棘球蚴病俗称包虫病，是由棘球属绦虫的幼虫-棘球蚴寄生于人和动物的肝、肺等组织器官而引起的一种重要的人畜共患寄生虫病，对人体健康和畜牧业的发展产生很大的危害^[1]。其中, 多房棘球蚴病属于泡型包虫病(alveolar echinococcosis, AE)，其症状类似癌症。在流行病学中，犬科动物作为最终宿主，各种啮齿动物作为中间宿主，其复杂的流行生活史给公共卫生带来重大负担^[2]。目前, 主要以阿苯达唑作为治疗包虫病，但其效果并不理想，为此迫切需要研发新型药物^[3]。

目前，DNA损伤诱导样蛋白作为治疗疾病的潜在药物靶点引起了人们的广泛关注。DNA损伤诱导样1蛋白(DNA damage inducible 1 protein，Ddi1)是一种多结构域蛋白，其中心是逆转录病毒蛋白酶样结构域(RVP)^[4]，在所有真核生物中高度保守，与天冬氨酸蛋白酶家族A2同源，由于Ddi1属于穿梭蛋白家族，可靶向多聚泛素化底物使蛋白酶体水解^[5-6]。Ddi1的3 D结构与HIV-1蛋白酶(HIV-1 protease，PR)的结构相似，并且表达天冬氨酸蛋白酶发挥功能，HIV蛋白酶抑制剂(HIV protease inhibitors，HIV PIs)通过抑制HIV天冬氨酸蛋白酶将前体蛋白切割其活性位点，从而抑制Ddi1的活性，可作为寄生虫和病毒感染以及癌症治疗和预防的潜在药物靶点^[7-8]。目前，上市的9种HIV蛋白酶抑制剂是奈非那韦、利托那韦、茚地那韦、安普那韦、洛匹那韦、阿扎那韦、福沙那韦、替普那韦和达鲁那韦，发现奈非那韦是最有效的，同时对其相互作用的结构蛋白进行生物信息学分析发现92个预测的细胞靶标，与奈非那韦结合亲和力最强的是天冬氨酸蛋白酶^[9]。此外，奈非那韦在抗癌、抗病毒和抗寄生虫方面也非常有效，是目前预防和治疗相关疾病的有潜力的小分子药物^[3]。研究报道在蠕虫全基因组中存在逆转录病毒样天冬氨酸蛋白酶基因序列，并证明了奈非那韦药物抗寄生虫的机制与阻断EmuDdi1酶活性密切相关^[3]。本研究拟在昆虫细胞系中表达出EmuDdi1蛋白，进而通过酶活性分析和小分子药物抑制力分析，进一步筛选靶向抑制寄生虫蛋白酶活性抑制力效果好的HIV蛋白酶抑制剂，以期成为替代药物的潜力。

1 材料与方法 1.1 主要材料

1.1.1 细胞质粒 　　Sf9昆虫细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司。DH10bac感受态细胞购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 　　T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、2×PCR Master Mix均购自TaKaRa公司；硫酸卡那霉素、盐酸四环素、硫酸庆大霉素购自Aladdin公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow蛋白纯化填料购自美国GE公司。HRP-Conjugated 6×His，His-Tag单克隆抗体购自北京安诺伦生物科技有限公司；质粒小提试剂盒、无内毒素质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；ECL化学发光显色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；三乙醇胺、利托那韦、沙奎那韦、安普那韦、阿扎那韦、洛匹那韦、福沙那韦、达芦那韦均购自Macklin公司；醋酸钠缓冲液和DMSO购自Sigma公司。

1.2 pFastBac1-Emu Ddi1重组载体的构建

根据Emu Ddi1基因的ID：(WormBase：EmuJ_000898400.1)下载CDS区序列，在序列上游插入酶切位点BamHⅠ(GGATCC)，其次加入Kozak序列(GCCGCCACC)和一段分泌信号肽(MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA)，中间插入目的基因CDS序列，在其下游插入8 His Tag-Flag (CACCACCATCATCACCATCACCAC)，最后插入酶切位点XhoⅠ(CTCGAG)，送至西安擎科生物有限公司基因合成。合成后的基因与表达载体pFastBac1同时用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，双酶切产物用T4 DNA连接酶在16 ℃过夜连接，将连接产物转化至DH10bac感受态中，无抗LB复苏1 h后涂布于抗性的蓝白斑筛选的平板上，其包含50 μg·mL^-1卡那霉素、7 μg·mL^-1庆大霉素、100 μg·mL^-1四环素、40 μg·mL^-1 X-gal和100 μg·mL^-1 IPTG。待24 h后挑取白色菌落于5 mL含有三抗的LB培养基中，于37 ℃ 220 r·min^-1过夜培养。次日吸取1 mL菌液用天根小提质粒提取试剂盒进行提取，用M13引物PCR鉴定和双酶切方法验证单克隆菌株。所用引物M13 F：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M13 R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′；PCR反应总体系为25 μL：上述提取质粒1 μL，2×PCR Master Mix酶12.5 μL，M13F和M13R终浓度为10 μmol·L^-1各0.5 μL，其余用无菌水10.5 μL补足。反应条件为96 ℃ 3 min；96 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30次循环，72 ℃ 5 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，将双重验证为阳性的重组质粒送至西安擎科生物有限公司测序，将测序比对结果一致的作为阳性菌株，将其1 ∶100比例100 mL LB培养基中大量扩增，为下一步细胞转染做准备。

1.3 重组质粒转染及收获P1代

取2 mL密度为0.5×10⁶ mL^-1的Sf9细胞接种于六孔板中，27 ℃静置待细胞贴壁。吸取20 mL扩增菌液用无内毒素小提中量试剂盒提取质粒，然后将1 μg的质粒与转染试剂在1.5 mL无菌离心管中充分混匀后，用培养基补至1 mL混匀，再轻轻加至提前铺好贴壁的Sf9细胞中。于27 ℃静置培养至细胞出现病毒感染迹象(4~7 d)，将其余培养物离心后转移至无菌2.0 mL EP管中，作为P1代病毒置于4 ℃避光保存。取少量样品提取总蛋白用Western blot检测表达情况，HRP-conjugated 6×His, His-tag单克隆抗体稀释至1 ∶1 000室温孵育90 min，用TPST洗涤30 min，每次10 min，用ECL化学发光液在化学发光成像系统中检测。

1.4 扩增P2代病毒和纯化可溶性蛋白

取30 mL密度为2.0×10⁶ mL^-1的Sf9细胞接种至250 mL三角瓶中，再向三角瓶中加入1 ∶100的P1病毒以扩增P2病毒，27 ℃ 120 r·min^-1培养4 d。将培养物收集离心后上清液转移至50 mL无菌离心管中，取5 mL进行Ni柱纯化并利用Western blot检测纯化情况，与上述“1.3”中所用试剂和方法一致，其余上清作为P2病毒置于4 ℃避光保存。小量检测确定表达后进行大量纯化，取200 mL密度为2×10⁶ mL^-1的Sf9细胞接种至1 L三角瓶中，再向三角瓶中加入1 ∶100的P2病毒以扩大表达，27 ℃ 120 r·min^-1培养4 d。将培养物离心后取全部上清进行Ni柱纯化，同时取少量再次利用SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度，最终将获取蛋白透析至pH7.4的PBS中，分装后，-80 ℃保存备用。

1.5 酶活性检测

为了确定底物对重组酶活性的最佳蛋白浓度和pH，进行筛选重组蛋白工作的浓度和反应缓冲液的pH。用BCA蛋白浓度检测试剂盒对纯化的蛋白进行定量，将重组蛋白工作终浓度设定为6、20、50、100、200 μg·mL^-1，然后设置反应缓冲液的pH为3、5、7和9，选择10 mmol·L^-1三乙醇胺和100 mmol·L^-1醋酸钠作为反应缓冲液。用合成带有荧光的底物DABCYL-GABA-SQNYPIVQ-EDANS检测酶活性，设计200 μL的反应体系：终浓度为100 mmol·L^-1醋酸钠缓冲液，2 μmol·L^-1底物，10 μg·mL^-1纯化的Ddi1蛋白，PBS为对照，设置3个重复孔，在37 ℃静置孵育2 h后，通过SYNERGY H1酶标仪检测OD_{340 nm}和OD_{490 nm}处荧光强度。筛选后将底物设置浓度梯度为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 μmol·L^-1，用上述方法进行检测，最终所得的荧光数值用GraphPad Prism (v5.0)计算该酶的米氏常数(Km)和最大速度值(Vmax)。

1.6 HIV PIs对Emu Ddi1蛋白的抑制效率分析

为了研究沙奎那韦、利托那韦、安普那韦、阿扎那韦、洛匹那韦、福沙那韦、达芦那韦7种蛋白酶抑制剂对Ddi1蛋白活性位点的抑制作用，分别用这些药物与蛋白相互作用，以终浓度为20 μmol·L^-1的药物与10 μg·mL^-1重组酶在37 ℃提前作用2 h，然后加入2 μmol·L^-1底物，继续37 ℃孵育2 h，DMSO和PBS作为对照，设置3个重复孔，最终分别在加入底物0、2 h后时用“1.5”所用的仪器和方法检测荧光强度。所测数值统计后用公式抑制率%= (DMSO荧光数值-待检HIV PIs各荧光数值)/DMSO荧光数值×100%。

1.7 奈非那韦蛋白酶抑制剂的药效能力分析

为了测定药物活性和EmuDdi1活性位点对药物的亲和力，进而检测沙奎那韦的IC₅₀，将药物的浓度用DMSO稀释为0、1、5、10、20、40、80、160、320、640 μmol·L^-1后分别提前与10 μg·mL^-1重组蛋白在37 ℃反应2 h，随后加入终浓度为2 μmol·L^-1底物，37 ℃反应2 h，以PBS为对照，设置3个重复孔，最终分别在加入底物0和2 h后时用“1.5”所用的仪器和方法检测荧光强度，用GraphPad Prism(v5.0)所得荧光数值作出曲线图，得出IC₅₀分析的结果值。

2 结果 2.1 成功构建重组质粒，纯化可溶性分泌蛋白

通过M13引物扩增鉴定出了pFastBac1-EmuDdi1重组质粒的阳性克隆菌株，同时双酶切验证和测序比对，符合预期大小1 281 bp。重组质粒转染后筛选出了正确的P1代，其Western blot结果显示，该分泌性靶标蛋白在45 ku大小处表达，符合预期大小。经过P2代病毒的扩增和少量Ni柱纯化后，Western blot验证结果显示，在45 ku大小处表达，与P1代的鉴定结果一致。最终将P2代病毒大量扩增，纯化出目的蛋白，且Western blot结果与P2代结果相符(图 1)，成功获取可溶性目的蛋白。

2.2 pFastBac1-Emu Ddi1重组蛋白活性分析

通过对重组蛋白浓度、反应缓冲液pH、缓冲液种类的筛选后，其结果显示醋酸钠缓冲液的效果优于三乙醇胺缓冲液，蛋白浓度为10 μg·mL^-1，pH7时可得到最高的荧光数值，说明该合成底物对重组Ddi1蛋白活性位点有很好的切割效果，同时证明了该重组酶在pH7时具有最佳的水解活性，通过酶动力学曲线分析后得出其Km值为1.422 μmol·L^-1(图 2)。以上结果证明了Emu Ddi1具有良好的蛋白酶活性。

2.3 沙奎那韦对Emu Ddi1蛋白活性的阻断作用

HIV蛋白酶抑制剂对天冬氨酸蛋白酶的活性结构位点具有抑制和阻断的作用，通过检测7种蛋白酶抑制剂对重组EmuDdi1活性的影响，结果显示，20 μmol·L^-1的沙奎那韦对Emu Ddi1可溶性蛋白有良好的抑制作用，其抑制率分别为67%，其他6种抑制剂对重组蛋白活性没有很好的抑制效果，同时沙奎那韦IC₅₀为34(图 3)，该结果表明沙奎那韦能有效阻断Ddi1蛋白活性。

3 讨论

Ddi1是一种泛素依赖性蛋白酶，该蛋白的活性位点位于二聚体两个亚基之间裂隙的界面上^[5]，当底物蛋白被标记为大约8个长泛素链时才会进行切割^[10-11]，通过长泛素链标记合成的HIV蛋白酶底物在体外弱酸环境pH5时证明了利什曼原虫Ddi1重组蛋白是一种具有活性的天冬氨酸蛋白酶^[12]，同时也验证了该原虫Ddi1蛋白是HIV蛋白酶抑制剂的药物靶标，可作为防治病原微生物的化学治疗剂^[13]。本研究分析了EmuDdi1重组蛋白酶的活性，而该酶在中性条件下具有最佳水解活性，酶动力学相关数值也证明了该重组蛋白具有良好亲和力，评估了Ddi1蛋白的活性，同样证实Emu Ddi1是天冬氨酸蛋白酶抑制剂治疗的潜在药物靶点。

HIV蛋白酶抑制剂以多种方式和功能对抗疾病，例如通过阻断上皮细胞DNA合成^[14]，阻断链溶酶S的产生^[15]，阻断寄生虫信号肽酶并阻止巴贝斯虫在红细胞中生长^[16]。洛匹那韦、利托那韦和替拉那韦阻断ste24p蛋白酶水解^[17]。洛匹那韦通过引起虫体脂质代谢改变，从而直接抑制天冬氨酸酶并阻止了鞭毛虫的发育^[18]。沙奎那韦或利托那韦通过降低基质金属蛋白酶的活性，阻断瘤样病变细胞的侵袭^[19-20]。相反的，HIV蛋白酶抑制剂具有副作用或甚至没有作用，比如蛋白酶抑制剂治疗会引起胃肠反应和肝损伤的副作用^[21]，蛋白酶抑制剂治疗白色念珠菌后并没有减少或抑制对内皮细胞的黏附作用^[22]。之前的研究发现奈非那韦通过穿透囊泡抑制包囊生长能力和原头节活性，而这一作用和阻断酶的活性相关^[2]。在本研究结果中沙奎那韦对Emu Ddi1重组蛋白活性具有67%的抑制效果，IC₅₀检测是一种标志药物效应的一种重要定量指标，其结果也进一步评价了沙奎那韦具有良好的药效性，证明在7种蛋白酶抑制剂中沙奎那韦对Ddi1蛋白活性具有抑制和阻断作用。为此，可推测属于同一类药物的沙奎那韦可通过穿透包囊，抑制Ddi1蛋白酶活性，从而抑制包囊及原头节活力。

为了提高HIV蛋白酶抑制剂的治疗效果，有研究将抑制剂与PLGA纳米粒子联合使用从而降低了弓形虫脑炎发生^[23]，也有洛匹那韦和奈非那韦联合治疗改善了肾细胞癌^[24]，利托那韦与抗真菌药物联合应用抑制Phialophora verrucosa增殖^[25]。近期研究报道利用分子建模工具预测分析沙奎那韦与COVID-19蛋白酶活性位点更好的结合，可作为治疗SARS-CoV-2感染的一线药物^[26]。在本研究结果中沙奎那韦具有较好的药效性，这可能为探讨奈非那韦与沙奎那韦联合应用对抑制包囊发展和抑虫作用提供新依据。

在体外治疗的相关功能研究中，蛋白酶抑制剂可抑制75%~90%的受精卵转化，有根除疟疾传播的潜力^[27]，奈非那韦和洛匹那韦治疗克鲁兹锥虫病4 h后降低了锥虫的活力^[28]。但是沙奎那韦体内外治疗效果及奈非那韦联合治疗效果还需进一步证实。HIV PIs还通过信号传导途径抑制病毒复制和肿瘤细胞生长，比如通过ROS依赖的线粒体途径诱导宫颈癌细胞凋亡和细胞周期停滞^[9]，通过抑制CD36活化和减缓CPT-1脂肪酸转运蛋白来抑制骨骼肌脂肪酸氧化^[29]，还可通过下调Akt通路信号影响NEL对胶原代谢和脯氨酸对胶原生物合成^[30]。近期研究表明沙奎那韦通过靶向受体二聚化抑制TLR4激活，从而调节宿主TLR4介导的免疫反应和炎症风险^[31]。作者团队之前的研究也表明，奈非那韦可以有效地渗透到包虫包囊中从而杀死寄生虫和治疗包虫病^[2]，在本研究中发现沙奎那韦对可溶性重组蛋白的活性具有抑制作用，其相关机制还有待进一步研究证实。

4 结论

本研究通过构建pFastBac1-EmuDdi1表达载体，转染Sf9细胞系纯化出可溶性分泌重组蛋白Ddi1，进一步检测该蛋白的活性和蛋白酶抑制剂对该重组蛋白活性抑制能力，最后筛选得到沙奎那韦具有67%的抑制率和IC₅₀为34的良好药效性，发现了沙奎那韦有望成为靶向包虫病的候选药物，为沙奎那韦替代其他药物或联合奈非那韦治疗包虫提供新策略。