生殖毒性研究真正在新药安全评价中得到重视起自于20世纪80年代以后, 由于生殖毒性研究不完善而发生的震惊世界的“反应停”事件造成了近万名新生儿海豹肢畸形, 这一严重的药害事件促使许多国家加强了药物的生殖毒性评价。由于传统中药一般是按理法方药原则复方配伍应用的, 一般来说安全系数较大, 因此传统中药生殖毒性的研究一直未得到充分重视。但通过现代中药毒理学研究发现, 一些中药在体内外试验中显示出对生殖功能有一定影响。尤其是中药制剂的增多使药物的用法、用量发生变化, 部分中药经现代化学方法提取精制后, 有效成分及有毒成分均相对富集, 疗效提高的同时, 毒性也增强或产生新的毒性。为此, 生殖毒性研究也日益受到重视, 并列入中药新药安全评价中。本文结合传统中医药特点以及生殖毒性评价方法, 主要就现代中药生殖毒性研究进展、中药新药生殖毒性研究思路和方法进行综述。
1 中药妊娠禁忌与生殖毒性传统中医理论把对妊娠有影响的中药列为妊娠禁忌药, 主要指的是药物具有损害胎元以致胎动不安、滑胎和堕胎等副作用。而现代医学的生殖毒性包含更广泛的内容, 包括对受胎能力、生殖系统、胚胎发育及胎仔出生后发育的潜在不良影响, 以及诱导畸胎产生的可能性。妊娠禁忌是中药药性理论的重要方面, 是在长期临床实践中总结出来的宝贵经验。按传统中医理论, 妊娠禁忌中药主要是毒性较强或药性猛烈的药物、活血化瘀药、通经走窜药、泻下药、破气药、辛热药和滑利药等[1]。高氏[2]于1992年曾对有妊娠禁忌药记载的医药著作进行整理, 统计了81部著作中共有妊娠禁忌药七百余种。从理论上来说, 妊娠禁忌药应该具有不同程度的生殖毒性, 而生殖毒性评价除包含终止妊娠外还包括致畸评价、生殖 能力评价等方面内容。目前所报道的许多中药生殖毒性研究是围绕妊娠禁忌进行的, 如芫花、半夏、僵蚕、水蛭和红花等多种中药的生殖毒性已被现代实验所证实[3, 4]。一些在临床上不常见的中止妊娠作用的妊娠禁忌药毒性也通过现代生殖毒性研究得到了验证。如有文献将半夏记载为妊娠禁忌药的频率极高, 但在临床应用中不常观察到其有中止妊娠的作用。然 而, 在致畸敏感期毒性动物试验中显示, 生半夏混悬液 (6 g生药/kg, 相当于临床剂量4.4倍) 和生半夏煎汤 (30 g生药/kg, 相当于临床剂量21.9倍) 给予孕鼠10天后会对胎仔发育产生不良影响[5]。
有些生殖毒性试验的结果与妊娠禁忌药的记载也存在某些不一致性。如有些医书记载的妊娠禁忌药目前还无法得到实验研究的验证, 而一些实验提示具有生殖毒性的中药在古代医书中未见记载, 在临床上也未见毒性反应。这可能是由于动物与人在吸收、代谢等方面存在种属差异造成的。此外, 随着医学的发展和诊疗水平的进步, 中药妊娠禁忌的认识也有了一定的变化。如一些古籍中提到的“胎毒”为现代所说的新生儿感染或过敏性疾病, 如疥疮、湿疹、痈疖、鹅口疮等, 并非生殖毒性[6]。有些中药的生殖毒性是以往没有被认识到的, 在古代医书中也未见有关生殖毒性方面的记载, 但在现代研究中却发现很强的生殖毒性, 如青蒿素及其衍生物从未被列为妊娠禁忌药, 但是实验研究发现青蒿水提物 (100和500 mg·kg-1)[7]和青蒿素 (7.5、15和30 mg·kg-1)[8]给予大鼠14天都有胚胎毒性和致畸作用, 并可延迟幼崽发育; 青蒿琥酯 (40 mg·kg-1) 给药5天可使妊娠和假孕大鼠血清孕酮水平显著下降[9]。扶桑自《本草纲目》开始记载入药, 未见关于其妊娠禁忌的记载, 而在近年研究中却发现扶桑提取物具有抗生育作用[10]。因此, 对中药生殖毒性的认识不应拘泥于文献记载。作为中药的现代制剂, 采用了现代化学提取和制备方法, 其中的化学成分及其含量与传统制剂有很大的区别, 其对生殖系统的影响也可能会有较大的变化。此外, 由于历史条件的限制, 传统医药著作中对中药妊娠毒性的认识多来源于临床使用经验, 缺乏系统严谨的研究, 认识也很局限[11]。因此, 有必要从实验方面加强对中药的生殖毒性研究。
2 中药生殖毒性研究现状关于中药生殖毒性的研究, 在20世纪五六十年代, 除了文献整理以外, 实验室研究的重点在于药物妊娠禁忌是否存在, 且大多局限于药物致流产、堕胎等中断妊娠效果的研究。近年来关于中药生殖毒性的研究, 基本是集中于对单味中药或单味中药的某一成分的生殖胚胎毒性作用研究[6]。当前, 中药新药注册管理办法仅要求对中药注册分类中一类、二类新药和用于育龄人群并可能对生殖系统产生影响的新药 (如避孕药、性激素、治疗性功能障碍药、促精子生成药、保胎药以及遗传毒性试验阳性或有细胞毒作用等新药) 在注册时提供生殖毒性研究材料。而目前研制较多的复方中药新药, 除非方中含有明确对生殖系统产生影响的中药, 一般情况下不要求进行生殖毒性的研究[12]。
目前, 国内外法规认证的生殖毒性研究方法主要为三段试验法。中药的生殖毒性在实验中主要表现为引起怀孕率下降、致流产、致吸收胎和死胎、致畸胎和胎仔发育障碍、致精子数量减少和畸形等。如槟榔[13]、千里光[14]、紫草[15, 16]、雷公藤[17]、半夏[18]、蒲黄[19]、草乌[20]和细辛[21]等中药的水煎液; 朱砂[22, 23]等重金属类中药; 千柏鼻炎片[14]、昆明山海棠胶囊[24]等中药复方制剂均在动物实验中被证明具有生殖毒性。
从中药化学成分着手研究中药的生殖毒性仍是当前研究的主要思路。目前已知中药中与生殖毒性有关的化学成分主要包括生物碱、苷类、蛋白、重金属和挥发油等[25]。如雷公藤甲素可杀伤生精细胞、影响精子生成[26]; 苦参碱有抑制精子活性和致死胎作用[27]; 商陆皂苷可抑制精子活性[28]; 广泛存在于菊科、豆科和紫草科植物中的吡咯双烷生物碱类成分, 如天芥菜碱、野百合碱、倒千里光碱、猪屎豆碱和千里光碱等可引起胎仔发育异常、死胎和胎鼠退化, 并显示有致畸作用[29]。有些具有致癌性的中药也同时具有生殖毒性, 如槟榔[13]、紫草[15]和吡咯双烷生物碱类[29]等既有致癌性, 又有生殖毒性。从理论上来说, 肿瘤细胞在生物学特性上具有胚胎化倾向, 两者在细胞表型上有相似之处。生殖细胞作为产生胚胎的基源细胞对各类毒性物质具有更敏感的反应性。因此, 能引起体细胞遗传损伤的物质很可能会造成生殖细胞的损伤。
3 中药新药生殖毒性的评价方法中药新药生殖毒性评价方法与化学药基本一致, 均是检测受试药物给予机体后是否对亲代生殖系统和胚胎发育过程产生不良影响, 包括药物是否影响受精、着床, 药物对亲代动物生殖功能和维持妊娠、分娩、哺乳的影响, 以及药物是否有致子代动物胎仔死亡、发育迟缓、畸形和出生后成长和发育异常等作用。ICH和我国新药临床前研究指南有关生殖毒性试验的规定大体上一致, 均将三阶段生殖毒性试验作为新药生殖毒性评价项目[30, 31]。包括一般生殖毒性试验 (Ⅰ段)、致畸敏感期毒性试验 (Ⅱ段) 和围产期毒性试验 (Ⅲ段)。Ⅰ段试验于妊娠前和妊娠初期给药, 以检测受试物对亲代受胎能力和生殖系统的可能影响。在Ⅰ段试验中, 雄性动物给药4~10周, 雌性给药2周, 雄性动物给药期应持续整个交配期直至处死, 雌性动物至少应持续至胚胎着床 (妊娠第6~7天)。观察动物体征、体重、摄食量变化, 检查药物是否对动物的交配情况产生影响, 尸检过程中着重检查动物生殖器官的变化, 并进行精子活力和着床情况检查。Ⅱ段试验于胎儿器官发生期给药, 以检测受试物可能的胚胎毒性和致畸性。大鼠妊娠第6~15天给药, 家兔妊娠第6~18天给药。观察动物体征、体重、摄食量变化, 尸检过程中着重检查孕鼠受胎情况, 测量胎仔体重和身长。Ⅲ段试验于围产期和哺乳期给药, 以检测受试物对分娩、哺乳以及胎儿晚期发育、出生后生长和发育等的可能影响。动物在妊娠第15天至离乳期间给药。观察动物体征、体重、摄食量变化, 观察药物对孕鼠分娩的影响并对子代动物存活、生长发育和行为情况进行观察。
进行生殖毒性试验原则上应尽量选择操作容易、繁殖力强、产仔多、自然流产率和死胎率低、对发育毒性反应敏感、胎盘结构和功能与人接近的动物。目前推荐使用的啮齿类动物多为大、小鼠, 非啮齿类动物为家兔。试验需选用性成熟未交配过的健康动物。中药生殖毒性试验采用的给药途径一般与临床给药途径一致, 致畸敏感期试验不宜采用腹腔注射给药。一般来说, Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ段试验受试药均需设3个剂量组, 此外还应设正常对照组、溶剂对照组和阳性药对照组。生殖毒性试验中关于受试药对亲代生殖器官影响的观察可并入重复给药试验的观察中[32]。
4 中药新药生殖毒性体外替代评价方法20世纪90年代末欧洲替代方法研究中心 (European Center for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) 经全球多个实验室合作验证后推荐了全胚胎培养试验 (whole embryos culture, WEC)[33]、胚胎细胞微团培养试验 (micromass, MM)[34]和胚胎干细胞试验 (embryonic stem cell test, EST)[35]作为生殖毒性试验的体外替代方法。WEC是采用器官形成期的胚胎进行体外培养, 观察受试药物对致畸敏感期胚胎生长发育和组织器官分化的影响。将9.5天的胚胎从母体分离后在含受试物的血清中培养48 h后, 对胚胎生长发育指标进行测量并对胚胎组织器官分化指标进行评分。EST是应用胚胎干细胞的体外特性测试药物对细胞及个体的发育毒性和致畸能力, 通过测试培养细胞的分化、增殖和活性提示受试物的胚胎毒性潜力。MM是介于单细胞培养和器官培养之间的体外实验技术, 通过观察培养细胞集落形成数量、细胞形态、基质变化和超微结构的变化评价化学物质的毒性作用[36]。WEC、EST和MM的实验结果与体内试验结果具有较好的一致性, ECVAM进行的体外胚胎毒性试验方法验证研究中, WEC、EST和MM与体内试验预测符合率分别为72%、81% 和79%[37]。中药成分复杂、代谢产物多样, 如按照体内实验方法寻找产生生殖毒性的化学成分和进行生殖毒性机制研究需要耗费大量实验动物和受试药, 而采用体外替代方法在很大程度上弥补了这方面的不足。目前已有一些采用体外替代方法进行中药胚胎毒性的研究, 如采用WEC方法评价人参皂苷[38, 39]、千里光碱[40]、倒千里光碱[41]和生草乌[42]等中药单体成分或中药水煎液的胚胎毒性和毒性反应机制; 采用EST法结合中药血清化学研究方法研究黄芩[43, 44]、小半夏加茯苓汤[45]的胚胎毒性。
5 展望 5.1 传统中医药理论的现代论证方法可能为中药生殖毒性研究另辟蹊径传统中医药理论是建立在阴阳五行论基础上的, 其认为疾病或毒性的产生均是人体阴阳失衡, 五行缺失造成的, 这与西方医学的物质基础观大相径庭, 因此采用现代西方医学方法研究中药生殖毒性难免存在一定的片面性。近年来, 传统中医理论的现代论证方法广泛被研究, 科研工作者尝试将人体阴阳、虚实、表里以及中药寒热辛温等方向应用现代科学理论进行阐述, 这可能为中药生殖毒性研究提供新的研究思路。
5.2 毒性研究法规和安全性评价机构的完善为中药生殖毒性研究的规范性提供了保障自1961年发生的沙利度胺 (反应停) 事件后, 美国社会争论多年的《食品、药品和化妆品法》修正案最终获得通过, 并于1966年颁布了第一个药物安全性测试指导原则[46]。目前, 关于药物生殖毒性研究, 国际和国内都有专门的指导原则进行说明[30, 31]。近年来药物安全性评价得到了国际和国内社会的高度重视, 目前我国已有50多个GLP安全性评价机构通过了国家食品药品监督管理总局 (前国家食品药品监督管理局) 的认证[47, 48], 其中多个机构还通过了OECD的认证和FDA的检查, 使得我国包括生殖毒性评价在内的药物安全性评价越来越规范。
5.3 先进的分析方法和仪器装备为中药生殖毒性成分和机制研究提供了支撑目前绝大多数已上市中药在上市前未经过严格的生殖毒性测试与危险评估。但实验发现, 一些妊娠常用药和安胎药中甚至含有致早产、致畸作用的成分, 这势必对中药安全性带来影响, 且严重制约了中药的发展[49, 50, 51]。即使是已开展生殖毒性研究的中药, 其水平也一般只停留在毒性有无的层面上, 而对中药的具体生殖毒性成分和导致生殖毒性产生的机制研究甚少。随着高分辨质谱、核磁等现代分析设备, 以及基因组学、代谢组学等研究分析方法的完善, 势必为中药生殖毒性成分和机制研究提供强有力的支撑。
5.4 体外评价方法促进了符合3Rs原则的中药生殖毒性研究中药成分多样, 代谢产物复杂, 单体成分含量低, 采用传统体内生殖毒性试验寻找产生生殖毒性的化学成分和进行生殖毒性机制研究需要消耗大量动物和受试药物。WEC、EST和MM等体外替代实验方法与体内实验所得到的结果具有较好的一致性, 能有效降低实验耗费, 缩短实验周期, 符合国际上所提倡的3Rs原则, 适用于中药成分生殖毒性的筛选和毒性机制的研究。但中药在临床上往往使用 粗制剂, 且各种成分会产生一定的相互作用, 如果提取单一成分进行短期筛查, 可能将药物单一方面的作用放大, 产生假阳性结果[52]。此外, WEC、EST和MM等体外替代实验方法目前应用于中药生殖毒性评价的研究较少, 经验有限。但随着这些方法在实践中的应用和相关经验的积累, 未来应该会在毒性评价和毒性机制研究方面得到广泛应用。
中药新药上市前进行完善的生殖毒性评价能有效减少药物引起的新生儿缺陷, 提高人口质量, 中药的生殖毒性评价, 是中药安全性评价的重要组成部分, 应给予足够重视, 为新药的研发和临床工作者的选择应用提供有力依据。
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