2019, Vol. 39 
双特异性抗体（bispecific antibody，bsAb）为可以同时特异性结合2个抗原或抗原表位的单一抗体分子，通过该作用特点，达到同时阻断2个抗原/表位介导的生物功能或将表达2种抗原的细胞拉近而增强两者间相互作用的目的。bsAb的概念出现在20世纪80年代，Morrison等首先通过将不同特异性的单链抗体使用柔性肽段连接后融合表达的方式制备了第1种真正意义上的抗葡聚糖和丹磺酰基的四价bsAb[1]。由于技术瓶颈和临床需求不足的限制，bsAb的发展一直受到阻碍。随着对疾病发病机制的深入了解，临床上产生了对bsAb的需求，同时治疗性单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）的飞速发展大大提高了抗体的构建、表达和纯化技术，使bsAb发展具备了克服限制因素的技术和动力。目前bsAb已经发展出近70种结构，包括Triomab、BiTE、Crossmab、Double Variable Domain（DVD）等，此外还包括多种确保形成正确bsAb结构的技术。根据不同治疗机制和临床需求，bsAb采用相应的结构，因此也可以说多样性的需求催生了多样性的bsAb结构。截至2016年，据不完全统计，已有30余个bsAb进入临床试验，适应症主要为肿瘤和自身免疫性疾病。目前已批准上市的bsAb包括Catumaxomab和Blinatumomab，前者采用Triomab结构用于治疗上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion moleculer，EpCAM）阳性上皮源性转移肿瘤所导致的恶性腹水，后者采用BiTE结构用于治疗急性淋巴细胞白血病。本文将就bsAb的结构、功能和应用方面进行介绍。
1 bsAb结构为实现能够同时特异性结合2个不同抗原表位的能力，多数bsAb通过结构设计包含了2个不同的抗原结合部位（可变区）。当前有近70种bsAb结构（图 1），多数通过改造IgG获得，少数通过化学偶联或与其他蛋白融合表达获得[2-5]。根据结构特点，bsAb大致可以分为5类（图 1），包括IgG样bsAb、含附加可变区的IgG样bsAb、串联不同抗原结合片段的bsAb、融合蛋白型bsAb、化学偶联bsAb。多数bsAb为双价和四价，少数可达六至八价，下面将就几种典型的bsAb结构予以介绍。
1.1 IgG样bsAb
采用重组DNA技术可以通过结构改造构建bsAb。通过结构改造构建的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）样bsAb具有完整的可结晶片段（Fc片段）[crystallizable fragment（Fc fragment）]，因此该类bsAb在结合不同抗原的同时，仍保留了Fc片段所介导的抗体介导的细胞毒性效应（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、补体介导的细胞毒性效应（complement-dependent cytotoxicity，CDC）等功能，同时该类IgG也保留了通过与新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor，FcRn）结合延长抗体体内半衰期的特点[6]。但该类bsAb制备中面临着确保重链-重链和重链-轻链正确配对的问题，通过Triomab[7]、Knob-in-hole（KiH）[8]、离子桥[9]、SEED[10]等技术可提高重-重链正确配对比例，采用二硫键[11]、离子桥[8, 12]、Crossmab[13]等技术可提高重-轻链正确配对的比例。
1.1.1 重链-重链的正确配对由于重链在与抗原结合过程中发挥着重要作用，不同重链间正确配对是构建bsAb的前提。采用四杂交瘤（Quadroma）技术，融合2种杂交瘤细胞可制备IgG样的bsAb[14]。由于四杂交瘤细胞中不同重链和轻链间为随机配对，目的bsAb在总抗体中仅占10%~20%，且由于目的bsAb同副产物之间理化性质非常相似，使该类抗体难于纯化。为提高bsAb正确组装的效率，Staerz等利用小鼠IgG2a与大鼠IgG2b分子Fc片段间易于形成异源二聚体的特点，通过将分泌IgG2a亚类抗白细胞分化抗原3（cluster of differentiation 3，CD3）的小鼠杂交瘤细胞与分泌IgG2b亚类抗胸腺细胞分化抗原1.1（thymocyte differentiation antigen 1.1，Thy-1.1）大鼠瘤细胞进行二次融合，构建了改良的四杂交瘤细胞，使目的bsAb的比例大大提高[15]。采用该技术制备的bsAb除可以通过不同的抗原结合片段（antigen binding fragment，Fab）分别结合2种不同抗原外，还可通过其Fc片段与位于多种免疫细胞表面的Fc受体结合，介导免疫细胞对靶细胞的杀伤[16]，因此认为该种bsAb具有3个结合位点，故又将该结构的bsAb称为Triomab。利用该技术，Trion Pharma和Fresenius Biotech研发了EpCAM+CD3（Catumaxomab）、HER2+CD3（Ertumaxomab）、CD20+CD3（FBTA05）等多种bsAb，其中Catumaxomab被欧盟批准用于恶性腹水的治疗，Ertumaxomab和FBTA05目前也已经完成了针对乳腺癌和B淋巴细胞瘤的Ⅱ期临床试验。
Triomab bsAb为鼠源性抗体，为降低潜在的严重免疫原性风险，研究人员希望通过结构改造构建人源IgG样bsAb。根据抗体的CH3介导重链二聚体的形成这一功能特点，分别对2条重链的CH3进行改造，通过电荷排斥/吸引作用或空间位阻作用，可使不同CH3倾向于形成异源二聚体的方式构建bsAb，利用电荷排斥/吸引作用或空间位阻作用改造CH3的技术分别称为离子桥技术和Knob-in-Hole（KiH）技术。结构研究发现，2条重链CH3间的E356-K439、E357-K370、D399-K409通过电荷吸引作用在二聚体的形成中起主要作用，因此，改变这些位置的氨基酸电荷状态可影响二聚体的形成。在重链A中引入K370E、K409D、K439E中的至少2个突变，重链B中引入E356K、E357K、D399K突变，可以抑制同源二聚体形成并促进重链异源二聚体的形成。在进一步的改造尝试中，在重链A中进行K409D突变，重链B中进行D339K突变，即可高效形成异源二聚体。该类突变理论上可以通过电荷排斥作用抑制同源二聚体的形成，但在实际操作中，重链同源二聚体的比例仍然较高。继续向重链A中引入K392D，向重链B中引入E356K突变，不仅不能进一步增加异源二聚体的比例，反而使表达量明显下降。也就是说，向bsAb抗体中引入更多的离子对型突变不仅不能如理论预期中增加抗体重链正确配对的能力，反而可能影响抗体产量并可能增加免疫原性[8-9]。除改变2条重链的电荷使其形成异源二聚体外，Moore等还通过结构模拟等方式指导突变，筛选结果表明重链A的A364H、F405A（HA）突变和重链B的Y349T、T394F（TF）突变可以提高异源二聚体形成效率，该突变方式与离子对突变方式获得的异源二聚体比例相当，可达89%[9]。利用空间位阻效应，Genentech公司提出了Knob-in-Hole方式制备bsAb的技术，在Knob链中引入S354C、T366W突变，在Hole链中引入Y349C、T366S、L368A、Y407V突变，通过空间位阻增加重链异源二聚体形成比例的同时，采用二硫键稳定已经形成的异源二聚体，使Konb-in-Hole抗体的比例达到约97%[17]。
Davis等发现人IgG和IgA的CH3区不能彼此结合，而将结构相似的beta链片段置入后两者可以形成IgG样的异源二聚体[10]，将该类bsAb称为SEED（strand exchanged engineered domain，SEED）抗体。利用该原理，Muda等在西妥昔（Cetuximab）的基础上开发了一系列bsAb，但关于该技术的具体应用尚未见后继报道[18]。Wranik等发明了“LUZ-Y”结构的bsAb，该模式中，通过使用柔性肽段连接重轻链的方式确保重轻链配对的同时，采用在重链末端融合表达亮氨酸拉链的方式确保异源二聚体的形成[19]。
通过四杂交瘤或CH3改造技术可有效确保bsAb异源重链之间的正确配对，在此基础上，重轻链之间的正确配对成为摆在bsAb开发者前面的另一个重要障碍。
1.1.2 重链-轻链的正确配对目前开发了多种确保重链-重链正确配对的技术，可以使重链异源二聚体的比例占比达到90%左右，但若不通过一定手段确保重链-轻链间的正确配对，则随机配对产生的抗体中，目的bsAb的含量仅占25%。因此，研究人员进一步开发了多种技术以确保重轻链间的正确配对。
首先想到的方式为模仿KiH技术，对重轻链作用表面的氨基酸进行改造。Zhu等通过在2对重轻链组合的轻链中分别引入Y87A或F98M突变，对应的重链分别引入V37F或L45W突变，可以确保不同特异性的重轻链间的正确配对[11]，但该方式不具有广泛的适用性而仅适用于作为实验对象的抗体。由于VL-CL/VH-CH为异源二聚体，且VL-CL/VH-CH的结构多变，因此通过氨基酸突变来确保重轻链间正确配对的难度较大。另一种确保重轻链间正确配对的方式为采用共有轻链。由于重链，特别是重链的互补决定区（complementarity-determining region，CDR）3在抗体的特异性和亲和力中发挥决定性作用，而轻链则为辅助作用，因此，对轻链的要求较低，通过噬菌体展示技术，可以在固定轻链的情况下，筛选具有不同特异性的重链用于bsAb的构建。通过共有轻链，Jackman等构建了针对Fcε受体Ⅰ（FcεRⅠ）和Fcγ受体Ⅱb（FcγRⅡb）的bsAb[20]。虽然共有轻链技术不存在重轻链错配的问题，但该结构bsAb的开发难度大，且不能确保所有的抗原配对均能筛选到合适的共有轻链，因此至今未见采用该结构的bsAb进入临床。
当前最常用的促进bsAb中重轻链正确配对的技术为Genentech开发的Crossmab技术，由于CL-CH1间可通过结构互补作用形成异源二聚体，且CL-CL和CH1-CH1间具有排斥作用，因此通过将bsAb的1个Fab臂中的VL-VH或CL-CH1在重轻链间进行互换，另1个Fab臂不进行改动，这样形成的VH-CL或VL-CH1轻链与正常的VH-CH1间相互排斥，可在一定程度上避免2条Fab臂中轻链的错配。Crossmab bsAb的组装过程中也会有部分副产物产生，如VL-VH的互换可能会形成VH-CL+VH-CH1的错配产物，而CL-CH1的互换可能会形成VL-CH1+VL-CL的副产物[13]。虽然有上述副产物的产生，在采用异源轻链构建的bsAb中，使用Crossmab技术仍可获得很高的重轻链正确配对比例。此外，对Crossmab bsAb的研究发现，结构域的交换对bsAb的活性、稳定性和表达效率没有产生显著影响。利用Crossmab技术，Genentech构建了抗Ang-2/VEGF bsAb，可同时抑制2种血管生成因子的生物学作用，在肿瘤和年龄相关湿性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）治疗中的效果好于单独使用2个母抗体的治疗效果，目前该抗体已经进入Ⅰ期临床试验。
1.2 含附加可变区的IgG样bsAb通过融合蛋白的方式，在重链和/或轻链上增加其他特异性的抗原结合片段，可以将传统IgG改造为bsAb。增加的抗原结合片段可以为单域抗体、单链抗体或其他的抗原结合蛋白，称为附加可变区[21]。含附加可变区的IgG样bsAb的最简单形式为在重链或轻链的N端或C端融合单链抗体或单域抗体的结构形式。除上述结构形式之外，附加可变区IgG样bsAb的另1种结构形式为双可变区（dual variable domain，DVD）IgG，即通过在IgG的重链和轻链的N端分别增加1个其他特异性抗体的重链和轻链的可变区，使抗体可以特异性结合2个不同抗原[22]。在DVD技术基础上结合与KiH和Crossmab技术还可以制备四特异性抗体[23]。这种结构的bsAb可以避免IgG样结构bsAb中存在的重链-重链和重链-轻链错配的问题。目前Abbvie&Abott公司的DVD结构bsAb的构建技术较为成熟，该企业开发的用于治疗类风湿性关节炎的IL17+TNFa DVD-IgG和用于治疗骨性关节炎的IL1α+IL-1β DVD-IgG均已完成Ⅱ期临床试验。
1.3 片段连接bsAb串联片段bsAb为通过连接肽将不同的Fab、单链抗体、单域抗体或抗原结合片段等结构以一定的排列顺序予以连接而获得的bsAb，片段连接bsAb的VH-VL正确配对需借助多种机制，包括连接肽（BiTE、scDiabody等）、二硫键（miniantibody）、CH3 KiH（sc-Diabody-CH3、scFV-CH3）等。该类抗体由于缺乏恒定区，特别是缺乏Fc片段，半衰期较短，而且其表达量和表达后的细胞内稳定性一般低于传统IgG[24]。同时，多数的该类抗体在纯化过程中难以采用亲和纯化手段，因此其纯化工艺和成品中的杂质分析也较传统IgG复杂[25-26]。
由于片段连接bsAb体内半衰期短，活性阻断为治疗机制的bsAb不适合采用该类设计。片段连接bsAb多为一端抗肿瘤特异性/相关抗原，另一端抗CD3抗体，通过将T细胞招募至肿瘤细胞周围并激活，借助T细胞杀伤效应达到治疗效果，与此同时，还可在一定程度上获得免疫记忆效应，其中最典型的为Amgen制备的Blinatumomab。该BiTEbsAb通过柔性肽段将CD19和抗CD3 scFv连接，通过招募T细胞至CD19+的B淋巴瘤细胞周围达到治疗作用[27]，Blinatumomab目前已被FDA批准用于急性淋巴细胞白血病的治疗，并表现出良好的疗效。
1.4 融合蛋白型bsAb和化学偶联型bsAb融合蛋白型和化学偶联型bsAb结构上具有相似性，均为通过连接子（蛋白、连接分子等）将不同特异性的抗体/抗体片段（IgG、Fab、scFv等）进行连接，形成可同时结合2个或以上抗原的蛋白分子。
融合蛋白型bsAb与片段连接型bsAb不同，后者通过柔性的连接肽连接2个抗原结合蛋白，连接肽仅具有保持分子完整性的功能，而融合蛋白型bsAb中，2个抗原结合蛋白融合于载体蛋白上，载体蛋白除确保分子完整性外，还具有其他功能，如，抗体与白蛋白融合后可延长抗体片段的半衰期[28]，抗CD3抗体与T细胞受体融合后可以拓展T细胞的识别范围[29]。
化学偶联型bsAb中，首先需分别制备2个抗体/抗体片段后，通过化学键将两者偶联或将两者同时与载体蛋白偶联，其制备过程本身增加了产物的复杂性，增加了产品的质控难度。最近新发展起来的一种化学偶联型bsAb结构为CovX-Body，该结构中，通过将1个具有治疗作用的小的抗原结合肽与已有抗体偶联，构建bsAb的同时，延长了抗原结合肽的半衰期[30]。
2 部分已批准的和进入临床试验阶段的bsAb表 1列出了部分已经批准上市和当前处于临床阶段的bsAb。
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表 1 部分已批准上市和处于临床试验阶段的bsAb Table 1 Partial bsAbs approved and in clinical trial |
细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）在抗肿瘤免疫反应中具有重要作用，但肿瘤细胞可通过多种机制逃避免疫细胞的攻击[32]。抗CD3+抗肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen，TSA）/肿瘤相关抗原（tumor association antigen，TAA）bsAb可通过其独特的功能，招募免疫效应细胞，特别是CTL，至肿瘤细胞周围，增加两者的接触，使免疫效应细胞短暂激活并杀伤肿瘤细胞[33]。除CTL外，具有Fc片段的bsAb还可以招募自然杀伤（natural killer，NK）细胞（CD16a）、单核细胞（CD32a）和粒细胞（CD64），增强抗肿瘤免疫效应。该类bsAb较多，其结构形式也多种多样，如抗EpCAM+CD3的Catumaxomab（Triomab）、抗CD19+CD3的Blinatumomab（BiTE）和抗CD123+CD3的MGD006（DART）等[33-34]。
3.2 阻断生长/增殖信号传导通路在部分肿瘤中，细胞表面的生长因子受体及其下游的信号转导通路参与了肿瘤的形成和维持，如HER2、EGFR等，阻断这些受体可以抑制肿瘤的生长。在部分肿瘤中，可能多种受体同时参与了肿瘤的形成，此时，需要同时阻断2种或2种以上受体的信号转导过程以达到更好的治疗效果。如抗HER2+HER3的MM-111（HSA融合bsAb）、抗IGF-1R+HER3的MM-141（scFv-IgGs）、抗EHFR+HER3的Duligotuzumab（DAF）等[35-37]。
3.3 阻断肿瘤新生血管生成新生血管生成是肿瘤发展过程中的重要促进因素之一，多个血管生成因素参与了该过程，包括血管生成因子受体2（vein endothelial growth factor receptor，VEGFR）、VEGFR3、VEGFA、angiopoietin-2（Ang-2）、血小板衍化生长因子（platelet-derived growth factors，PDGFs）等。根据目前的研究结果，VEGFA和Ang-2在肿瘤新生血管的生成中起到了重要作用。RG7221为Crossmab结构的抗VEGFA+Ang-2 bsAb，目前已经进入临床Ⅱ期[38]。
3.4 阻断细胞因子多种细胞因子参与了自身免疫病的发生，如TNFa、IL-6、IL-17、IL-1、IL-12等。bsAb可以同时阻断2种或2种以上细胞因子的生物学效应，在部分自身免疫性疾病的治疗中具有独特的优势，如抗IL-13+IL-4的SAR156597（scFv-IgG）、抗IL-6R+HSA的ALX-0061（Nanobodies）和抗TNFa+IL-17的ABT-122（DVD）等[39-40]。
4 前瞻由于bsAb的特点，其在肿瘤、自身免疫病和炎症性疾病等方面表现出极大的临床应用前景，同时结构的多样性和复杂性使其在设计、生产和质控中存在很大的难点。虽然目前仅批准了2个bsAb，但数十个在研bsAb已经进入临床研究阶段，其中数个制品展现出良好的应用前景，相信随着越来越多的bsAb获批上市，相应的技术亦会随之建立发展和完善，并推动bsAb产品进一步向前发展。
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