酒石酸美托洛尔属于第2代β受体阻断药,具有减慢房室传导,减慢窦性心率的作用。临床广泛用于高血压、心绞痛、心肌梗死、肥厚性心肌病等疾病的治疗[1-2]。有研究表明,不同光学活性的美托洛尔对β1和β2受体的亲和力存在差异。(-)-美托洛尔与β1受体的亲和力是(+)-美托洛尔的500倍,而(+)-美托洛尔对β2受体的亲和力是(-)-美托洛尔的10倍[3]。因此,美托洛尔2个对映体的药理活性差异很大。(-)-美托洛尔对心脏的抑制效应是(+)-美托洛尔的30多倍且人体对2种对映体的氧化代谢速率不同,(+)-美托洛尔甚至还有副作用[4]。虽然目前市场上销售的美托洛尔类药物制剂几乎都是消旋体,建立美托洛尔对映体的分离分析方法对其单一对映体的相关研究仍具有重要意义。
目前,美托洛尔手性分离方法主要有手性衍生化法[5]、离子对色谱法[6]、高效液相色谱法(HPLC法)[7]和毛细管电泳法(CE法)[8]等。非水毛细管电泳(NACE)是以有机溶剂为缓冲溶剂的CE体系,是CE的重要分支之一。NACE具有很多优于水相电泳的特点,已经成功用于手性药物对映体的拆分[9]。NACE中常用的手性选择剂有以下几种:环糊精(CD)、手性冠醚、线性多糖、大环糖肽类抗生素、蛋白质、手性表面活性剂等。近几年出现的多羟基化合物—硼酸络合酸类手性选择剂,廉价易得,在HPLC以及NACE中的应用还比较有限[10-11]。本文以D-葡萄糖酸-硼酸络合酸作为手性选择剂对酒石酸美托洛尔对映体进行手性分离。通过测定线性与范围、定量下限、检测下限、精密度、稳定性等进行方法学研究,确定其是否可能用于酒石酸美托洛尔片剂中对映体的含量测定。
1 仪器与试药TriSep-2100型加压毛细管电泳仪及紫外检测器(上海通微分析技术有限公司),所有数据采集和分析均在CXTH-3000CXTH色谱工作站上完成。弹性石英毛细管(河北永年锐沣色谱器件有限公司)。KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
50% D-葡萄糖酸溶液(阿拉丁,分析纯,上海晶纯生化科技股份有限公司),硼酸(分析纯,天津北方天医化学试剂厂),三乙胺(分析纯,天津市光复精细化工研究所),甲醇(色谱纯,北京百灵威科技有限公司)。外消旋酒石酸美托洛尔对照品(批号100084-201403,纯度为99.9%)购自中国食品药品检定研究院。酒石酸美托洛尔片(50 mg·片-1,批号分别为1608074、1608075、0911027)由阿斯利康制药有限公司生产;酒石酸美托洛尔片(25 mg·片-1,批号分别为1610169、1608A36、1512A04)由阿斯利康药业(中国)有限公司生产。
2 方法与结果 2.1 溶液的配制 2.1.1 缓冲液精密称取D-葡萄糖酸(50%)溶液0.016 g和硼酸0.074 g,置于10 mL量瓶中,用少量色谱甲醇溶解后,加入三乙胺60 μL,以甲醇定容。
2.1.2 供试溶液取酒石酸美托洛尔对照品约4.0 mg,精密称定,以甲醇配制成消旋体为1.0 mg·mL-1的储备液。进样前需稀释为系列浓度,即500.0、250.0、100.0、50.0、25.0和15.0 μg·mL-1。2个对映体的浓度按照其外消旋体的1/2计算,分别为250.0、125.0、50.0、25.0、12.5和7.5 μg·mL-1。
取酒石酸美托洛尔片10片,研细。取细粉约25 mg或50 mg(相当于1片的量),精密称定,以甲醇充分溶解,4 000 r·min-1离心10 min,取上清液,以甲醇配制成消旋体质量浓度为1.0 mg·mL-1的储备液,进样前稀释成250.0 μg·mL-1。
取自制的片剂辅料适量,以甲醇中充分溶解,离心后取上清液,配制成250 μg·mL-1的空白辅料溶液。
所有溶液上样前用微孔滤膜(0.22 μm,有机系)过滤,并超声脱气5 min。
2.2 电泳条件未涂层熔融弹性石英毛细管(55.0 cm×50 μm,有效长度45.0 cm)。新毛细管在使用前依次用甲醇冲洗5 min,超纯水冲洗5 min,1.0 mol·mL-1氢氧化钠溶液冲洗20 min,超纯水冲洗5 min至中性,1.0 mol·L-1盐酸冲洗20 min,超纯水冲洗5 min至中性,最后用甲醇冲洗5 min。背景缓冲液为8 mmol·L-1D-葡萄糖酸溶液、120 mmol·L-1硼酸、43.2 mmol·L-1三乙胺甲醇溶液。运行电压为20 kV。10 cm,重力进样5 s。在该电泳条件下,酒石酸美托洛尔对照品和酒石酸美托洛尔片剂中2个对映体的分离度能达到2.0以上,理论塔板数均大于5 000,片剂中辅料不干扰分离。如图 1所示。
取酒石酸美托洛尔对照品系列溶液,在“2.2”项条件下进样,测得酒石酸美托洛尔对映体1和对映体2的峰面积。以峰面积Y为纵坐标,酒石酸美托洛尔对映体质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标,绘制标准曲线。经计算得到对映体1、对映体2的线性回归方程:
Y=325.46X-712.48 r=0.999 3
Y=311.87X-315.84 r=0.999 2
表明酒石酸美托洛尔对映体1与对映体2质量浓度在7.5~250.0 μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.3.2 检测下限和定量下限分别按信噪比为3倍(S/N=3)和10倍(S/N=10)确定检测下限和定量下限。因对映体1与对映体2的信噪比差异较大,所以分别测定。最终测得对映体1的检测下限为2.5 μg·mL-1,定量下限为7.5 μg·mL-1;对映体2的检测下限为7.5 μg·mL-1,定量下限为25.0 μg·mL-1。
2.3.3 精密度试验取250.0 μg·mL-1的酒石酸美托洛尔对照品甲醇溶液,同一日内连续进样6次,测定日内精密度。对映体1和对映体2峰面积的RSD均为0.90%;迁移时间的RSD分别为0.70%和0.90%;分离度的RSD为1.3%。
取250.0 μg·mL-1的酒石酸美托洛尔对照品甲醇溶液,连续进样7 d,每天进样2次,测定日间精密度。对映体1和对映体2峰面积的RSD均为2.6%;迁移时间的RSD分别为1.8%和1.9%;分离度的RSD为3.8%。
说明该方法精密度良好。
2.3.4 稳定性试验取250.0 μg·mL-1的酒石酸美托洛尔对照品溶液,放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后分别进样,记录对映体1与对映体2的峰面积。对映体1和对映体2峰面积的RSD分别为4.3%和3.7%。说明该溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.5 加样回收率试验取酒石酸美托洛尔片剂适量共9份,分为3组,每组3份,分别加入高、中、低3个加入水平的对照品,制成相应浓度的溶液,在“2.2”项条件下分别进样,记录色谱图和峰面积,按外标法用峰面积计算加样回收率。结果如表 1所示。
将6个批次的酒石酸美托洛尔片分别制成250.0 μg·mL-1的供试溶液,在“2.2”项条件下分别进样3次,记录色谱图和峰面积。按标示量百分含量=
由于D-葡萄糖酸-硼酸络合酸在甲醇溶液中的原位合成反应是可逆的,因此,D-葡萄糖酸和硼酸的浓度是影响手性拆分的重要因素。本实验分别在0~20 mmol·L-1和0~200 mmol·L-1范围内,考察了D-葡萄糖酸浓度和硼酸浓度对手性拆分的影响。如图 2-A所示,保持其他因素不变,随着D-葡萄糖酸浓度的增加,手性分析物的分离度先增大后减小,当D-葡萄糖酸浓度为8 mmol·L-1时,酒石酸美托洛尔分离度达到2.87,迁移时间在10 min左右,有较高的分离效率。因此,选定D-葡萄糖酸为8 mmol·L-1。如图 2-B所示保持其他因素不变,在0~200 mmol·L-1内,随着硼酸浓度的增加,酒石酸美托洛尔的分离度逐渐增大,当浓度为120 mmol·L-1时,分离度达到最大。继续增大硼酸浓度,分离度呈下降趋势。这可能是过高浓度的硼酸使得缓冲液离子强度增加,从而引起EOF变化,药物峰形展宽,影响分离效果。因此,实验选择120 mmol·L-1为最佳硼酸浓度。
NACE中缓冲液的酸度一般用表观pH表示,是影响手性分离的另一重要参数。不同浓度的三乙胺影响缓冲液的表观pH,影响手性选择剂和样品的带电荷量,进而影响电渗流的大小、方向和分离效果[12]。在D-葡萄糖酸和硼酸浓度不变的条件下,改变三乙胺的浓度,观察酒石酸美托洛尔迁移时间和分离度的变化,如图 3所示。缓冲溶液中未加入三乙胺时,分析物的迁移时间较短,没有分离趋势。实验在0~50.4 mmol·L-1范围内考察了三乙胺浓度对手性分离的影响。当三乙胺浓度为21.6 mmol·L-1时,缓冲液对酒石酸美托洛尔对照品有分离趋势;随着三乙胺浓度的增大,EOF强度变弱,酒石酸美托洛尔迁移时间逐渐延长,分离度增大。迁移时间过长使得样品扩散,理论塔板数降低,从而影响柱效。综合迁移时间、分离度、理论塔板数等因素,实验选择43.2 mmol·L-1为三乙胺最佳浓度。
在最优缓冲条件下,实验考察了运行电压(15~25 kV)对分离度的影响。高电压会提高分离效率,EOF增强,缩短迁移时间,峰形更加尖锐。但高电压会产生更多的焦耳热,使峰形展宽,重现性下降。低电压使得迁移时间延长,有利于分离,但分离效率下降。综合考虑,选择20 kV为运行电压。
3.3 小结本实验以D-葡萄糖酸-硼酸络合酸为手性选择剂,在优化过的NACE手性分离条件下,建立了酒石酸美托洛尔片剂中对映体的含量测定方法。结果表明,该方法简单、快速,分离效果好,结果准确可靠,可用于酒石酸美托洛尔片剂中对映体含量的测定。
[1] |
HJALMARSON A, GOLDSTEIN S, FAGERBERG B, et al. Effect of metoprolol CR/XL in chronic heart failure:metoprolol CR/XL randomised intervention trial in congestive heart failure (MERIT-HF)[J]. Lancet, 1999, 353(9169): 2001. DOI:10.1016/S0140-6736(99)04440-2 |
[2] |
车艳, 沈春健. 酒石酸美托洛尔对心脏瓣膜病伴心力衰竭患者的影响研究[J]. 中国医学创新, 2017, 14(2): 5. CHE Y, SHEN CJ. Impact study of tartaric acid metoprolol in patients with valvular heart disease and heart failure[J]. Med Innov China, 2017, 14(2): 5. DOI:10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.002 |
[3] |
狄潘潘, 徐自奥, 李家明, 等. 美托洛尔及其手性对映体的合成工艺研究最新进展[J]. 安徽化工, 2015, 41(1): 12. DI PP, XU ZA, LI JM, et al. Recent progress of the metoprolol and chiral enantiomers synthesis[J]. Anhui Chem Ind, 2015, 41(1): 12. DOI:10.3969/j.issn.1008-553X.2015.01.07 |
[4] |
DASBISWAS A, SHINDE S, DASBISWAS D. S-metoprolol:the 2008 clinical review[J]. J Ind Med Assoc, 2008, 106(4): 259. |
[5] |
程彪平, 李来生, 周仁丹, 等. β-环糊精类手性液相色谱固定相拆分和测定药片中美托洛尔对映体[J]. 分析试验室, 2014, 33(10): 1151. CHENG BP, LI LS, ZHOU RD, et al. Separation and determination of metoprolol enantiomers in tablets by β-cyclodextrin chiral liquid chromatography stationary phase[J]. Chin J Anal Lab, 2014, 33(10): 1151. |
[6] |
徐秀珠, 邹莉, 胡明华, 等. 离子对色谱法分离氨基醇类对映体[J]. 分析化学, 2001, 29(11): 1295. XU XZ, ZOU L, HU MH, et al. Separation of alcohol enantiomers by ion-pair chromatography[J]. Chin J Anal Chem, 2001, 29(11): 1295. DOI:10.3321/j.issn:0253-3820.2001.11.014 |
[7] |
杨娟, 王利娟, 郭巧玲, 等. 以L-酒石酸正己酯-硼酸配合物作为反相液相色谱手性流动相添加剂拆分5种β-受体阻滞剂[J]. 色谱, 2012, 30(3): 28. YANG J, WANG LJ, GUO QL, et al. Chiral separation of five β-blockers using di-n-hexyl L-tartrate-boric acid complex as mobile phase additive by reversed-phase liquid chromatography[J]. Chin J Chromatogr, 2012, 30(3): 28. |
[8] |
ZOU YN, WANG LJ, LIU Q, et al. Enantioseparations of 11 amino alcohols using di-n-amyl L-tartrate-boric acid complex as chiral mobile phase additive by RP-HPLC[J]. Chromatographia, 2015, 78(11-12): 753. DOI:10.1007/s10337-015-2891-1 |
[9] |
HOU JY, LI G, WEI YQ, et al. Analysis of five alkaloids using surfactant-coated multi-walled carbon nanotubes as the pseudostationary phase in nonaqueous capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A, 2014, 1343(5): 174. |
[10] |
LV LL, WANG LJ, ZOU YN, et al. Chiral separation by nonaqueous capillary electrophoresis using L-sorbose-boric acid complexes as chiral ion-pair selectors[J]. RSC Adv, 2016, 6(106): 104193. DOI:10.1039/C6RA21806G |
[11] |
AN N, WANG LJ, ZHAO JJ, et al. Enantioseparation of fourteen amino alcohols by nonaqueous capillary electrophoresis using lactobionic acid D-(+)-xylose-boric acid complexes as chiral selectors[J]. Anal Methods, 2016, 8(5): 1127. DOI:10.1039/C5AY02686E |
[12] |
GOMG ZS, DUAN LP, TANG AN. Amino-functionalized silica nanoparticles for improved enantiomeric separation in capillary electrophoresis using carboxymethyl-β-cyclodextrin (CM-β-CD)as a chiral selector[J]. Microchim Acta, 2015, 182(7-8): 1297. DOI:10.1007/s00604-015-1449-0 |