (rOAd,recombinant oncolytic adenovirus),其转基因表达均可由茶碱响应性核酶核糖开关有效调 控[15]。另外,核酶核糖开关在非病毒载体 (表 1)、慢病毒[8]以及麻疹病毒载体[20] (表 2) 的应用也有报道。
在原核细胞内发现的各种天然非编码RNA,具有不同的细胞功能调控作用[15,21,22]。在此启发下,人们也在探讨核酶核糖开关能否在哺乳动物细胞内,将基因表达调控转化为细胞功能调控[23,24,25]。Chen等[8]设计了一种将配体信号经内源性途径转换为下游功能性反应的核酶核糖开关,并探讨了其调控体内T细胞增殖的可行性。过继性T细胞移植 (ACT) 是治疗肿瘤的有效方法。但临床实践中,ACT的抗肿瘤疗效有限,其最重要的原因就是输注的T细胞数量不足,并且很难存活并增殖,抗肿瘤反应缺乏持久性。如能在体内大量扩增具有肿瘤细胞特异性杀伤能力的T细胞,将有助于提高ACT的疗效。T细胞活化是T细胞在体内扩增的关键步骤,由细胞因子IL-2或IL-15介导。IL-2或IL-15激活JAK-STAT信号 传导通路,导致T细胞增殖调节所涉及的一系列基因的表达。Chen等[8]设计的ON型核酶核糖开关,以IL-2或IL-15作为靶蛋白,在输入配体后,核酶迅速失活,IL-2或IL-15表达水平提高,激活JAK-STAT信号传导通路级联反应,从而刺激T细胞快速增殖。该核酶核糖开关不仅可以调控T细胞的体外增殖,对移植至小鼠体内的T细胞同样有效。体内移植的T细胞的生长呈现显著的配体 (茶碱) 依赖性,在500 μmol·L-1茶碱条件下,体内增殖率增加32%。该研究最重要的意义,在于实现了核酶核糖开关从调控基因表达成功转换为调控细胞功能,为扩展该系统在细胞基因治疗的临床应用奠定了基础。
3 核酶核糖开关的优化核酶核糖开关在哺乳动物细胞中能够调节基因表达,甚至调节细胞功能,但其调控性能仍存在不足之处: 如η范围较窄,配体的EC50较大,调控响应时间过长等。其基本元件的选择和配置,结构的布局与组装等仍需要合理设计,以实现其调控性能的最优化。目前,主要通过文库筛选及模型设计等方法对核酶核糖开关进行优化。
3.1 文库筛选文库筛选的主要流程是先选定合适的适体和核酶设计开关框架,将开关框架各区域的核酸序列进行随机突变构成核酶核糖开关文库,再将文库转染细菌或细胞内,根据配体与基因表达的相互关系进行筛选和优化。由于核酶介导的自我剪切不可逆转地改变其所在mRNA的完整性,不涉及生物体自身的胞内机器,所以用核酶核糖开关调节基因表达可以成为不同生物体间的通用机制。理论上在大肠杆菌、酵母菌和哺乳细胞文库内筛选的核酶核糖开关可以通用。
3.1.1 大肠杆菌文库将含有文库质粒转染大肠杆菌,分别用含或不含配体的培养基培养,从而筛选出具有活性的核酶核糖开关[26]。但是,从大肠杆菌文库中筛选的具有活性的核酶核糖开关,并不能直接移植至哺乳动物细胞中应用,必须再转入哺乳动物细胞中进行验证。如Auslander等[13]将从大肠杆菌文库中筛选的ON型核酶核糖开关,移植到哺乳动物细 胞后反而成了OFF型。其原因可能在于两种生物体内mRNA翻译机制的根本区别。在大肠杆菌内,核酶活化后自身裂解,原来被其掩盖的mRNA的核糖体结合位点暴露出来,有利于核糖体的结合与mRNA的翻译进程,所以是ON型开关[12]。而将其应用于哺乳动物细胞后,核酶的自我剪切导致mRNA的稳定性降低,抑制了基因表达,所以是OFF型开关[13]。
3.1.2 酵母菌文库Wei等[9]最近报道从酵母菌文库中优化的核酶核糖开关,可以直接转化至哺乳动物细胞应用,并以可预测的方式发挥基因表达调控活性。在酵母菌文库中,核酶核糖开关突变体的数量可达1×106~1×107种,较哺乳动物细胞的1×103~1×104种提高3~4个数量级。另外酵母菌易于培养,倍增时间短,是一种值得推广的高通量筛选平台。但其潜在缺陷可能是在酵母菌文库的优化开关,不一定在哺乳动物细胞中表现最优。因此,在哺乳动物细胞中的验证仍是不可或缺的步骤。
3.1.3 哺乳动物细胞文库Auslander等[13]将核酶核糖开关的连接序列进行随机突变,直接转染哺乳动物细胞,从中筛选出了基因表达调控效率较高的开关。但是,与从细菌或酵母菌突变体文库的筛选比较,哺乳动物细胞文库的筛选效率极低。因此Chen等[27]提出体外/体内组合的方法,希望提高筛选效率。但在体外选择的开关在转移到体内应用后,往往调控能力显著降低,甚至失去功能。所以组合方法也不能彻底解决筛选效率低的难题。
3.2 模型设计核糖开关的工作原理是配体的浓度变化引发构象转化,从而调节基因表达或细胞功能。如果能够建立一个可以模拟核糖开关作用机制的模型,并发掘影响其动力学及热力学过程的关键参数,则可能通过这些参数的优化进行核糖开关的合理设计。
3.2.1 Beisel模型Beisel等[28]首先构建了核糖开关的动力学模型 (图 1)。该模型将核糖开关的构象简化为具有剪切活性的构象A和不具有剪切活性的构象B两种,这两种构象之间可发生可逆转换。构象B可以与配体可逆性结合成为BL。A和B两种构象的基因表达活性相同,但降解速率不同,因此A和B两种构象的比例决定核糖开关的工作效率。核糖开关的作用被人为地分成几个连续的步骤,每一步骤都确定了相应参数 (图 1)。kfA和kfB分别为构象A和B的转录速率常数,k1和k1' 分别为构象A和B之间转换的速率常数,k2和k2' 分别为构象B结合和释放配体的速率常数,kdMA和kdMB分别为构象A和B的降解速率,kp为基因表达 (翻译) 速率。配体 (L) 浓度和目的蛋白 (P) 表达水平之间的关系受以上参数调控。
该模型认为,基因表达调控的动态范围η和配体的半数有效剂量EC50是描述核糖开关性能的关键指标。K1和K2反映构象变换和配体结合的可逆过程,是核糖开关功能评价的核心参数。K1 (k1'/k1) 表示两种构象的分配常数,体现各构象的相对稳定性,与两关键指标均有关。而K2 (k2/k2') 表示配体结合常数,反映了适体和其配体之间的亲和力,只与EC50有关。以ON型开关为例,K1增加意味着较多的核糖开关分子折叠为构象A,而构象A基因表达效率低,故此时基础表达量降低。但同时因为要加入更多的配体来维持构象B的比例,故此时EC50也会增大。相反,K2增加则可降低EC50。假设配体浓度增大到一定值时可使适体饱和,目的基因表达曲线进入平台期,故K2对配体饱和时的表达水平没有影响,即不影响动态范围η。
在该模型中,核酶核糖开关的性能取决于对mRNA降解能力的调节。kdMA和kdMB既能主导mRNA降解这一不可逆过程,也对稳态条件下的η有影响。增大kdMA (ON型) 或kdMB (OFF型) 在一开始可以增加η值。然而随着二者的继续增加,η值反而会降低。对于ON型开关,降解速率常数对η的影响与构象A的比例 (K1) 有关,如果K1较小,即稳态条件下核糖开关以构象B为主,则η随着kdMA的增加而进入平台期。
然而该模型仅可以对核酶核糖开关的性能进行定性研究,并没有说明η和EC50与各参数的定量关系,特别是没有区分核酶剪切速率常数及mRNA降解速率常数对核糖开关性能的影响,难以定量预测核糖开关功能,难以依据关键参数对核糖开关功能进行优化。
3.2.2 Chen模型Chen等[29]构建的核酶核糖开关模型 (图 2),在形成A和B两种构象前引入过渡状态 (I),并将mRNA的降解与核酶剪切过程加以区分。以下介绍均以OFF型为例。该模型假设目的蛋白的表达水平与完整mRNA的浓度 [R] 成正比,mRNA由基因 (G) 转录而来,零级转录速率常数为vTxn。基因G首先转录形成转录过渡态I,再折叠成构象A或 B。构象A完全没有核酶剪切活性,构象B则具有完全的剪切活性。两种构象的折叠和去折叠速率常数 分别为kFoldA,kFoldB和kUnA,kUnB。构象B与配体L结合形成配体复合物BL,BL与B具有相同的剪切活性(kCle)。配体与构象B的结合速率常数和解离速率常数分别表示为kOn和kOff。
在该模型中,基因表达水平与配体浓度的关系如图 3所示。其性能的最优化体现在无配体时核酶活性保持最小,mRNA几乎无自身裂解,此时[R]为 最大稳态浓度 [R]max; 而在配体饱和时核酶活性达到最大,mRNA被快速裂解,mRNA达到最小稳态水平 [R]min。[R]min与完全裂解之间的差异被称为“地板 间距”; 而最大稳态水平 [R]max与完全保护之间的差异被称为“楼顶间距”。显然,如何缩小两种间距是增大理论动态范围ηTd的关键。地板间距的减小,有赖于 [R]min的最小化。根据该模型推导的公式 [R]min = 1/(1+D) 和D = kCle/kDeg,提高核酶裂解速率kCle和/或提高mRNA的稳定性 (降低kDeg),是减小 [R]min的有效方法。而楼顶间距的缩小,除了与参数D有关外,还与裂解倾向参数ω有关,因为 [R]max = 1/(1+ωD)。构象A和B的折叠、去折叠、降解和裂解速率 (kFold、kUn、kDeg和kCle) 决定ω的大小,ω是核酶活性潜力的表征。降低ω,即降低构象B的比例,可以缩小楼顶间距。但因为楼顶间距与EC50呈反比,缩小楼顶间距就会使EC50增大,失去对配体的灵敏度。因此该模型显示,通过增加参数D而减小 [R]min,是缩小地板间距而提高ηTd的重要因素。
另外,从图 3可以看出,实际动态范围ηRd主要取决于细胞内可能达到的最大配体浓度 (Lmax)。如当D为1 000,ω为0.000 1时,[R]max为 [R]min的1 000倍。此条件下,如将[R]降低为初始值的500倍,需要细胞内的配体浓度至少达到Kd (解离平衡常数Kd = kON/kOFF) 值的10 000倍。如所用的适体的Kd值为100 nm,细胞内的配体浓度必须为1 mmol·L-1。
根据Chen模型,核酶核糖开关的性能评价及优化,主要依赖于以下4个基础参数的获取: ① mRNA未改构前 (图 4A) 的基因表达水平[R]。在Chen模型中,一般以相对基因表达水平 [R] 标示转基因表达程度。此时 [R] 最大,[R]值为1,即 [R] = vTxn/kDeg = 1。② 核酶裂解速率常数 (kCle) 与mRNA的降解速率常数 (kDeg) 的比值 (D)。将无适体核酶插入mRNA (图 4B),检测基因表达水平 [R]B,此时相当于核酶处于最大活性水平,根据公式 [R] = [R]B/[R]A,计算 [R] 值。根据 [R] = vTxn/(kDeg+kCle) = 1/(1+D),计算D值。③ 核酶核糖开关裂解倾向 (ω)。将核酶核糖开关插入mRNA,检测无配体条件下基因表达水平 [R]max,根据[R]max = 1/(1+ωD),计算ω值。④ 最大可用的配体相对浓度 (Lmax)。Lmax具有配体特异性、适体特异性和细胞特异性,实际应用时不可能无限增大。因此,在测定特定核酶核糖开关在特定细胞内ηRd后,也可以得知Lmax。
Chen等[29]对Win等[19]的实验数据进行了比较研究,发现对于大多数核酶核糖开关,该模型可以准确地分析或预测实验数据。同时也指出,Win等[19]设计的核酶核糖开关,尚存在裂解速率相对过慢,胞内最大可用配体浓度相对过小等缺陷。
4 核酶核糖开关的配体对于核酶核糖开关,可与其适体域可逆性结合的配体就是控制其调控活性的钥匙。目前核酶核糖开关应用最广泛的配体是茶碱、四环素等药物。这些配体调控核酶核糖开关的有效浓度,往往高于人体的最大耐受浓度。如果在基因治疗中,患者长期应用这类药物,可能会引起毒副作用。Klauser等[1]最近开发了一种以新霉素为配体的核酶核糖开关,其配体的EC50为0.7 μg·mL-1,远远低于新霉素的人体最高耐受浓度4.3 μg·mL-1,增大了在人体应用的可能性。但以抗生素为配体,无论该类配体调控基因表达的性能多么优秀,可诱导产生细菌耐药性的风险仍是该类核酶核糖开关临床应用的限制因素[30]。所以,寻找更安全、便捷的配体成为优化核酶核糖开关的重要突破口。
4.1 最大可用配体浓度细胞内最大可用配体浓度Lmax是核酶核糖开 关动态范围η的限制因素之一。以最常用的配体茶 碱为例,尽管在酵母菌中使用茶碱的胞外浓度可达 5 mmol·L-1,但根据Chen模型计算出胞内最大可 用茶碱浓度仅为12 µmol·L-1,仅为其Kd值 (约为 1 µmol·L-1) 的12倍,在哺乳动物细胞内的情况也基本如此[29]。茶碱在胞内的浓度如此之低,可知以茶碱为配体的核酶核糖开关,已注定难以有效提升其动态范围η。
4.2 小分子配体理想的小分子配体,必须具备以下性质: 生物相容性好,对人体无潜在毒副作用; 生物半衰期短,有利于转基因表达的快速调节; 细胞渗透性高,有利于降低使用剂量。
以氨基酸、维生素[31]等临床惰性分子作为基因表达的配体,成为新一代基因调控系统的研究热点。生物素 (维生素H) 就是一种理想的小分子配体,目前尚未发现其人体毒副反应的报道。体外细胞实验 表明[32],无论大剂量长期使用生物素,还是突然停用,都不会影响细胞的新陈代谢。Weber等[32]设计的生物素调控系统,对转基因的表达控制呈剂量依赖性,在低剂量时转基因表达随生物素逐步升高,在20 nmol·L-1~10 µmol·L-1内达到最高表达平台。遗憾的是,该系统是转录因子调控系统,转录因子的免疫源性限制了其人体应用。基于核酶核糖开关系统 的可组装特性,只要筛选出生物素特异性适体,即可将生物素应用于核酶核糖开关的调控。
4.3 内源性配体如果以细胞信号通路中的关键因子为配体,则有可能将人工基因调控系统与天然细胞通路相关 联,基于疾病标志物的变化,重新编程细胞命运,从而改变疾病的进程。肿瘤坏死因子α(TNF-α) 是肿 瘤的靶标,也是调控炎症和肿瘤病理过程的关键因子。TNF-α可以激活NF-κB信号通路,而NF-κB信号通路参与多种重要基因的表达,在免疫、炎症、细胞黏附、细胞增殖和细胞凋亡等疾病发生和发展过程中发挥重要作用。内源性蛋白p50和p65是组成转录因子NF-κB的两个亚基,p50和p65异源二聚体的核转位是NF-κB通路激活的关键过程。Culler等[33]最近设计的基因调控系统,就可以感应p50或p65在细胞内的浓度变化,实现调控NF-κB信号传导通路下游基因表达的目的。该RNA调节系统的感应元件就是p50或p65的RNA适体,其表达平台可以根据p50或p65的浓度变化,调节目的基因的选择性剪接,调节细胞命运。当内源性配体p65与该系统的适体域结合后,包含终止密码子的中间外显子被选择性剪切,促进靶蛋白可触发细胞凋亡的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-TK) 表达。当内源性配体p65的表达增加时,促进HSV-TK基因的表达,有利于提高更昔洛韦 (GCV) 诱导细胞凋亡的效率。在100 μg·mL-1 GCV条件下,稳定表达该调控系统的细胞存活率为20%,而不表达该系统的对照细胞的存活率则高达60%~90%。该系统的成功构建,说明完全可以以内源性特定蛋白的浓度变化为调控信号,实现细胞功能调节,从而有目的地控制特定细胞,如肿瘤细胞的命运。
除肿瘤之外,也可以其他疾病中的关键靶点分子为配体,筛选适体元件,并组装相应的基因表达监控系统。也可以针对疾病信号通路中的多个信号分 子,将相关适体串联成融合适体,只要一种信号分子与适体发生特异性结合即可调控靶基因的表达,实现疾病的预防与治疗[18]。
5 小结与传统的转录因子调控方式相比,核酶核糖开关是一种新型基因表达的调控工具,具有明显优势: 体积小,无免疫原性,作用机制简单,使用方便,调控能力可调节,可根据实际需要进行调控元件的组装拼接,还可以通过合理设计进行结构优化。核酶核糖开关适用于各种基因治疗载体,在哺乳动物细胞中具有基因表达调控与功能调控的作用,因此在未来基因治疗的临床应用中一定会发挥重要的作用。
但核酶核糖开关的发展还面临着一些挑战,如毒性更小、胞内浓度跨度更大的配体及其相应适体的筛选; 基因表达实际调控动态范围的扩大; 在哺乳细胞内,与其作用机制相关的动力学及热力学参数的获取,以及配套数学模型的建立,都是今后基因治疗临床实践所必需解决的关键问题。
[1] | Klauser B, Atanasov J, Siewert LK, et al. Ribozyme-based aminoglycoside switches of gene expression engineered by genetic selection in S. cerevisiae [J]. ACS Synth Biol, 2014 [2014-06-11]. http://pubs.acs.org/doi/ipdf/10.1021/sb500062p. |
[2] | Groher F, Suess B. Synthetic riboswitches - a tool comes of age [J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1839: 964-973. |
[3] | Bian J, Shen H, Tu Y, et al. The riboswitch regulates a thiamine pyrophosphate ABC transporter of the oral spirochete Treponema denticola [J]. J Bacteriol, 2011, 193: 3912-3922. |
[4] | Yang HY, Diao Y, Lin JS, et al. Engineering and screening of artificial riboswitch as a novel gene control element [J]. Chin J Biotechnol(生物工程学报), 2012, 28: 134-143. |
[5] | Diao Y. Inducible gene expression of mammalian via RNA- only strategies [J]. China Biotechnol(中国生物工程杂志), 2011, 31: 120-125. |
[6] | Wang JW, Feng JX, Lin JS, et al. The artificial aptazyme based riboswitch [J]. China Biotechnol(中国生物工程杂志), 2014, 34: 59-64. |
[7] | Yen L, Svendsen J, Lee JS, et al. Exogenous control of mammalian gene expression through modulation of RNA self-cleavage [J]. Nature, 2004, 431: 471-476. |
[8] | Chen YY, Jensen MC, Smolke CD. Genetic control of mammalian T-cell proliferation with synthetic RNA regulatory systems [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107: 8531- 8536. |
[9] | Wei KY, Chen YY, Smolke CD. A yeast-based rapid prototype platform for gene control elements in mammalian cells [J]. Biotechnol Bioeng, 2013, 110: 1201-1210. |
[10] | Young DD, Garner RA, Yoder JA, et al. Light-activation of gene function in mammalian cells via ribozymes [J]. Chem Commun(Camb), 2009,(5): 568-570. |
[11] | Rouleau SG, Jodoin R, Bisaillon M, et al. Programming a highly structured ribozyme into complex allostery using RNA oligonucleotides [J]. ACS Chem Biol, 2012, 7: 1802- 1806. |
[12] | Wieland M, Auslander D, Fussenegger M. Engineering of ribozyme-based riboswitches for mammalian cells [J]. Methods, 2012, 56: 351-357. |
[13] | Auslander S, Ketzer P, Hartig JS. A ligand-dependent hammerhead ribozyme switch for controlling mammalian gene expression [J]. Mol Biosyst, 2010, 6: 807-814. |
[14] | Nomura Y, Kumar D, Yokobayashi Y. Synthetic mammalian riboswitches based on guanine aptazyme [J]. Chem Commun(Camb), 2012, 48: 7215-7217. |
[15] | Ketzer P, Haas SF, Engelhardt S, et al. Synthetic riboswitches for external regulation of genes transferred by replication- deficient and oncolytic adenoviruses [J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40: e167. |
[16] | Nomura Y, Zhou L, Miu A, et al. Controlling mammalian gene expression by allosteric hepatitis delta virus ribozymes [J]. ACS Synth Biol, 2013, 2: 684-689. |
[17] | Scott WG, Horan LH, Martick M. The hammerhead ribozyme: structure, catalysis, and gene regulation [J]. Prog Mol Biol Transl Sci, 2013, 120: 1-23. |
[18] | Breaker RR. Prospects for riboswitch discovery and analysis [J]. Mol Cell, 2011, 43: 867-879. |
[19] | Win MN, Smolke CD. A modular and extensible RNA-based gene-regulatory platform for engineering cellular function [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104: 14283-14288. |
[20] | Ketzer P, Kaufmann JK, Engelhardt S, et al. Artificial riboswitches for gene expression and replication control of DNA and RNA viruses [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111: E554-E562. |
[21] | Fedor MJ, Williamson JR. The catalytic diversity of RNAs [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6: 399-412. |
[22] | Novina CD, Sharp PA. The RNAi revolution [J]. Nature, 2004, 430: 161-164. |
[23] | Win MN, Liang JC, Smolke CD. Frameworks for programming biological function through RNA parts and devices [J]. Chem Biol, 2009, 16: 298-310. |
[24] | Breaker RR. Complex riboswitches [J]. Science, 2008, 319: 1795-1797. |
[25] | Isaacs FJ, Dwyer DJ, Collins JJ. RNA synthetic biology [J]. Nat Biotechnol, 2006, 24: 545-554. |
[26] | Saragliadis A, Klauser B, Hartig JS. In vivo screening of ligand-dependent hammerhead ribozymes [J]. Methods Mol Biol, 2012, 848: 455-463. |
[27] | Chen X, Denison L, Levy M, et al. Direct selection for ribozyme cleavage activity in cells [J]. RNA, 2009, 15: 2035-2045. |
[28] | Beisel CL, Smolke CD. Design principles for riboswitch function [J]. PLoS Comput Biol, 2009, 5: e1000363. |
[29] | Chen X, Ellington AD. Design principles for ligand-sensing, conformation-switching ribozymes [J]. PLoS Comput Biol, 2009, 5: e1000620. |
[30] | Jia D, Lin J, Diao Y. Novel targets for antibiotics discovery: riboswitches [J]. Acta Pharm Sin(药学学报), 2013, 48: 1361-1368. |
[31] | Hartenbach S, Daoud-El BM, Weber W, et al. An engineered L-arginine sensor of Chlamydia pneumoniae enables arginine- adjustable transcription control in mammalian cells and mice [J]. Nucleic Acids Res, 2007, 35: e136. |
[32] | Weber W, Stelling J, Rimann M, et al. A synthetic time-delay circuit in mammalian cells and mice [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104: 2643-2648. |
[33] | Culler SJ, Hoff KG, Smolke CD. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins [J]. Science, 2010, 330: 1251-1255. |