药学学报  2014, Vol. 49 Issue (10): 1442-1445   PDF    
引用本文
FAN Wu-tu, WU Xiang-long, PAN Ya-lei, NIU Yin-bo, LI Chen-rui, MEI Qi-bing. Synthesis and antifatigue activities of new benzamide derivatives[J]. Acta Pharm Sin, 2014, 49(10): 1442-1445.  
范於菟, 武祥龙, 潘亚磊, 牛银波, 李晨睿, 梅其炳. 新型苯甲酰胺类化合物的合成与抗疲劳活性研究[J]. 药学学报, 2014, 49(10): 1442-1445.  
新型苯甲酰胺类化合物的合成与抗疲劳活性研究
范於菟1, 武祥龙2, 潘亚磊2, 牛银波2, 李晨睿2, 梅其炳2,3     
1. 三峡大学生物与制药学院, 天然产物研究与利用湖北省重点实验室, 湖北 宜昌 443002;
2. 西北工业大学生命学院, 空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室, 陕西 西安 710072;
3. 第四军医大学药学院药理教研室, 陕西 西安 710032
收稿日期: 2014-5-4;修回日期: 2014-7-21.
基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项（2008ZXJ09004-024）；国家自然科学基金资助项目（21202130）
* 通讯作者：qbmei@nwpu.edu.cn
摘要：为寻找以AMPA受体为作用靶点的新型抗疲劳化合物，以1-（1，3-benzodioxol-5-ylcarbonyl）piperidine（1-BCP）为先导化合物，设计合成了10个新化合物，结构经1H NMR、ESI-MS及元素分析确证。采用小鼠负重游泳实验评价目标化合物抗疲劳活性，采用放射性配体受体结合实验测定化合物与AMPA受体的亲和力。结果表明，化合物5b具有显著的抗疲劳活性，且与AMPA受体的亲和力较强，值得进一步深入研究。
关键词： 苯甲酰胺类化合物     合成     疲劳     AMPA受体    
Synthesis and antifatigue activities of new benzamide derivatives
FAN Wu-tu1, WU Xiang-long2, PAN Ya-lei2, NIU Yin-bo2, LI Chen-rui2, MEI Qi-bing2,3     
1. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Biology and Pharmacy, China Three Gorges University, Yichang 443002, China;
2. Key Laboratory for Space Biosciences and Biotechnology, School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, Xi'an 710072, China;
3. Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China
Abstract: To explore novel antifatigue agents targeting with AMPA receptor, 10 compounds were synthesized and their structures were confirmed by 1H NMR, ESI-MS and elemental analysis. 1-BCP was treated as the leading compound. The antifatigue activities were evaluated by weight-loaded forced swimming test, and the AMPA receptor binding affinities were tested with radioligand receptor binding assays. The results unveiled that 5b appeared to possess potent antifatigue activities and high affinity with AMPA receptor, which deserved further studies.
Key words: benzamides     synthesis     fatigue     AMPA receptor    

当今社会快节奏生活方式下,疲劳普遍存在,其对人类工作效率及生活质量的影响日益突出。尤其对于特殊职业人群如驾驶员、飞行员、航天员,长期受疲劳困扰,影响身心健康,甚至带来安全隐患。疲劳是一种机体生理过程不能持续其机能在一特定水平上或不能维持预定的运动强度的状态[1]。其主要表现为倦怠、乏力、烦躁,工作效率下降,身体与精神状态不佳。轻度的疲劳,经适当的休息,合理的调整,便可恢复; 若疲劳长期积累不能消除,便可逐渐发展成为慢性疲劳综合征,危害身心健康[2]。目前临床用于缓解疲劳保持觉醒的药物主要为传统的中枢兴奋性药物如苯丙胺、咖啡因、麻黄碱等,以及新型中枢兴奋性药物莫达非尼。但苯丙胺、咖啡因、麻黄碱等传统中枢兴奋性药物均会引起如淡漠、判断障碍、过度的兴奋,甚至加重焦虑导致精神失常等不良反应而逐渐被淘汰。被誉为“不夜神”的莫达非尼虽然能显著缓解疲劳,但近年也曝出具有严重不良反应及潜在成瘾性[3]。因此开发新型抗疲劳药物具有重要意义。

AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) 受体是谷氨酸能神经传递系统一类重要的兴奋性受体,参与突触可塑性、学习记忆、疲劳反应和睡眠觉醒等生理过程[4,5]。美国Cortex公司开发出一类命名为ampakines的AMPA受体调节剂,已有多个候选药物进入Ⅱ期临床试验阶段。其中1-BCP (图 1) 可缓解睡眠剥夺所致的疲劳症状,具有一定的抗疲劳效果,且安全性良好,没有严重不良反应的发生[6]。分子对接结果[7]显示,1-BCP通过结构中N原子与AMPA受体Ser754残基形成氢键,苯环与Leu759、Ile481、Pro494残基形成疏水作用,从而与AMPA受体稳定的结合,提示苯甲酰胺母核为结构必需。本文以1-BCP为先导化合物,保留苯甲酰胺药效团母核,芳环上引入不同位置、不同数目的甲氧基,同时引入“类药性”较高的几种氮杂环,设计、合成出新型苯甲酰胺类化合物5a～5j。测定了目标化合 物与大鼠大脑皮质AMPA受体结合的离解常数Kd值,并进行了初步的体内抗疲劳活性评价,期望获得以AMPA受体为靶点具有抗疲劳活性的化合物。

Figure 1 The structure of 1-BCP
结果与讨论 1 化学合成

合成路线采用活化酯法,以4-甲氧基苯甲酸或3,4-二甲氧基苯甲酸为原料 (1),与活化试剂三氟乙酸N-琥珀酰亚胺酯 (2) 反应,制得相应中间体苯甲酸琥珀酰亚胺酯 (3),再与氮杂环 (4) 缩合,简便合成出目标化合物5a～5j (合成路线1)。所有目标化合物均未见文献报道,且结构经1H NMR、ESI-MS及元素分析确证。目标化合物的结构、产率、物理常数见表 1,1H NMR、MS及元素分析数据见表 2。

Table 1 Physical properties of target compounds 5a-5j

Table 2 1H NMR,ESI-MS and elemental analysis data of target compounds 5a-5j
2 抗疲劳活性研究

采用小鼠负重游泳实验研究化合物的抗疲劳活性,负重游泳时间作为评价抗疲劳活性的直接指标。以预实验为基础,确定给药剂量为2×10-6 mol·g-1,连续给药一周。末次灌胃30 min后,在小鼠尾根部负载5% 体重的铅丝,将小鼠置于游泳池中,记录小鼠自入水至沉入水底10 s内不再浮出水面为止的时间,作为小鼠负重游泳的时间。结果 (表 3) 表明,化合物5a、5b、5c、5f、5g、5h相比生理盐水组均可延长小鼠负重游泳时间,表明具有抗疲劳活性,其中化合物5b抗疲劳活性最为显著,效果优于阳性对照药物咖啡因。

Table 3 Effect of target compounds on the forced swimming time of mice. The values are expressed as mean ± SD (n = 10). P < 0.05,**P < 0.01 vs control group,##P < 0.01 vs caffeine group
3 受体亲和力测试[8]

采用放射性配体受体结合实验,测定1 mmol·L-1浓度的目标化合物与大鼠大脑皮质AMPA受体结合的离解常数Kd值。结果 (表 4) 表明,化合物5b、5c与AMPA受体具有较强的亲和力。

Table 4 The Kd values of target compounds. n = 5,± s

初步的构效关系表明,苯环上取代基对活性的影响顺序为4-甲氧基 > 3,4-二甲氧基,引入4-甲氧基有利于抗疲劳活性及与AMPA受体的亲和力; 氮杂环部分对活性的影响顺序为吗啡啉 > 哌啶 > 吡咯烷 > 4-甲基哌啶 > 1-甲基哌嗪,其中引入吗啡啉环、哌啶环有利于抗疲劳活性,1-甲基哌嗪环非活性所必需。

4 小结

以4-甲氧基苯甲酸或3,4-二甲氧基苯甲酸为原料,通过两步反应简便合成出了新型苯甲酰胺类化合物。采用小鼠负重游泳实验研究了目标化合物的抗疲劳活性,并测定了化合物与AMPA受体的亲和力。

结果显示,化合物5b具有显著的抗疲劳活性且与AMPA受体的亲和力较强,本研究结果为该类化合物的后续研究提供了实验基础。

Scheme 1 Synthetic routes of target compounds 5a-5j
实验部分

X-4型数字显微熔点仪 (温度未校正); Varian INOVA-400 Hz型核磁共振仪 (溶剂CDCl3,内标TMS); 岛津AXIMA CFR Plus MALDI-TOF型质谱仪; Vario ELⅢ CHNOS型元素分析仪。所用试剂和溶剂均为市售分析纯。

1 化学合成 1.1 三氟乙酸N-琥珀酰亚胺酯 (2)[9]的合成

反应瓶中加入三氟乙酸酐300 mL (2.12 mol),搅拌中分批缓慢加入N-羟基琥珀酰亚胺58.12 g (0.53 mol),室 温搅拌8 h。减压蒸除溶剂得淡黄色冰状固液混合物 (94.74 g,产率89%)。取少量样品加入甲醇中,有气泡冒出,表明产物活性好,合成成功。无需提纯,可直接使用。

1.2 中间体苯甲酸琥珀酰亚胺酯 (3) 的合成

以4-甲氧基苯甲酸琥珀酰亚胺酯的合成为例。取4-甲氧 基苯甲酸1.52 g (0.01 mol) 溶解在50 mL CH2Cl2中,加入无水吡啶 (4 mL),溶解完全后加入6.33 g三氟乙酸N-琥珀酰亚胺酯 (0.03 mol),室温搅拌4 h,减压蒸除溶剂,剩余物加入CH2Cl2溶解完全,等体积的1 mol·L-1盐酸洗涤3次,有机相用无水Na2SO4干燥,减压蒸除溶剂得白色固体2.23 g,产率86%。熔点167～168 ℃; 1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ 2.89 (s,4H),3.89 (s,3H),6.97 (d,2H,J = 8.8 Hz),8.09 (d,2H,J = 8.8 Hz); ESI-MS (m/z): 260 [M+H]+。以3,4-二甲氧基苯甲酸为原料按同法可制得3,4-二甲氧基苯甲酸琥珀酰亚胺酯,白色固体2.45 g,产率88%。熔点221～222 ℃; 1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ 2.92 (s, 4H),3.94 (s,6H),6.94 (d,1H,J = 8.8 Hz),7.57 (s,1H),7.82 (d,1H,J = 6.8 Hz); ESI-MS (m/z): 280 [M+H]+。

1.3 目标化合物 (5a～5j) 的合成

以目标化合物5a的合成为例。取4-甲氧基苯甲酸琥珀酰亚胺酯2.49 g (0.01 mol) 加入到50 mL CH2Cl2中,搅拌溶解完全后,加入1.71 mL哌啶 (0.02 mol),室温搅拌6 h,等体积的1 mol·L-1盐酸洗涤3次,有机相用无水Na2SO4干燥,减压蒸除溶剂,剩余物用无水乙醇重结晶得白色固体1.82 g,产率83%。其余目标化合物可按同法制得,理化常数、1H NMR、MS及元素分析数据见表 1、表 2。

2 抗疲劳活性测试

采用小鼠负重游泳实验对目标化合物进行抗疲劳活性测试。在自制的游泳水池中,对小鼠进行游泳适应性训练,每天训练1 h,连续训练3天,剔除游 泳时间过长或过短的小鼠后,将符合条件的小鼠随机分为生理盐水对照组、咖啡因阳性对照组和各化 合物给药组,每组小鼠雌雄各半,每组10只。以预实验为基础,确定给药剂量为2×10-6 mol·g-1,化合物 均先用5% 无水乙醇 (V/V) 溶解后,加生理盐水补足体积,斡旋混匀,灌胃给药,空白对照组给予等体积的生理盐水,连续给药7天。末次给药30 min后,在小鼠尾根部负载5% 体重的铅丝,放入游泳水池中,池壁光滑,水温调节至 (28 ± 1) ℃,以小鼠沉入水底10 s内不再浮出水面,视为力竭标准。从游泳开始到力竭的时间即为小鼠游泳时间,记录并加以比较。实验结果以均数 ± 标准差 (mean ± SD) 表示,各组间差异的比较采用One-way ANOVA检验分析,数据分析采用SPSS12.0统计软件,P < 0.05表示差异有统计学差异。

3 受体亲和力测试

采用放射性配体受体结合实验测定目标化合物与AMPA受体的亲和力,测定指标为化合物与AMPA受体结合的Kd值,具体操作过程参照文献[8]实施。

参考文献
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新型苯甲酰胺类化合物的合成与抗疲劳活性研究
范於菟, 武祥龙, 潘亚磊, 牛银波, 李晨睿, 梅其炳