葛根为豆科植物野葛 (Pueraria lobata (Willd.) Ohwi) 的干燥根,临床上葛根素注射液常用来治疗和预防冠心病、心绞痛、心肌梗死等多种心脑血管疾病^[1]。前期研究结果表明,在缺血再灌注损伤模型大鼠上,PEG化葛根素中、高剂量组的药效明显强于葛根素注射液组^[2]。从药代动力学结果分析,PEG化葛根素组释药缓慢,最初的血药浓度甚至低于葛根素注射液组^[3],推测PEG化葛根素很有可能在缺血模型大鼠的心肌组织部位有蓄积,为了论证该假说,笔者首次设计了PEG化葛根素在急性心肌缺血模型大鼠和正常大鼠组织分布的对比实验,探索PEG化葛根素在模型大鼠组织器官中药物分布方面的特点。

LC-20A高效液相色谱仪 (日本岛津公司),SPD-20A紫外检测器 (日本岛津公司),TTL- DCII型多功能氮吹仪 (北京同泰联科技发展有限公司)。

葛根素对照品 (批号: 110752- 200811,供含量测定用,纯度≥98%,中国食品药物检定研究院); 鸢尾苷内标物 (批号: 611-40-5,供含量测定用,纯度≥98%,上海诗丹德生物技术有限公司); PEG化葛根素 (葛根素的质量分数为4.1%,纯度: 97%～98%,分子质量约为10 kDa,本院临床药学研究所合成); 甲醇、乙腈 (色谱纯,美国Fisher试剂公司); 乙酸(分析纯≥9 9.5%,北京化学试剂公司); 其他试剂均为分析纯。

雄性SD大鼠,购于中南大学湘雅二医院实验动物中心,实验动物使用许可证: SYXK (湘) 2011-0013。

Agilent C18柱 (250 nm× 4.6 nm,5 μm); 以乙腈和0.2% 磷酸水为混合流动相进行梯度洗脱。洗脱程序为: 0～8 min,乙腈: 11% → 25%,0.2%磷酸水: 89% → 75%; 8～17 min,乙腈: 25% → 11%,0.2% 磷酸: 75% → 89%; 柱温: 30 ℃; 检测波长: 250 nm; 流速: 1.0 mL·min^-1; 进样体积: 40 μL。

精密称取葛根素对照品5 mg于25 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得浓度为200 μg·mL^-1的葛根素甲醇储备液,精密量取上述葛根素储备液适量,分别置于10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成葛根素质量浓度分别为0.4、1. 0、2.0、5.0、10.0、15.0和20. 0 μg·mL^-1系列标准溶液,置4 ℃冰箱中保存。

精密称取鸢尾苷7.5 mg于10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,再精密吸取1 mL于100 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得浓度为7.5 μg·mL^-1鸢尾苷的内标溶液,以上溶液均置于4 ℃冰箱中保存备用。

各组织样品按实际称取重量,以质量体积比1∶2加入生理盐水,制成组织匀浆液。精密移取组织匀浆液500 μL,置于5 mL洁净EP离心管中,添加12% 乙酸溶液40 μL,再加入鸢尾苷内标液 (7.5 μg·mL^-1) 40 μL,涡旋混匀1 min,再加入色谱甲醇1 mL,涡旋混合5 min,15 000 r·min^-1离心 5 min,吸取上清液转移至10 mL具塞离心管中,置于40 ℃水浴氮气流下吹干,残留物加入丙二醇-醋酸缓冲液 (pH 4.8,50∶50,v/v) 100 μL溶解并混匀,取40 μL进样^[5]。

取大鼠空白肝组织匀浆,除不加内标溶液外,其余按“样品的处理”项下操作,获得空白样品色谱图; 将一定浓度的葛根素标准溶液和内标溶液加入大鼠空白肝组织匀浆,同法操作,获得相应色谱图。取大鼠给药后30 min的肝组织匀浆样品,同法操作得到给药后大鼠肝组织样品色谱图。

取大鼠空白组织匀浆各500 μL,加入葛根素系列标准溶液50 μL,配制成相当于葛根素组织浓度为0.04、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0和4.0 μg·g^-1样品,按“样品的处理”进行操作,进样40 μL,记录色谱图。以葛根素的浓度为横坐标,葛根素与内标物的峰面积比值为纵坐标,按加权 (W = l/C²) 最小二乘法进行线性回归,求得的回归方程即为标准曲线。

取空白肝组织匀浆及葛根素储备液适量,按“样品的处理”进行操作,配制0.08、0.8和2 μg·g^-1 3种不同浓度的质控 (QC) 样品,各浓度平行制备6份,连续测定3天,并与标准曲线同时进行。计算QC样品的测得浓度,与配制浓度对照,求得组织样品测定方法的准确度与精密度。

按“样品的处理”方法制备葛根素的肝组织匀浆低、中、高3个浓度的QC样品,各浓度平行制备5份,以提取后的色谱峰面积与未经提取直接进样获得的色谱峰面积之比,考察样品的提取回收率。

按“样品的处理”方法制备葛根素的肝组织匀浆低、中、高3个浓度的QC样品,考察匀浆样品在室温放置12 h、处理后4 ℃放置24 h、反复冻融3次以及于 -70 ℃环境中放置2周的稳定性。

其余组织样本的方法专属性、精密度、准确度、回收率和稳定性与肝组织匀浆处理方法类似。

取雄性SD大鼠60只,随机分成两组,每组30只,给药前禁食12 h,自由饮水,采用尾静脉注射给予PEG化葛根素,给药剂量为488 mg·kg^-1,给药5 min后,其中一组大鼠采用50 mg·kg^-1异丙肾上腺素腹腔注射给予造成急性心肌缺血模型,另外一组为正常大鼠,分别于给药后30、60、90、120、150和180 min处死动物,取部分大鼠脏器: 心、肝、脾、肺、肾和脑,采用生理盐水洗净表面浮血,滤纸吸干,置 -70 ℃冷冻保存。测定前取出组织样本,解冻,称质量,剪碎,加入2倍量生理盐水在冰浴中制成组织匀浆。将得到的大鼠组织匀浆样品按“样品的处理”项下处理后分析测定。

应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计量资料以± s表示,组间比较采用t检验,以P < 0.05为差异有显著性。

肝脏组织样品色谱图中葛根素与内标物的保留时间分别约为8.2和14.3 min (图 1)。同法考察其他组织匀浆的专属性,结果显示葛根素与内标物的色谱峰均与相邻色谱峰分离良好,组织中内源性物质及代谢物不干扰葛根素和内标物的测定,方法专属性较好。

图 1(Figure 1)

Figure 1 HPLC Chromatograms of puerarin: blank liver tissue (a); blank liver tissue spiked with puerarin (8.2 min) and tectoridin (14.3 min) (b); liver tissue sample after administration of PEGylated puerarin (c)

葛根素质量浓度在0.04～4.0 μg·g^-1内,各组织的线性关系良好 (表 1),方法的定量下限为0.04 μg·g^-1,可以满足生物样品中葛根素的测定。

表 1(Table 1)

Table 1 Calibration curves of puerarin in biological samples Sample Standard curve r Heart Y = 6.18×10-3X + 5.49×10-3 0.995 6 Liver Y = 4.35×10-2X + 3.28×10-3 0.993 1 Spleen Y = 2.74×10-3X + 6.85×10-3 0.996 7 Lung Y = 4.54×10-3X + 7.16×10-3 0.992 8 Kidney Y = 8.98×10-3X + 7.65×10-3 0.996 3 Brain Y = 7.45×10-3X + 6.73×10-3 0.991 3

Table 1 Calibration curves of puerarin in biological samples

大鼠肝组织中葛根素3个浓度的QC样品的日内RSD分别为3.9%、9.8%、7.6%,日间RSD分别为6.8%、7.5%、8.9%; 准确度在87.9%～110.5% 之间,各样品的精密度和准确度良 好,符合方法学的测定要求,可以进行生物样品中葛根素的测定。

葛根素肝组织匀浆低、中、高3个浓度QC样品的提取回收率分别为 (82.1 ± 7.6) %、(87.7 ± 6.4) % 和 (88.5 ± 7.0) %; 同法考察内标的提取回收率为 (78.6 ± 6.1) %。结果表明,该提取方法回收率较好,可用于生物样品中葛根素的提取。

葛根素肝组织QC样品的测定浓度与理论浓度的RE在10% 内,表明大鼠肝组织样品在室温放置12 h、处理后4 ℃放置24 h、反复冻融3次以及于 -70 ℃环境中放置2周后 ,葛根素较为稳定,各种储存条件不影响样本浓度的准确测定。

给药后不同时间点大鼠组织中葛根素分布如图 2所示,主要分布于肝、心、肾等脏器,其中在肝组织中90 min后药物浓度基本上高于2.0 μg·g^-1,对于急性心肌缺血模型大鼠而言,PEG化葛根素更容易在心脏部位蓄积,给药120 min后药物浓度达到顶峰,之后呈快速消除的趋势,具有明显的心脏内停留的特性。采用DAS 2.0软件计算各组织主要药动学参 数,结果见表 2。从表中可见,PEG化葛根素在正常大鼠脏器中的AUC大小顺序为肝 > 肾 > 心 ≈ 脾 > 肺 > 脑,而在急性心肌缺血模型大鼠中的AUC大小顺序为肝 ≈ 心 > 肾 > 肺 ≈ 脾 > 脑,其中,在模型大鼠心脏中的AUC为正常大鼠心脏中的1.7倍,与正常大鼠比较存在显著性差异 (P < 0.05)。由此得出,PEG化葛根素在心肌梗死早期区域具有较好的选择靶向性,可以将药物蓄积于缺血心肌。

图 2(Figure 2)

Figure 2 Tissue distribution profiles of PEGylated puerarin in normal rats (a) and acute myocardial ischemia model rats (b) at a dose of 488 mg·kg-1. n = 5,± s

表 2(Table 2)

Table 2 Pharmacokinetic parameters of tissue distribution profiles of PEGylated puerarin in normal rats and acute myocardial ischemia model rats. P < 0.05 vs normal rats Tissue AUC0→∞/μg·g-1·min-1 Normal rat Acute myocardial ischemia model rat Heart 2.17 ± 0.42 3.69 ± 0.48 Liver 4.57 ± 0.75 3.81 ± 0.98 Spleen 1.89 ± 0.65 2.06 ± 0.45 Lung 1.67 ± 0.21 1.87 ± 0.57 Kidney 3.61 ± 0.72 3.01 ± 0.41 Brain 0.21 ± 0.04 0.18 ± 0.05

Table 2 Pharmacokinetic parameters of tissue distribution profiles of PEGylated puerarin in normal rats and acute myocardial ischemia model rats. P < 0.05 vs normal rats

PEG化葛根素进入体内后存在两种形式,葛根素原型和PEG化葛根素,其中后者可以起一个药物储库的作用,通过不断的降解聚氧乙烯大分子单体,缓慢释放药物,故进入体内后的PEG化葛根素与最初形式存在较大的区别,只能通过葛根素的检测间接反应PEG化葛根素大分子的降解过程,所以本文只考虑检测葛根素在体内组织中的药物浓度。

PEG已是FDA认可使用的极少数能作为体内注射药用的高分子聚合物,具有良好的生物相容性和安全性。前期研究结果证实,葛根素经PEG修饰后,

水溶解性增强约13倍,半衰期延长5.2倍,药效方面略有增强,红细胞溶血现象明显减少^[6]。本研究发现,PEG化葛根素对急性缺血心肌的靶向选择性明显增强,可以将药物蓄积于缺血心肌,与文献^[7,8]报道基本一致。Sun等^[7]采用荧光标记20 kDa和40 kDa的PEG高分子分别对心肌缺血模型小鼠和正常小鼠注射给药,结果发现两者在心肌缺血模型小鼠心脏中的分布分别为正常小鼠的1.47和1.92倍。Lin等^[8]研究了PEG20K化麦冬多糖的体内组织分布,结果发现,PEG20K化麦冬多糖在心肌缺血模型小鼠的脏器分布AUC大小顺序为心 ≈ 肺 ≈ 肾 > 肝 > 脑,在正常小鼠的脏器分布AUC大小顺序为肾 > 肺 > 心 > 肝 > 脑; 且PEG20K化麦冬多糖在模型小鼠上的心脏分布AUC为正常小鼠的1.6倍。

现代研究发现缺血所致的心血管具有以下病理特征^[9]: ① 心肌缺血时会引起脂肪酸β氧化受阻,游离脂肪酸、脂酰辅酶A及脂酰肉毒碱等迅速增加,导致血管内膜通透性异常升高; ② 缺血缺氧会导致血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF) 及其受体的表达成倍增加,使毛细血管内皮细胞膜的通透性也增加; ③ 由于缺血时内皮细胞的胞质和线粒体内均出现Ca²⁺ 过载,膜磷脂酶在Ca²⁺ 介导下被激活,引起膜磷脂被降解而导致血管内皮细胞膜功能出现紊乱; ④ 缺血区血流量较慢,使得药物在缺血区的滞留时间延长。故PEG高分子在缺血心肌部位具有较好的透过增强与滞留(enhanced permeability and retention,EPR) 效应; 而正常组织血管壁细胞排列紧密,且结构完整,PEG高分子载药系统在血液循环过程中几乎不会渗出,故PEG可以将大部分药物蓄积于梗死早期心肌细胞,实现心血管药物的被动靶向^[10]。所以,PEG化葛根素在急性缺血心肌大鼠模型上能够提高药物的选择性,可有效地靶向病变部位的心肌组织,释放药 物,发挥疗效,为研制心血管药物的靶向性制剂进行了有益探索。