药学学报  2014, Vol. 49 Issue (10): 1446-1450   PDF    
应用UPLC-Orbitrap质谱分析鲜蟾酥与干蟾酥化学成分差异
贺晶, 李艳, 司南, 赵海誉, 边宝林, 王宏洁     
中国中医科学院中药研究所, 北京 100700
摘要:为阐明鲜蟾酥的化学成分以及鲜蟾酥与干蟾酥化学成分差异,本研究对黑眶蟾蜍的新鲜耳后腺分泌液及干蟾酥中的化学成分进行了比较研究。采用超高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap MS)技术,以乙腈和水(含体积比0.1% 甲酸)为流动相对其进行梯度洗脱,并在高分辨质谱正离子在线检测模式下,通过比对化合物的精确分子量及质谱碎片信息对其中39个主要色谱峰进行了鉴定。鲜蟾酥及干蟾酥主要成分的化学模式存在较大差别,与干蟾酥相比,鲜蟾酥在蟾毒配基类成分上的含量低、种类少。
关键词鲜蟾酥     化学成分     UPLC-Orbitrap MS    
Comparison of the chemical composition between fresh and dried Venenum Bufonis by UPLC-Orbitrap MS
HE Jing, LI Yan, SI Nan, ZHAO Hai-yu, BIAN Bao-lin, WANG Hong-jie     
Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
Abstract: To identify the active components in Bufo melanostictus Schneider and clarify the difference between fresh and dried Venenum Bufonis, a UPLC-Orbitrap MS method has been established. The separation was performed with gradient elution of acetonitrile and water (with 0.1% formic acid) as mobile phase. By comparing their retention time and high resolution mass data of Venenum Bufonis extracts, 39 effective components were primarily identified by MS/MS analysis in positive ion mode. Twenty-six of them were bufadienolides. There were significant differences in the main composition between fresh and dried Venenum Bufonis. There are fewer bufadienolides in fresh toad venom.
Key words: toad venum     chemical profile     UPLC-Orbitrap MS    

蟾酥性味甘辛、温,有毒[1],为我国传统药材,具有消炎解毒,止痛,强心等功能[2,3]。临床抗肿瘤活性,疗效确切,且不良反应小。化学研究表明,蟾蜍毒素、蟾毒配基和蟾毒色胺类化合物是蟾酥的主要成分[4]。不同炮制方法对其中蟾毒配基类成分的含量会有升高或降低的影响[5]。近年来,鲜蟾酥的化学成分及其与干蟾酥的成分转化研究日益增多。研究显示,随放置时间延长,鲜蟾酥中蟾蜍毒素类成分会转化为相应的配基类成分[6],但鲜蟾酥与干蟾酥化学成分种类及含量的区别却鲜有报道。本文采用UPLC-Orbitrap MS高分辨液质联用技术将鲜蟾酥及干蟾酥对照药材的化学成分进行了对比研究,共检测发现了其中39种成分,通过与9种对照品比对分析,并结合化合物的精确分子量及其质谱碎片信息,对未知化合物进行了分子式的计算和部分化合物的结构推导,鉴定了其中35种成分,对于未鉴定出的化合物,本文列出了其精确分子量及可能的分子式组成,旨在阐明鲜蟾酥的组成及鲜、干蟾酥成分的区别,以提高药材利用度。

材料与方法 仪器与材料

双压线性离子阱串联高分辨质谱Orbitrap Velos Pro (Thermo Fisher公司); 戴安Ultimate 3000超高效液相色谱仪; 高速冷冻离心机 (Thermo Fisher HEREUS MULTIFUGE X1R centrifuge); 0.22 μm有机滤膜 (津腾尼龙66,天津市津腾实验设备有限公司)。对照品: 日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾毒精、华蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒精和酯蟾毒配基,购自北京赛百草科技有限公司,纯度均 > 95%。供试品: 蟾酥 (购买于中国食品药品检定研究院,批号: 121132-201304); 鲜蟾酥 (由北京房山阎村新生蟾蜍养殖中心提供),用于取耳后腺分泌物的蟾蜍经中国中医科学院中药研究所胡世林研究员鉴定为黑眶蟾蜍。

对照品溶液制备

分别精密称取各对照品,加适量甲醇溶解后定容,配制成混合对照品溶液,0.22 µm微孔滤膜滤过,即得。

供试品

取黑眶蟾蜍,用自制塑料刮瓶刮取蟾蜍耳后腺体得黑眶蟾蜍新鲜耳后腺分泌液,分别取干蟾酥及新鲜分泌液少量于小瓶中,加入含30% 水的乙醇溶解,超声30 min后,室温10 000 r转速下离心10 min,取上清液经0.22 µm微孔滤膜滤过,即得供试品。

色谱条件

色谱柱为Thermo BDS HYPERSIL C18 (150 mm × 2.1 mm,2.4 μm); 流动相: 乙腈 (A) - 0.1% 甲酸水 (B); 梯度洗脱程序: 0~2 min,5%~20% A; 2~11 min,20%~30% A; 11~14 min,30%~48% A; 14~17 min,48%~100% A; 17~21 min,100% A; 流速: 0.2 mL·min-1; 柱温: 25 ℃; 进样量: 3 μL; 在线紫外检测波长扫描范围: 190~400 nm。样品盘温度: 4 ℃。

质谱条件

电喷雾离子源 (ESI),扫描模式: 正离子; 毛细管喷雾电压: +5 kV; 毛细管温度: 350 ℃; 鞘气气流: 35 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); 辅助气流: 10 psi; 扫描范围: m/z 50~800; 分辨率: 30 000。

检测方法

取上述供试品及混合对照品溶液各1 mL于液相小瓶,摇匀,注入LTQ-Orbitrap Velos Pro液质联用仪进行测定。

数据分析

根据测得的精确相对分子质量,应用Thermo Xcalibur 2.2 SP1.48处理软件在规定的误差范围内(误差在 ± 5 ppm内) 计算可能的元素组成,并结合各个成分峰的二级质谱碎片信息和文献报道数据及对照品比对,对色谱峰进行定性分析。

结果与讨论

蟾酥中主要强心及抗肿瘤活性成分为蟾蜍二烯羟酸内酯和吲哚生物碱。结果显示,鲜、干蟾酥中生物碱类成分含量整体较低,配基类成分在鲜蟾酥中的含量较干蟾酥低,但在此色谱条件下,集中在保留时间为8~12 min内的成分在鲜蟾酥中含量相对较高且集中,以下为对照品及未知化合物的推导过程。

1 对照品LC-HR-MS分析

蟾酥中游离型配基类成分的结构主要有环氧与羟基取代两种类型,高分辨质谱数据显示,所有对照品的一级质谱均出现 [M+H]+ (基峰)、[M+Na]+ 等主要峰,对照品的二级质谱一般出现脱去不同个数的水 (18 Da) 和羰基 (28 Da) 后的碎片和母核的碎片。沙蟾毒精为色谱中较早出峰的羟基取代型配基类成分,其一级质谱出现 [M+H]+ (C24H32O6,m/z 417.228 01,error: 2.0 ppm) 峰及[M+Na]+ (C24H32O6Na,m/z 439.209 67,error: 1.3 ppm) 峰。在MS/MS二级质谱中,在m/z 399.218 05 (C24H31O5) 处发现 [M+H-H2O]+ 碎片离子,在m/z 381.207 31 (C24H29O4) 处发现 [M+H-2H2O]+ 离子,并在m/z 363.196 81 (C24H27O3) 处发现 [M+H- 3H2O]+ 离子。连续丢失2个羟基后又脱去12位羰 基形成的 [M+H-2H2O-CO]+ 碎片离子和丢失3个羟基之后又脱去一分子羰基形成的 [M+H-3H2O-CO]+ 碎片离子分别在m/z 353.212 34 (C23H29O3) 及m/z 335.201 66 (C23H27O2) 处也被发现 (图 1)。此外,对于分子中含有乙酰基的物质,在MS/MS二级质谱中,都会首先脱去一分子乙酰基,再进行脱水、脱羰基的裂解 (图 2)。

Figure 1 Arenobufagin fragmentation pathway

Figure 2 Cinobufotalin fragmentation pathway
2 干鲜蟾酥化学成分的质谱分析

通过与对照品保留时间和质谱行为的比较,15、18、 30~32、35、37~39号峰分别鉴定为日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基。详见表 1

Table 1 MS and MS/MS data of the identified components between fresh and dried Venenum Bufonis in positive mode. Compounds which could only be tested in dry Venenum Bufonis. The black bold m/z values in UPLC-Orbitrap MS/MS represented the base peaks. a,bIsomers

根据其ESI质谱多级裂解碎片信息,本研究对蟾酥药材中的35种化合物进行了结构鉴定,在对照品质谱裂解规律的基础上,推断了它们的母核类型及取代基的种类与个数,进一步通过与文献及化合物色谱行为比对,对所推测化合物的结构进行了确证。

2.1 蟾毒配基类化合物结构推导

干蟾酥一级质谱中,15、17、21、24和30号峰均给出m/z 403 [M+H]+的基峰,高分辨质谱给出其分子式为C24H35O5,且 误差值均在2.1 ppm以内。在MS/MS及MS3质谱分析中,上述5个化合物也表现出一致的质谱裂解途 径,分别以脱去H2O (18 Da) 和CO (28 Da) 的形式形成碎片峰。通过与文献[7]比较,最终鉴定它们属于日蟾毒它灵 (15号峰)、19-hydroxyl-bufalin (17号峰)、desacetylbufotalin (21号峰)、hydroxylbufalin (24号峰)、远华蟾毒精 (30号峰)[9]; 而鲜蟾酥中仅检测到了15及30号峰。

m/z 417化合物在干蟾酥中有5个同分异构体,其分子式组成为C24H32O6,分别鉴定为13号峰ψ- bufarenogin (tR = 11.52 min,m/z 417.227 94; error 1.9 ppm)、16号峰bufarenogin (tR = 12.27 min,m/z 417.117 98; error 2.0 ppm)、18号峰沙蟾毒精 (tR = 14.03 min,m/z 417.228 01; error 2.0 ppm)、19号峰hellebrigenin异 构体 (tR = 14.63 min,m/z 417.227 90; error 1.8 ppm)、20号峰desacetylcinobufotalin (tR = 14.89 min,m/z 417.227 84; error 1.6 ppm); 而鲜蟾酥的SIM图中只有18~20号3个峰 (表 1)[8]

此外,配基类成分通过出峰位置、分子量范 围、裂解碎片信息及文献查询,推测tR = 15.27 min,m/z 459.238 55 (C26H34O7; error 1.8 ppm) 的23号峰为cinobufaginol[9]; tR = 16.89 min的33号峰,其m/z 399.217 23 (C24H30O5; error 1.6 ppm),因为峰位于相对集中的配基类成分的出峰位置上,且分子量符合配基类成分的分子量范围,裂解规律如上述所示先脱一分子水后脱羰基,之后又进行脱水与脱羰基的裂解,故推测其为环氧型配基类化合物,经文献比 对,推测其为resibufagin。

2.2 吲哚生物碱类化合物结构推导

吲哚类生物碱极性较大,出峰时间早,本研究中多在前7 min流出。保留时间tR = 4.67 min的1号峰,其高分辨全扫描质谱给出m/z 177.102 57 (C10H12N2O; error 1.8 ppm) 的[M+H]+峰,在多级裂解里可以清楚的看到其脱去一个甲基得到m/z 160.076 00的峰,说明该化合物为蟾酥中吲哚类生物碱,通过文献[10]比较,与五羟色胺相吻合。采用类似的方法,通过比较给出的高分辨母离子信息和多级质谱信息,2、3、4、5、7和8号峰分别鉴定或初步鉴定为N-甲基五羟色胺 (2号峰)、蟾蜍噻咛 (3号峰)、蟾蜍色胺 (4号峰)、蟾毒色胺内盐同分异构体 (5号峰)、蟾毒色胺内盐同分异构体 (7号峰) 及去氢蟾蜍色胺 (8号峰)[11]

2.3 氨基酸及肽类化合物结构推导

保留时间tR = 5.53 min的6号峰,其[M+H]+峰质荷比为m/z 317.182 80 (C13H24O5N4; error 2.7 ppm),结合文献鉴定其为庚二酰精氨酸。在tR = 6.91 min检测到9号峰辛二酰精氨酸m/z 331.198 10 (C14H26O5N4; error 1.5 ppm)[12]

2.4 未知成分高分辨质谱数据分析

由总离子流可知,在保留时间tR = 8~12 min,出现一组强离子响应物质,其在鲜蟾酥中的比例远远高于干蟾酥。经高分辨数据鉴定得出在8.54 min (10号峰) 和11.78 min (14号峰) 均出现m/z 453.340 75的物质,根据其精确分子量得出精确分子式为C23H48O8。在9.64 min检测到了m/z 566.423 16 (C25H56O7N7; error 0.7 ppm) 的物质 (11号峰),并在10.57 min检测到了m/z 340.257 12 (C18H34O3N3; error 6.9 ppm) 的物质 (12号峰)。此类物质的高分辨数据给出的分子式组成及比例相似,但其结构鉴定尚未很明确。由于在鲜蟾酥中含量甚 高,在干蟾酥中却未找到,故此类物质极易改变,其出峰时间又早于配基类成分,推测其可能为鲜蟾酥中部分易转变为配基类成分的物质。本文通过用UPLC-Orbitrap MS技术测出其高分辨数据,以期能更好的帮助分析此类化合物 (表 1)。

3 鲜蟾酥及干蟾酥成分比较

蟾蜍噻咛在鲜蟾酥中含量甚微,在干蟾酥中含量稍大于鲜蟾酥。在蟾酥中,二肽类成分主要以辛二酰精氨酸和庚二酰精氨酸为主,有文献[13]报道其结合型配基类成分也多倾向于与此两种氨基酸结合形成相应酯类成分。

蟾毒配基类成分是蟾酥中主要的活性成分之一。对配基类成分的数据分析显示干蟾酥中的配基类化合物种类明显多于蟾酥鲜浆,如上述m/z 403及m/z 417的物质,在干蟾酥中,两物质各有5种同分异构体,而在鲜蟾酥中却只分别检测到了2种和3种,且含量很低。此外,通过干蟾酥和鲜蟾酥与现有配基对照品进行比对发现,两种蟾酥均含有已知9种配基类成分,但含量高低有所不同。鲜蟾 酥中相同分子量的日蟾毒它灵 (15号) 含量低于远华蟾毒精 (30号),干蟾酥则相反。结合鲜蟾酥中存在8~12 min的物质在干蟾酥中未检测到 (图 3),可以推断放置时间的延长,使鲜蟾酥中所含物质的组成及比例发生改变。总体来说,干蟾酥的配基类成分的种类及含量均高于鲜蟾酥,提示随时间的延长,鲜蟾酥中部分成分会转变为配基类成分。故传统的蟾酥放置后再加工处理有助于增高蟾毒配基类成分的含量[14]

Figure 3 TIC of dried (A) and fresh (B) toad venom
结论

鲜蟾酥与干蟾酥所含化合物在种类及含量上均存在区别。鲜蟾酥中含有蟾蜍甾烯类成分,经放置后主要的配基类成分含量呈增加趋势且种类更加丰富。

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