2019, Vol. 39 
近年来抗体类生物治疗药物因其与靶抗原结合的特异性、有效性和安全性等特点，在临床恶性肿瘤、心血管疾病和自身免疫病等重大疾病中取得了快速发展，已经成为近年来研究的热门药物之一[1-2]。抗体药物的活性测定反映了其临床应用的体内效力，是抗体药物质量控制的重要指标。目前抗体药物的活性测定主要是在体外建立相应的细胞评价模型，模拟其作用机制，产生客观的全程量效反应，并通过与活性标准品的比较对其生物学活性进行评价[3]。近年来，转基因细胞技术和一些新技术也被应用于抗体类药物的活性测定。本文建立的均相时间分辨荧光（HTRF）技术即为其中之一。
HTRF技术是在时间分辨荧光共振能量转移理论基础上建立的，结合了时间分辨荧光（time-resolved fluorescence，TRF）和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）2种技术原理。TRF技术利用稀土元素中镧系元素的独特性质，其荧光比普通荧光持续时间更长，普通荧光的半衰期为纳秒级，镧系元素的半衰期是毫秒级，有6个数量级的差别[4]。所以，在检测时，每个激发光脉冲过后，通过时间延缓期，让短寿命的荧光衰变掉后，再记录稀土螯合物的荧光强度，几乎可以完全消除背景荧光的干扰，提高灵敏度，反映样品的实际情况（图 1-A，Cisbio公司提供）。FRET技术（图 1-B，Cisbio公司提供）利用了2种荧光基团的能量转移，这2种荧光基团分别称为能量供体和能量受体。能量供体被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与受体比较接近，可以将能量共振转移到受体上，使受体受到激发，发出特定波长的发射光[5-6]。当供体和受体分别与相互作用的2个生物分子结合，生物分子的结合可以将能量供体和受体拉到足够近的距离，产生能量转移。由于受体的发射光来自于能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤，大大减少了实验操作步骤。
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图 1 TRF技术（A）及FRET技术（B）的原理 Figure 1 Principles of TRF technique(A) and FRET technique(B) |
HTRF的能量供体是铕（Eu）和铽（Tb）的穴状化合物，在这个穴状化合物里，Eu和Tb被永久地嵌合在1个笼子里，结构非常稳定，对温度、pH、金属离子、螯合物等耐受性极强。HTRF的能量受体也有2种，交联别藻蓝蛋白（cross-linked APC，商品名XL665）和小分子荧光探针d2，它们的光学性质相同，相对分子质量不同。前者相对分子质量为1.05×105，实际上就是改良过的别藻蓝蛋白（APC）；后者相对分子质量较小，约为1×103，可减少空间位阻对实验的可能影响。本实验中选定铽（Tb）为能量供体，d2为能量受体。
基于以上原理，使得HTRF技术具有可有效去除背景荧光，操作简单，体系稳定等优点[7-9]。故本研究利用此技术建立一种快速、简便测定以程序性死亡因子（PD-1）/程序性死亡因子受体（PD-L1）为靶点的单抗药物活性的分析方法，具体原理见示意图 2（Cisbio公司提供）。
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图 2 HTRF法检测PD-1/PD-L1的原理 Figure 2 The principle of detecting PD-1/PD-L1 by HTRF method |
Envision多功能酶标仪，PerkinElmer公司产品。
1.1.2 供试品及主要试剂抗PD-1单抗参比品和供试品、抗PD-L1单抗供试品、抗RANKL单抗供试品、抗CTLA-4单抗供试品均为中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留存。
Human PD1/PDCD1 Protein（His Tag），货号10377-H08H；Human PD-L1/B7-H1/CD274 Protein（Fc Tag），货号10084-H02H，均为Sino Biologcal公司产品。Anti-6his-Tb和d2 labeling kit及96半孔板均为Cisbio公司产品；其他试剂为进口或国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 Human PD-L1 Protein的标记按照d2 labeling kit说明书进行操作。用50 mmol·L-1的碳酸盐缓冲液（用800 mL超纯水溶解1.5 g碳酸钠和2.9 g碳酸氢钠，调pH 9.0后定容至1 000 mL）置换PD-L1蛋白的反应体系，得到16.67 μmol·L-1的蛋白溶液。将此溶液100 μL加入d2荧光受体的染料瓶中，室温孵育45 min。用NAP-5的分子筛柱子进行纯化，上样后先用600 μL洗脱剂（100 mmol·L-1磷酸盐缓冲液，pH 7.2）进行洗脱不收集，再加入400 μL洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液即为标记后PD-L1-d2蛋白，用于测定蛋白浓度。
1.2.2 HTRF法测定抗PD-1/PD-L1单抗活性用稀释液（0.1% BSA PBST）将抗PD-1/PD-L1单抗供试品稀释至20 μg·mL-1，再进行1.8倍比稀释，共制备11个梯度，质量浓度分别为20.00、11.11、6.17、3.43、1.91、1.06、0.59、0.33、0.18、0.10、0.06 μg·mL-1，即得供试品溶液；用反应缓冲液（0.1% BSA PBST）稀释Human PD1/PDCD1 Protein（His Tag）至2.64 μg·mL-1，稀释Anti-6his-Tb至300 ng·mL-1，稀释PD-L1-d2至6.4 μg·mL-1，即得各检测试剂；在96半孔板中，每孔5 μL加入供试品溶液，再将各个检测试剂每孔5 μL加入其中，空白对照孔不加入Human PD1/PDCD1 Protein和供试品，用反应缓冲液替代。室温震荡孵育3 h后读数，设置激发波长340 nm，在发射波长620 nm和665 nm处读取荧光值。读取荧光信号值后，用软件进行分析，以ΔF={[（A样品665 nm÷A样品620 nm）-（A空白665 nm÷A空白620 nm）]÷（A空白665 nm÷A空白620 nm）}×100值作为纵坐标，以单抗浓度对数为横坐标绘制四参数拟合曲线。
1.2.3 实验条件的优化在反应缓冲液（0.1% BSA PBST）中添加0.4 mol·L-1氟化钾进行检测，考察氟化钾对HTRF荧光值的影响。
1.2.4 方法学验证按照《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》（GPH1-1），验证方法的专属性、精密性、准确性和线性。
1.2.4.1 专属性分别按“1.2.2”项下方法制备抗PD-1、PD-L1、细胞核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、细胞毒性T细胞抗原-4（CTLA-4）的单抗供试品溶液进行实验，考察检测试剂是否与各单抗供试品反应，且呈浓度变化。
1.2.4.2 精密度（1）重复性：按优化后的实验条件，同一名分析人员对抗PD-1单抗参考品和供试品在相同条件下重复检测6次，测定供试品的相对效价并计算6次测定结果的RSD。（2）不同分析人员精密性：按优化后的实验条件，由2名不同分析人员对抗PD-1单抗参考品和供试品在相同条件下重复检测6次，测定供试品的相对效价并计算2名分析人员12次测定结果的RSD。
1.2.4.3 准确性制备抗PD-1单抗预稀释质量浓度分别为10、15、20、25、30 μg·mL-1的样品溶液，其相对结合活性的理论值分别为50%、75%、100%、125%、150%，按优化后的检测方法进行3次重复实验，分析不同浓度样品活性回收率。
1.2.4.4 线性以各浓度样品的理论相对活性为横坐标，以实际测得的相对活性的为纵坐标，进行线性拟合。
2 结果 2.1 HTRF测定抗PD-1/PD-L1单抗活性的剂量效应曲线利用GraphPad Prism 7软件分析实验数据，以抗PD-1/PD-L1单抗浓度对数为横坐标，对应的Delta F值为纵坐标，绘制四参数拟合曲线。抗PD-1/PD-L1单抗供试品均存在剂量依赖性，呈反S型剂量效应曲线见图 3。
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图 3 抗PD-1/PD-L1单抗供试品剂量效应曲线 Figure 3 Dose-response curves of anti PD-1/PD-L1 mAb |
氟化钾是HTRF实验中荧光基团穴状化合物的保护剂，其对荧光值有显著的影响[10]。如图 4所示，反应缓冲液中添加0.4 mol·L-1的氟化钾可以提高荧光响应值。
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图 4 氟化钾对反应值的影响 Figure 4 Effect of potassium fluoride on the assay window |
如图 5的结果表明：检测试剂只与抗PD-1/PD-L1单抗发生反应，并呈剂量依赖性，不与抗RANKL和抗CTLA-4单抗发生反应，说明本方法对抗PD-1/PD-L1单克隆抗体具有特异性，专属性符合要求。
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图 5 方法的专属性分析 Figure 5 Specificity analysis of the method |
由2名不同分析人员按优化后方法对抗PD-1单抗参比品和供试品进行检测，在相同条件下分别重复检测6次。如表 1结果所示，2名分析人员检测的相对效价范围为85%~117%，且总RSD小于15%。
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表 1 方法的重复性及精密度分析 Table 1 Repeatability and accuracy analysis of the method |
方法准确性的结果如图 6所示，不同浓度样品单次回收率及平均回收率均在80%~120%之间，且3次重复结果的RSD≤15%，本方法准确性符合要求。
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图 6 方法的准确性分析 Figure 6 Accuracy analysis of the method |
理论相对活性与实际测得的相对活性线性拟合图见图 7，线性方程y=0.996 6x-1.450 8，线性方程的斜率0.996 6，相关系数R2=0.993 2。线性方程的相关系数R2≥0.95，斜率接近1.0，本方法的线性符合要求。
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图 7 方法的线性分析 Figure 7 Linearity analysis of the method |
HTRF技术继放射免疫、酶标免疫、化学发光、电化学发光之后成为一种更新、更灵敏的检测方法。由于它集合了酶标记技术、放射标记技术和同位素标记技术的优点[11-12]，是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，也是用来研究药物靶标的理想平台[13-14]。HTRF技术凭借诸多优势越来越受到各领域科研工作者的关注。首先，操作步骤简单，不需要提前包被、封闭和洗板等诸多环节，可以极大地减少实验所需时间[15]；其次，体系非常稳定，可以反复读板，抗干扰能力强；再次，假阳性率低，可去除产物自发荧光引起的背景，反映样品的实际情况；最后，应用灵活，荧光标记手段可以检测蛋白相互作用、配体受体结合、信号通路、酶学修饰等不同的生物模型。
本文构建的HTRF检测方法选择穴状化合物Tb为能量供体，d2为能量受体，当使用340 nm波长的光激发穴状化合物供体时，会发出620 nm波长的荧光，如果此时其与受体d2足够近，那么供体能量将会转移给受体，使得受体d2发出665 nm波长的荧光，将供体和受体分子分别标记到相互作用的2个分子上，分子结合后供体d2发出的荧光强度与形成的复合物的量成正比。成功地构建了抗PD-1/PD-L1单抗药物活性检测方法，其操作简便易行，专属性强，准确性和精密度良好，多次重复结果总RSD均小于15%，线性相关系数在0.99以上，满足测定的要求，可用于单抗药物的活性检测，也可以为其他单克隆抗体活性测定方法的建立提供参考。
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