2019, Vol. 39 
CD38是一个45 kDa的单链跨膜糖蛋白，整体结构分为N末端短的胞质尾、单次跨膜域和C段长的胞外区[1]。作为胞外酶，可催化环腺苷二磷酸核糖（cyclic ADP-ribose，cADPR）的合成和降解[2]，cADPR是核苷酸的代谢产物，通过作用于ryanodine受体参与细胞内钙库的钙动员，其所介导的钙离子信号传递参与了许多病理和ryanodine生理过程。作为受体，CD38与CD31配体结合，并参与细胞粘附和信号传导。CD38分子的表达与分布比较广泛，无细胞系限制性，而与细胞的分化和活化状态有关[3]，CD38通常在T细胞和B淋巴细胞分化的早期阶段表达，在成熟的中期阶段失表达，并在成熟的最后阶段再次表达。NK细胞以及单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞上均可检测到CD38，在血小板和红细胞也有低水平CD38表达。CD38在B淋巴细胞、T淋巴细胞和骨髓来源的几种血液恶性肿瘤过度表达，但在正常淋巴细胞、骨髓细胞和一些非造血组织中表达水平较低，因此靶向CD38的单抗对多种血液恶性肿瘤具有潜在治疗作用，包括多发骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和慢性/急性淋巴细胞白血病[4-6]等。
以多发骨髓瘤为例，多发性骨髓瘤是一种浆细胞恶性肿瘤，以骨髓中恶性浆细胞的增殖、血液和/或尿液中通常出现单克隆蛋白、骨破坏、贫血、肾脏和免疫损伤为特征，预后较差。全球多发性骨髓瘤的发病率为0.15/10 000人，每年有超过100 000例新发病例，死亡率为0.10/10 000人。过去，多发骨髓瘤的疗法非常有限，通常使用皮质类固醇、美法仑等，随着自体造血干细胞移植的开发，中位生存期得到改善。随着生物医药的发展，出现了许多新型药物，如蛋白酶体抑制剂硼替佐米、免疫调节药物沙利度胺和来那度胺、脱乙酰酶抑制剂帕比司他、靶向SLAMF7的埃罗妥珠单抗，使其生存率得到改善[7-9]。近来，靶向CD38的单抗药物成为研发热点。抗CD38单抗可通过CDC、ADCC和抗体依赖的细胞介导的吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP），诱导表达CD38的恶性肿瘤发生肿瘤细胞溶解。其中Daratumumab针对复发和难治型多发骨髓瘤患者显示出较好的疗效[10]。处于临床研究阶段的抗CD38单抗包括Isatuximab和MOR202[11-12]，此外国内亦有企业开展抗CD38单抗的临床前研究。
本研究所用抗CD38单抗由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达，经细胞培养、纯化制备获得，是一种新靶点IgG1型抗体。为了有效地对抗CD38单抗进行质量控制，保证其安全、有效，本研究以抗CD38单抗为目标产品，根据《中华人民共和国药典》及ICH等相关指导原则的要求，针对肽图、CE-SDS、SEC-HPLC、iCIEF、结合活性、生物学活性等产品的关键质量属性进行探讨，为抗CD38单抗的质量控制提供参考[13]。
1 材料与方法 1.1 样品抗CD38单抗的参比品和样品均为本室留样。
1.2 细胞人B淋巴母细胞Daudi为ATCC产品，ADCC效应细胞为本室构建，即对Jurkat细胞进行基因改造，使其稳定表达FcγRⅢa受体V158突变体和由活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）应答元件驱动表达的荧光素酶。
1.3 主要仪器及试剂肽图检测采用Waters 2695高效液相色谱仪、2487紫外检测器，Lys-C消化酶购自Wako公司，NAP-5 Sephadex G-25脱盐柱购自GE Healthcare，BioSuite C18 PA-B（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）购自Waters公司。毛细管电泳系统为Beckman公司的PA800 plus系统、PDA检测器，SDS-MW分析试剂盒（含有0.1 mol·L-1氢氧化钠，0.1 mol·L-1盐酸，SDS样品缓冲液，SDS-MW Gel Buffer）、Beckman毛细管（50 μm×31 cm，有效长度21 cm）均购自Beckman Coulter公司。分子筛液相色谱检测采用Waters 2695高效液相色谱仪、2487紫外检测器，2根串联的ProSEC300s（7.5 mm×30 cm，5 μm）以及保护柱ProSEC300S（50 mm×7.5 mm）购自Agilent（Varian）公司。ProteinSimple公司iCE280毛细管等电聚焦成像仪，载体两性电解质Pharmalyte 3-10购自GE Healthcare公司，iCE280试剂盒（包括0.5%和1%甲基纤维素，阳极及阴极电解液）、涂层毛细管、pI markers 7.05和9.50均购自ProteinSimple公司。结合活性检测用CD38抗原为本室留存，山羊抗人IgG（H+L）抗体辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）结合物购自Jackson ImmunoResearch公司，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB）底物购自Invitrogen。CDC和ADCC活性检测用RPMI 1640购自Invitrogen公司，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自Sigma公司，正常人血清补体购自Quidel公司，热灭活胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和低IgG FBS购自Gibco，Cell Titer-GloTM和Bio-GloTM荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司，美国Molecular Devices公司SpectraMax M5多功能酶标仪及Softmax分析软件。
1.4 方法 1.4.1 肽图取蛋白0.5 mg，加入1 mol·L-1二硫苏糖醇2.5 μL，并加入变性缓冲液（6.0 mol·L-1盐酸胍，100 mmol·L-1 Tris-HCl，2.5 mmol·L-1 Na2EDTA，pH 8.0）100 μL，混匀后置于37 ℃水浴60 min，取出后加入1 mol·L-1碘乙酰胺6 μL，室温避光孵育60 min。使用NAP-5 Sephadex G-25脱盐柱进行脱盐处理（脱盐柱保存液流穿后，使用10 mL酶切缓冲液平衡脱盐柱。将处理后的样品全部加入，补加酶切缓冲液400 μL，弃掉流穿液。再加酶切缓冲液1 mL，收集流穿液），取250 μL脱盐后的样品加入Lys-C消化缓冲液（50 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0）650 μL，混匀后加入0.5 mg·mL-1 Lys-C溶液16 mL，采用涡旋器混合均匀，置于37 ℃水浴中放置4 h；加入0.1% TFA溶液4 mL，混合均匀，灭活Lys C。采用Waters 2695系统，C18色谱柱分离。检测条件：流动相A为0.1%的TFA水溶液，流动相B为0.1%的TFA乙腈溶液，梯度洗脱（0~5 min，0%流动相B；5~10 min，0%→2%流动相B；10~15 min，2%→5%流动相B；15~60 min，5%→20%流动相B；60~130 min，20%→33%流动相B；130~150 min，33%→35%流动相B；150~155 min，35%→70%流动相B；155~160 min，70%→100%流动相B；160~165 min，维持100%流动相B；165~166 min，100%→0%流动相B；166~176 min，维持0%流动相B），流速0.2 mL·min-1，上样量100 μL，样品室温度6 ℃，柱温40 ℃，检测波长214/280 nm，检测时间176 min。
1.4.2 CE-SDS用超纯水将样品稀释至10 mg·mL-1，取30 μL加入巯基乙醇5 μL（还原）/0.25 mol·L-1 N-乙基马来酰亚胺5 μL（非还原）、SDS样品缓冲液161 μL，混匀后，75 ℃水浴5 min，取80 μL置进样瓶中上机分析。采用Beckman PA800 plus毛细管电泳系统，使用无涂层毛细管（总长度31 cm，有效长度21 cm）检测。检测条件：分离电压为15 kV，毛细管温度25 ℃，样品室温度为25 ℃，检测波长为220 nm。计算样品“轻链+重链”和非糖基化重链（nonglycosylated heavy chain，NGHC）（还原型），及主峰（非还原型）峰面积百分比。
1.4.3 SEC-HPLC将样品用缓冲液A（称取9.45 g NaH2PO4·H2O，8.44 g Na2HPO4·7H2O，36.73 g NaClO4，溶解于1 L去离子水中，以1 mol·L-1盐酸调节pH至6.2）稀释至10 mg·mL-1。采用Waters 2695 HPLC系统、2489紫外检测器、ProSEC300s（7.5 mm×30 cm，5μm）色谱柱进行检测。检测条件：流动相为900 mL缓冲液A与100 mL乙腈的混合液，流速为0.3mL·min-1，上样量10 μL，进样器温度5 ℃，柱温25 ℃，在280 nm处检测。采用面积归一化法计算单体百分比。
1.4.4 成像毛细管等点聚焦电泳（iCIEF）将样品用纯水稀释至20 mg·mL-1，取2 μL与70 μL的1%甲基纤维素，1 μL的pI marker 7.05，1 μL的pI marker 9.50，8 μL的Pharmalytes 3-10和118 μL超纯水混匀。分析条件：预聚焦电压1.5 kV，持续1 min；聚焦电压3 kV，持续10 min。
1.4.5 结合活性用PBS将CD38抗原溶液稀释至2 μg·mL-1，每孔50 μL加入到酶标板中，室温包被2 h。洗板3次后，每孔加入200 μL封闭液封闭，用封板膜封好，室温封闭1 h。用稀释液将样品预稀释至1 200 ng·mL-1，然后4倍稀释，共8个稀释度。封闭后将板中溶液甩出，洗板3次后，向酶标板中加入每孔50 μL的稀释好的供试溶液，室温孵育1 h。洗板3次后，将人抗IgG（H+L）山羊抗体HRP结合物以PBS稀释至26.6 ng·mL-1，以每孔50 μL加入酶标板中，室温孵育1 h。洗板3次后，加入TMB底物显色液每孔50 μL，室温避光孵育7 min。加入终止液每孔50 μL，终止反应。在SpectraMax M5酶标仪上，以450 nm为检测波长进行读数，并用Softmax分析软件进行4-Parameter回归，绘制曲线。
1.4.6 CDC活性取对数生长期的Daudi细胞，将细胞离心（1 000 r·min-1）后丢弃上清液，将细胞沉淀物用检测缓冲液（RPMI 1640，含0.5%BSA）重悬，计数后用检测缓冲液调整细胞密度为8×105个·mL-1。将制备的细胞悬液以每孔50 μL加入96孔培养板中，在37 ℃和5% CO2条件下孵育45 min。在96孔板中将样品以检测缓冲液连续稀释，起始质量浓度为2 000 ng·mL-1，2倍稀释，共8个稀释度。将各稀释度的供试溶液按照每孔50 μL加入预先加入细胞的96孔板中，在2~8℃条件下孵育平板60 min。向所有孔中以每孔50 μL加入4倍稀释的正常人血清补体，在37 ℃和5% CO2条件下孵育平板2 h。按照每孔加入Cell Titer-GloTM 100 μL，于暗处静置30 min。在SpectraMax M5酶标仪上，采用化学发光模式进行读数，并用Softmax分析软件进行4-Parameter回归，绘制曲线。
1.4.7 ADCC活性取对数生长期的Daudi细胞（靶细胞），将细胞离心（1 000 r·min-1）后丢弃上清液，将细胞沉淀物用分析缓冲液（RPMI 1640+4%低IgG FBS）重悬，计数后调整细胞密度为3×105个·mL-1，将制备的靶细胞悬液以每孔25 μL加入96孔培养板中，在37 ℃和5% CO2条件下培养30 min。将样品以分析缓冲液稀释至起始浓度5 000 ng·mL-1，4倍稀释，共8个稀释度。将稀释好的供试溶液按照每孔25 μL加入含有靶细胞的96孔板中，在37 ℃和5% CO2条件下培养45 min。以分析缓冲液调整ADCC效应细胞的密度为3.0×106个·mL-1，将效应细胞悬液以每孔25 μL加入检测板各孔中，在37 ℃和5% CO2条件下培养6 h。解冻Bio-GloTM试剂和重组底物，按照每孔75 μL加入检测板中，在黑暗环境温度下孵育5~30 min，在SpectraMax M5酶标仪上，采用化学发光模式进行读数，并用Softmax分析软件进行4-Parameter回归，绘制曲线。
2 结果 2.1 肽图RP-HPLC肽图检测代表性图谱见图 1。目视观察，参比品和样品均具有特征图谱，样品与参比品图谱一致。肽图的分辨率较高，可对样品进行有效鉴别。
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图 1 抗CD38单抗参比品（A）与样品（B）的肽图典型图谱 Figure 1 Representative peptide maps of reference (A) and sample (B) of anti-CD38 mAb |
还原CE-SDS检测结果表明（图 2-A），经3次测定，样品轻链+重链的峰面积百分比为（97.87±0.72）%，RSD为0.74%；NGHC面积百分比为（0.32±0.04）%，RSD为12.50%。非还原CE-SDS检测结果表明（图 2-B），经3次测定，样品主峰峰面积百分比为（97.70±0.35）%，RSD为0.36%。
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图 2 抗CD38单抗样品的还原（A）和非还原（B）CE-SDS代表图谱 Figure 2 Representative maps of reduced (A) and non-reduced (B) CE-SDS for anti-CD38 mAb samples |
SEC-HPLC检测结果见图 3，经6次测定，10 mg·mL-1供试溶液上样100 μL时，样品中单体的峰面积百分比为（99.15±0.01）%，RSD为0.01%；高分子量物质的峰面积百分比为（0.47±0.002）%，RSD为0.43%；低分子量物质的峰面积百分比为（0.37±0.01）%，RSD为2.70%。
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图 3 抗CD38单抗样品的SEC-HPLC代表图谱 Figure 3 SEC-HPLC representative maps of anti-CD38 mAb samples |
样品的iCIEF代表性图谱见图 4。目视观察，供试品有1个主峰，左侧的酸性峰和右侧的碱性峰得到有效分离。经6次测定，主要亚型的峰面积百分比为（63.54±0.37）%，RSD为0.58%；酸性组分的峰面积百分比为（23.07±0.50）%，RSD为2.17%；碱性组分的峰面积百分比为（13.38±0.12）%，RSD为0.90%；主峰pI为8.23。
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图 4 抗CD38单抗样品的iCIEF代表图谱 Figure 4 iCIEF representative maps of anti-CD38 mAb samples |
结合活性主要考察样品与CD38抗原产生特异性结合的能力。所得数据用Softmax软件分析后符合四参数方程式：Y=（A-D）/[1+（X/C）B]+D，即在半对数坐标上呈典型的S型曲线，拟合优度R2大于0.99。经6次测定，样品的结合活性EC50值为（7.35±0.06）%，RSD为8.98%。
2.6 CDC活性抗体与DND-41细胞表达的CD38结合。添加人类补体后，可通过经典补体途径的级联反应诱导靶细胞裂解。通过加入WST-1四唑盐，剩余活细胞的代谢活性可将其还原。每孔中测量的吸光度与活细胞数量成比例，从而能够建立量效关系。经四参数方程拟合，拟合优度R2大于0.99。经3次测定，供试品的CDC活性EC50值为（70.63±9.14）%，RSD为12.94%。
2.7 ADCC活性抗CD38抗体可与靶细胞Daudi表面的CD38抗原结合，当抗体与靶细胞表面的目标抗原结合后，抗体的Fc段可与效应细胞表面的FcγRⅢa受体结合，导致效应细胞和靶细胞发生多重交联，从而ADCC作用通路被激活，介导效应细胞杀伤靶细胞。由于在效应细胞Jurkat中稳定表达了FcγRⅢa受体V158（高亲和力）突变体和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶，因此抗CD38抗体介导的信号通路激活可诱导荧光素酶的表达，可通过加入荧光素酶底物检测量效关系。经四参数方程拟合，拟合优度R2大于0.99。经3次测定，样品的ADCC活性EC50值为（8.71±1.04）%，RSD为11.94%。
3 讨论治疗性单克隆抗体因其具有作用机制明确，特异性强，副作用小和疗效确切等优势，已经逐渐成为制药企业的研发热点。随着研究的不断深入，单抗在制药行业中所占的比重越来越大，在许多临床重大疾病中发挥了不可替代的作用。随着免疫学的进展和对疾病的研究不断深入，新的药物靶点不断出现，也对其质量控制提出了新的挑战。CD38是近年来受到广泛关注的一个靶点，目前已有强生公司的抗CD38单抗Daratumumab获批上市，显示了明确的临床治疗作用，国内外许多机构正在开展抗CD38单抗药物的研发工作。鉴于此，建立标准化的抗CD38单抗药物质控方法显得尤为必要。
本研究建立了抗CD38单抗的肽图鉴别方法，肽图检测采用了对脱氨基、甲硫氨酸氧化、C-末端封闭和错误二硫键等结构改变敏感的Lys-C肽图，根据供试品和参比品特征图谱的比对进行鉴别。值得注意的是，由于不同单抗的区别往往在CDR区域，在肽图分析时一般会要求对CDR的特征性肽段进行鉴别。
纯度测定是单抗药物的常规质量控制项目，传统研究单抗大小异质性的方法包括SDS-PAGE和SEC-HPLC，近年来CE-SDS由于其高分辨率、自动化、重复性好的优点而得到广泛应用[14]。单抗Fc段的N-糖修饰对抗体生物学效应的发挥具有重要效应，而还原CE-SDS由于其高分辨率可以发现非糖基化重链，而普通的SDS-PAGE则检测不到。SEC-HPLC采用温和的条件对CD38单抗进行分离，保持了抗体天然的状态，使得共价和非共价结合的聚体均能与单体进行有效分离。本研究建立了抗CD38单抗的还原/非还原CE-SDS和SEC-HPLC质控方法。
单抗电荷异质性的评价方法包括平板等电聚焦（IEF）和离子色谱，前者分辨率较差，近年来由于iCIEF的高分辨率、自动化、重复性好等优点，越来越广泛的被应用于单抗等电点和电荷异质性检测，本研究建立了抗CD38单抗的iCIEF质控方法[15-16]，可对样品的酸碱成分进行有效分离和控制。离子交换色谱（ion exchange-high performance liquid chromatography，IEC-HPLC）是常用的电荷异构体控制方法，但针对不同的单抗需要摸索不同的条件，而iCIEF更易于平台化。与iCIEF不同，IEC-HPLC的酸碱峰可通过适当手段进行收集，并进一步进行组分鉴别。因此可进一步建立IEC-HPLC方法评价该产品的电荷异质性，并对各种组分进行功能评价[17]。
抗体药物的活性检测一般包括结合活性和生物学活性，结合活性反映抗体与靶抗原的特异性结合能力，而生物学活性除可反映与靶抗原的特异性结合外，还可反映结合后所产生的生物学效应。本研究建立了间接ELISA法检测抗CD38单抗的结合活性。但是结合活性仅能反映抗体与抗原的特异性结合能力，尚不足以反映与临床药效相关的生物学效应。抗CD38单抗与靶细胞表面的CD38抗原结合后，可通过CDC作用、ADCC作用和ADCP作用诱导杀伤靶细胞。本研究建立了CDC方法和ADCC方法来评价生物学活性[18-19]，可以较好地模拟药物的体内作用。
绝大多数IgG1单抗在Fc段的CH2结构域有1个N糖基化位点，对于依赖Fc段发挥生物学效应的单抗，其N糖基化修饰类型的确认十分必要，且可反应生产工艺的稳定性和批间一致性[20-22]。本产品CDC和ADCC效应的发挥与N糖基化修饰密切相关，因此应进一步建立质控方法，如质谱法或色谱法，对N-糖进行控制。
根据ICHQ6B建议，对药物的某一质量属性应建立2种或2种以上基于不同原理的检测方法，本研究采用多种方法对抗CD38单抗进行了鉴别、纯度分析和活性检测，建立的质控方法对于评价产品的安全、有效和质量可控具有重要意义，可为该类制品的研发提供有益的参考和借鉴。
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