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  药物分析杂志   2019, Vol. 39 Issue (1): 127-132.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.01.16
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焦亚军, 李君, 侯序, 张帆, 王利娟, 郭怀忠. 手性NACE法测定酒石酸美托洛尔片剂中对映体的含量[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(1): 127-132. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.01.16.
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JIAO Ya-jun, LI Jun, HOU Xu, ZHANG Fan, WANG Li-juan, GUO Huai-zhong. Determination of enantiomers of metoprolol tartrate in tablets by chiral NACE[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(1): 127-132. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.01.16.
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基金项目

国家自然科学基金资助项目(21405031);河北省自然科学基金资助项目(B2015201160);河北大学自然科学基金资助项目(2014-06,2014-07);河北大学实验室开放项目(sy201667);河北大学研究生创新资助项目(x201734)

第一作者

焦亚军, Tel:18731210056;E-mail:june20156@163.com

通信作者

王利娟, Tel:(0312)5971107;E-mail:wanglijuan@hbu.edu.cn

文章历史

收稿日期:2017-11-27
手性NACE法测定酒石酸美托洛尔片剂中对映体的含量
焦亚军 , 李君 , 侯序 , 张帆 , 王利娟 , 郭怀忠     
河北省药物质量分析控制重点实验室, 河北大学药学院, 保定 071002
摘要目的:建立手性非水毛细管电泳法(NACE法)测定酒石酸美托洛尔片剂中对映体的含量。方法:D-葡萄糖酸-硼酸络合酸为手性选择剂,在优化过的NACE手性分离条件下展开相关研究。优化的NACE手性分离条件:未涂层熔融石英毛细管(55.0 cm×50 μm,有效长度为45.0 cm);背景缓冲液为含8 mmol·L-1 D-葡萄糖酸、120 mmol·L-1硼酸、43.2 mmol·L-1三乙胺的甲醇溶液;10 cm,5 s重力进样;运行电压20 kV;检测波长224 nm;柱温为室温。结果:酒石酸美托洛尔的2个对映体质量浓度在7.5~250.0 μg·mL-1范围内,与峰面积呈现良好的线性关系;对映体1的定量下限和检测下限分别为7.5 μg·mL-1和2.5 μg·mL-1;对映体2的定量下限和检测下限分别为25.0 μg·mL-1和7.5 μg·mL-1;对映体1和对映体2的加样回收率分别为99.7%、98.0%、97.2%和97.7%、98.0%、98.0%,均在95.0%~105.0%范围内。6个批次的酒石酸美托洛尔片剂中对映体1和对映体2的标示量百分含量均在96.6%~102.5%之间。结论:该方法经验证可用于酒石酸美托洛尔片剂中对映体含量的测定。
关键词D-葡萄糖酸-硼酸络合酸    酒石酸美托洛尔片剂    手性对映体    含量测定    非水毛细管电泳    
Determination of enantiomers of metoprolol tartrate in tablets by chiral NACE
JIAO Ya-jun, LI Jun, HOU Xu, ZHANG Fan, WANG Li-juan, GUO Huai-zhong    
Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control of Hebei Province, College of Pharmaceutical Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China
Abstract: Objective: To establish a method for the determination of enantiomers of metoprolol tartrate in tablets by nonaqueous capillary electrophoresis (NACE).Methods: D-Gluconic acid-boric acid complex was used as the chiral selector.The experiments were carried out under the optimized chiral NACE conditions.The optimized conditions were as follows:Enantiomeric sepraration was performed in an unmodified fused silica capillary of 50.0 μm with 55.0 cm of total length and 45.0 cm of effective length; the running buffer solution was a mixture of 8 mmol·L-1 D-gluconic acid, 120 mmol·L-1 boric acid and 43.2 mmol·L-1 triethylamine in methanol; injection were performed hydrostatically for 5 s at a 10 cm height difference; the applied voltage was 20 kV; the detection wavelength was 224 nm; the experiments were performed at room temperature.Results: Good linearity for the two enantiomers of metoprolol tartrate were obtained in the range of 7.5-250.0 μg·mL-1.The limit of quantification (LOQ)and the limit of detection (LOD)for enantiomer 1 were 7.5 μg·mL-1 and 2.5 μg·mL-1, respectively, and for enantiomer 2, 25.0 μg·mL-1 and 7.5 μg·mL-1, respectively. The recoveries for each enantiomer were 99.7%, 98.0%, 97.2% and 97.7%, 98.0%, 98.0%, respectively, with all in the range of 95.0%-105.0%.The contents of enantiomer 1 and enantiomer 2 in six batches of metoprolol tartrate tablets were all in the ranges of 96.6%-102.5%.Conclusion: The method validated by methodology is suitable for the determination of enantiomer contents in metoprolol tartrate tablets.
Key words: D-gluconic-boric acid complex acid    metoprolol tartrate tablets    chiral enantiomers    content determination    nonaqueous capillary electrophoresis    

酒石酸美托洛尔属于第2代β受体阻断药,具有减慢房室传导,减慢窦性心率的作用。临床广泛用于高血压、心绞痛、心肌梗死、肥厚性心肌病等疾病的治疗[1-2]。有研究表明,不同光学活性的美托洛尔对β1和β2受体的亲和力存在差异。(-)-美托洛尔与β1受体的亲和力是(+)-美托洛尔的500倍,而(+)-美托洛尔对β2受体的亲和力是(-)-美托洛尔的10倍[3]。因此,美托洛尔2个对映体的药理活性差异很大。(-)-美托洛尔对心脏的抑制效应是(+)-美托洛尔的30多倍且人体对2种对映体的氧化代谢速率不同,(+)-美托洛尔甚至还有副作用[4]。虽然目前市场上销售的美托洛尔类药物制剂几乎都是消旋体,建立美托洛尔对映体的分离分析方法对其单一对映体的相关研究仍具有重要意义。

目前,美托洛尔手性分离方法主要有手性衍生化法[5]、离子对色谱法[6]、高效液相色谱法(HPLC法)[7]和毛细管电泳法(CE法)[8]等。非水毛细管电泳(NACE)是以有机溶剂为缓冲溶剂的CE体系,是CE的重要分支之一。NACE具有很多优于水相电泳的特点,已经成功用于手性药物对映体的拆分[9]。NACE中常用的手性选择剂有以下几种:环糊精(CD)、手性冠醚、线性多糖、大环糖肽类抗生素、蛋白质、手性表面活性剂等。近几年出现的多羟基化合物—硼酸络合酸类手性选择剂,廉价易得,在HPLC以及NACE中的应用还比较有限[10-11]。本文以D-葡萄糖酸-硼酸络合酸作为手性选择剂对酒石酸美托洛尔对映体进行手性分离。通过测定线性与范围、定量下限、检测下限、精密度、稳定性等进行方法学研究,确定其是否可能用于酒石酸美托洛尔片剂中对映体的含量测定。

1 仪器与试药

TriSep-2100型加压毛细管电泳仪及紫外检测器(上海通微分析技术有限公司),所有数据采集和分析均在CXTH-3000CXTH色谱工作站上完成。弹性石英毛细管(河北永年锐沣色谱器件有限公司)。KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

50% D-葡萄糖酸溶液(阿拉丁,分析纯,上海晶纯生化科技股份有限公司),硼酸(分析纯,天津北方天医化学试剂厂),三乙胺(分析纯,天津市光复精细化工研究所),甲醇(色谱纯,北京百灵威科技有限公司)。外消旋酒石酸美托洛尔对照品(批号100084-201403,纯度为99.9%)购自中国食品药品检定研究院。酒石酸美托洛尔片(50 mg·片-1,批号分别为1608074、1608075、0911027)由阿斯利康制药有限公司生产;酒石酸美托洛尔片(25 mg·片-1,批号分别为1610169、1608A36、1512A04)由阿斯利康药业(中国)有限公司生产。

2 方法与结果 2.1 溶液的配制 2.1.1 缓冲液

精密称取D-葡萄糖酸(50%)溶液0.016 g和硼酸0.074 g,置于10 mL量瓶中,用少量色谱甲醇溶解后,加入三乙胺60 μL,以甲醇定容。

2.1.2 供试溶液

取酒石酸美托洛尔对照品约4.0 mg,精密称定,以甲醇配制成消旋体为1.0 mg·mL-1的储备液。进样前需稀释为系列浓度,即500.0、250.0、100.0、50.0、25.0和15.0 μg·mL-1。2个对映体的浓度按照其外消旋体的1/2计算,分别为250.0、125.0、50.0、25.0、12.5和7.5 μg·mL-1

取酒石酸美托洛尔片10片,研细。取细粉约25 mg或50 mg(相当于1片的量),精密称定,以甲醇充分溶解,4 000 r·min-1离心10 min,取上清液,以甲醇配制成消旋体质量浓度为1.0 mg·mL-1的储备液,进样前稀释成250.0 μg·mL-1

取自制的片剂辅料适量,以甲醇中充分溶解,离心后取上清液,配制成250 μg·mL-1的空白辅料溶液。

所有溶液上样前用微孔滤膜(0.22 μm,有机系)过滤,并超声脱气5 min。

2.2 电泳条件

未涂层熔融弹性石英毛细管(55.0 cm×50 μm,有效长度45.0 cm)。新毛细管在使用前依次用甲醇冲洗5 min,超纯水冲洗5 min,1.0 mol·mL-1氢氧化钠溶液冲洗20 min,超纯水冲洗5 min至中性,1.0 mol·L-1盐酸冲洗20 min,超纯水冲洗5 min至中性,最后用甲醇冲洗5 min。背景缓冲液为8 mmol·L-1D-葡萄糖酸溶液、120 mmol·L-1硼酸、43.2 mmol·L-1三乙胺甲醇溶液。运行电压为20 kV。10 cm,重力进样5 s。在该电泳条件下,酒石酸美托洛尔对照品和酒石酸美托洛尔片剂中2个对映体的分离度能达到2.0以上,理论塔板数均大于5 000,片剂中辅料不干扰分离。如图 1所示。

图 1 酒石酸美托洛尔对照品(A)和酒石酸美托洛尔片剂(B)中对映体以及片剂中辅料(C)的NACE分离图 Figure 1 The electropherograms of enantiomers of metoprolol tartrate in their reference sample(A)and tablets(B), and the excipients of tablets(C)under NACE conditions
2.3 方法学研究 2.3.1 线性与范围

取酒石酸美托洛尔对照品系列溶液,在“2.2”项条件下进样,测得酒石酸美托洛尔对映体1和对映体2的峰面积。以峰面积Y为纵坐标,酒石酸美托洛尔对映体质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标,绘制标准曲线。经计算得到对映体1、对映体2的线性回归方程:

Y=325.46X-712.48 r=0.999 3

Y=311.87X-315.84 r=0.999 2

表明酒石酸美托洛尔对映体1与对映体2质量浓度在7.5~250.0 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.2 检测下限和定量下限

分别按信噪比为3倍(S/N=3)和10倍(S/N=10)确定检测下限和定量下限。因对映体1与对映体2的信噪比差异较大,所以分别测定。最终测得对映体1的检测下限为2.5 μg·mL-1,定量下限为7.5 μg·mL-1;对映体2的检测下限为7.5 μg·mL-1,定量下限为25.0 μg·mL-1

2.3.3 精密度试验

取250.0 μg·mL-1的酒石酸美托洛尔对照品甲醇溶液,同一日内连续进样6次,测定日内精密度。对映体1和对映体2峰面积的RSD均为0.90%;迁移时间的RSD分别为0.70%和0.90%;分离度的RSD为1.3%。

取250.0 μg·mL-1的酒石酸美托洛尔对照品甲醇溶液,连续进样7 d,每天进样2次,测定日间精密度。对映体1和对映体2峰面积的RSD均为2.6%;迁移时间的RSD分别为1.8%和1.9%;分离度的RSD为3.8%。

说明该方法精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

取250.0 μg·mL-1的酒石酸美托洛尔对照品溶液,放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后分别进样,记录对映体1与对映体2的峰面积。对映体1和对映体2峰面积的RSD分别为4.3%和3.7%。说明该溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验

取酒石酸美托洛尔片剂适量共9份,分为3组,每组3份,分别加入高、中、低3个加入水平的对照品,制成相应浓度的溶液,在“2.2”项条件下分别进样,记录色谱图和峰面积,按外标法用峰面积计算加样回收率。结果如表 1所示。

表 1 片剂中酒石酸美托洛尔2个对映体的回收率(n=3) Table 1 Recoveries of two enantiomers of metoprolol tartrate in tablets
2.4 实际样品测定

将6个批次的酒石酸美托洛尔片分别制成250.0 μg·mL-1的供试溶液,在“2.2”项条件下分别进样3次,记录色谱图和峰面积。按标示量百分含量=$\frac{对映体测得量}{片剂标示量的{}^{1}\diagup{}_{2}\;}\times 100 \% $计算对映体标示量百分含量,结果见表 2

表 2 酒石酸美托洛尔片剂中2个对映体的含量 Table 2 The contents of two enantiomers of metoprolol tartrate in tablets
3 讨论 3.1 缓冲液各组分浓度的选择 3.1.1 D-葡萄糖酸-硼酸络合酸浓度的选择

由于D-葡萄糖酸-硼酸络合酸在甲醇溶液中的原位合成反应是可逆的,因此,D-葡萄糖酸和硼酸的浓度是影响手性拆分的重要因素。本实验分别在0~20 mmol·L-1和0~200 mmol·L-1范围内,考察了D-葡萄糖酸浓度和硼酸浓度对手性拆分的影响。如图 2-A所示,保持其他因素不变,随着D-葡萄糖酸浓度的增加,手性分析物的分离度先增大后减小,当D-葡萄糖酸浓度为8 mmol·L-1时,酒石酸美托洛尔分离度达到2.87,迁移时间在10 min左右,有较高的分离效率。因此,选定D-葡萄糖酸为8 mmol·L-1。如图 2-B所示保持其他因素不变,在0~200 mmol·L-1内,随着硼酸浓度的增加,酒石酸美托洛尔的分离度逐渐增大,当浓度为120 mmol·L-1时,分离度达到最大。继续增大硼酸浓度,分离度呈下降趋势。这可能是过高浓度的硼酸使得缓冲液离子强度增加,从而引起EOF变化,药物峰形展宽,影响分离效果。因此,实验选择120 mmol·L-1为最佳硼酸浓度。

A.除D-葡萄糖酸外,缓冲液为含120 mmol·L-1硼酸和43.2 mmol·L-1三乙胺的甲醇溶液(the buffer component is 120 mmol·L-1 boric acid and 43.2 mmol·L-1 triethylamine in methanol with different concentrations of D-gluconic acid)
B.除硼酸外,缓冲液为含8 mmol·L-1 D-葡萄糖酸和43.2 mmol·L-1三乙胺的甲醇溶液(the buffer component is 8 mmol·L-1 D-gluconic acid and 43.2 mmol·L-1 triethylamine in methanol with different concentrations of boric acid)
图 2 D-葡萄糖酸和硼酸浓度对酒石酸美托洛尔分离度的影响 Figure 2 Effects of concentrations of D-gluconic acid(A)and boric acid(B)on the resolution between the peaks of two enantiomers of metoprolol tartrate
3.1.2 三乙胺浓度的选择

NACE中缓冲液的酸度一般用表观pH表示,是影响手性分离的另一重要参数。不同浓度的三乙胺影响缓冲液的表观pH,影响手性选择剂和样品的带电荷量,进而影响电渗流的大小、方向和分离效果[12]。在D-葡萄糖酸和硼酸浓度不变的条件下,改变三乙胺的浓度,观察酒石酸美托洛尔迁移时间和分离度的变化,如图 3所示。缓冲溶液中未加入三乙胺时,分析物的迁移时间较短,没有分离趋势。实验在0~50.4 mmol·L-1范围内考察了三乙胺浓度对手性分离的影响。当三乙胺浓度为21.6 mmol·L-1时,缓冲液对酒石酸美托洛尔对照品有分离趋势;随着三乙胺浓度的增大,EOF强度变弱,酒石酸美托洛尔迁移时间逐渐延长,分离度增大。迁移时间过长使得样品扩散,理论塔板数降低,从而影响柱效。综合迁移时间、分离度、理论塔板数等因素,实验选择43.2 mmol·L-1为三乙胺最佳浓度。

除三乙胺外,缓冲液为含8 mmol·L-1 D-葡萄糖酸和120 mmol·L-1硼酸的甲醇溶液(the buffer component is 8 mmol·L-1 D-gluconic acid and 120 mmol·L-1 boric acid in methanol with different concentrations of triethylamine) 图 3 三乙胺浓度对酒石酸美托洛尔分离度的影响 Figure 3 Effect of triethylamine concentration on the resolution between the peaks of two enantiomers of metoprolol tartrate
3.2 运行电压的选择

在最优缓冲条件下,实验考察了运行电压(15~25 kV)对分离度的影响。高电压会提高分离效率,EOF增强,缩短迁移时间,峰形更加尖锐。但高电压会产生更多的焦耳热,使峰形展宽,重现性下降。低电压使得迁移时间延长,有利于分离,但分离效率下降。综合考虑,选择20 kV为运行电压。

3.3 小结

本实验以D-葡萄糖酸-硼酸络合酸为手性选择剂,在优化过的NACE手性分离条件下,建立了酒石酸美托洛尔片剂中对映体的含量测定方法。结果表明,该方法简单、快速,分离效果好,结果准确可靠,可用于酒石酸美托洛尔片剂中对映体含量的测定。

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