2. 湖南龙华农牧发展有限公司, 茶陵 412400;
3. 茶陵县畜牧水产事务中心, 茶陵 412400
2. Hunan Longhua Agriculture and Animal Husbandry Development Co., LTD, Chaling 412400, China;
3. Chaling County Livestock and Aquatic Affairs Center, Chaling 412400, China
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪A群轮状病毒(porcine rotavirus type A, PoRVA) 和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV) 为三种常见导致猪群腹泻的病毒，临床上症状极其相似，很难判断猪群感染的病毒种类[1-3]。本研究拟建立出一种RT-qPCR检测方法，可用于同时快速检测猪群腹泻的三种病毒，并为其他检测方法的研究提供一定的参考和借鉴。
1 材料与方法 1.1 样品来源猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)疫苗毒(C株)、PEDV、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV) 等均由湖南龙华农牧发展有限公司研发中心保存。临床样本均从湖南省某腹泻养猪场内采集。
1.2 主要仪器和试剂全自动医用PCR分析系统(SLAN-96P)购自上海宏石医疗科技有限公司；TOROIVD Probe 1-step RT-RT-qPCR 5 G kit3.0购自天罗诊断科技江苏有限公司；MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒IV(BSC94S1EX-A)、BioRT Master One Step RT-PCR Kit试剂盒和全自动核酸提取纯化仪均购自杭州博日科技股份有限公司。
1.3 引物探针设计与合成在GenBank网站中下载PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因序列。应用Primer 5.0及Oligo7软件设计特异性引物与探针。引物与探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 1)。
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表 1 引物和探针序列 Table 1 Primers and probe sequences |
使用表 1中PCR引物扩增，纯化并鉴定为目的片段后，根据说明书构建成重组质粒，再转入到DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆菌，提取重组质粒并测定其浓度，同时换算成拷贝数备用。
1.5 方法条件优化及标准曲线的建立对引物探针浓度及退火温度进行优化。选取101~107 copies·μL-1的混合质粒扩增，将拷贝数以10为底的对数与检测的Ct值为横纵坐标绘制标准曲线，并计算扩增效率和相关系数。
1.6 方法性能评估1.6.1 特异性和敏感性试验 用本方法对PEDV、PoRVA和PRRSV等进行扩增，判断该方法特异性。对稀释的10-1~106 copies·μL-1的混合质粒进行扩增，每个浓度质粒重复4个孔，参考Bustin等[4]的研究，检出率95%以上的最低浓度为最低检测限，即敏感性。
1.6.2 重复性和样本适应性试验 对高、中、低浓度质粒扩增，每个浓度重复3孔，进行组内重复试验；分3个不同时间段重复上述操作，进行组间重复试验。从拭子样、泥土样、饲料样、组织样和血清样等几种常见的阴性临床样本提取的核酸同等比例混合阳性核酸后进行检测并判断样本适应性。
1.6.3 稳定性试验 于25 ℃(不避光)、25 ℃(避光)、4 ℃和-20 ℃各保存7 d；于-20 ℃和室温冻融次数5和10次，检测时现配体系为对照组。对同一质粒进行扩增，判断该方法稳定性。
1.7 与商品化试剂盒对比检测用本方法与单重商品化试剂盒对比检测不同含量的PEDV、PoRVA和PDCoV的核酸，以评估该方法与商品化试剂盒的差异，每种项目各检测40份，合计120份。
1.8 检测方法的初步应用将在湖南省某规模化正在发生腹泻的养猪场内采集的40份猪群肛门拭子样和40份栏舍环境样进行检测，并统计各病原的阳性率及混合感染情况等。
2 结果 2.1 标准质粒的制备测定制备成功的质粒浓度后根据拷贝数计算公式[5]：DNA拷贝数=[6.02×1014×DNA浓度(ng·μL-1)]/目的基因组的分子量，目的基因组分子量=碱基数×324。计算出PEDV、PoRVA和PDCoV的拷贝数分别为6.15×1010、7.47×1010和7.05×1010 copies·μL-1。
2.2 方法条件优化对PEDV、PoRVA和PDCoV的引物探针浓度、退火温度等条件进行优化，确定了本方法的最佳反应条件：2×5G RT-qPCR Buffer GB 12.5 μL；RT-qPCR Enzyme MIX UD 1. 3 μL；PEDV正反向引物终浓度为0.2 μmol·L-1、探针终浓度为0.05 μmol·L-1，PoRVA正反向引物终浓度为0.4 μmol·L-1、探针终浓度为0.03 μmol·L-1，PDCoV正反向引物终浓度为0.6 μmol·L-1、探针终浓度为0.01 μmol·L-1；模板5 μL，ddH2O补充至25 μL。最佳反应条件：37 ℃ 2 min；52 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s(此阶段收集荧光)，45个循环；25 ℃ 10 s。
2.3 标准曲线PEDV的回归方程为y1=-3.27x+36.005(R2=0.999 9，E=102.21%)，PoRVA为y2=-3.442x+37.041(R2=0.999 9，E=95.21%)，PDCoV为y3=-3.144 5x+34.424(R2=0.999 8，E=107.98%)，回归方程相关系数R2均高于0.999，扩增效率E均为90%~110%，说明建立的三重RT-qPCR方法扩增较为理想。
2.4 方法性能的评估2.4.1 特异性和敏感性试验 如图 1，本方法仅PEDV、PoRVA、PDCoV有特异性“S型”扩增曲线和Ct值，其他均为阴性。4个重复中，PEDV检出率为95%以上的最低浓度为1 copies·μL-1，因此最低检测限为1 copies·μL-1。同理，PoRVA和PDCoV的最低检测限均为1 copies·μL-1。说明本研究方法特异性较好，敏感性较高。
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a. 特异性试验(1. PEDV核酸；2. PoRVA核酸；3. PDCoV核酸；4. PRRSV核酸；5. PCV2核酸；6. PRV核酸；7. MHP核酸；8. CSFV核酸；9. 临床阴性样本；10. 灭菌超纯水)；b~d. PEDV、PoRVA和PDCoV敏感性试验(1~8. 浓度为106~10-1 copies·μL-1的质粒) a. The specificity test (1. PEDV nucleic acids; 2. PoRVA nucleic acids; 3. PDCoV nucleic acids; 4. PRRSV nucleic acids; 5. PCV2 nucleic acids; 6. PRV nucleic acids; 7. MHP nucleic acids; 8. CSFV nucleic acids; ;9. Clinical negative samples; 10. Sterilized ultra-pure water); b-d. PEDV, PoRVA and PDCoV sensitivity tests (1-8. Plasmids with a concentration of 106-10-1 copies·μL-1) 图 1 三重RT-qPCR特异性和敏感性试验结果 Fig. 1 Specificity and sensitivity analysis results of triple RT-qPCR |
2.4.2 重复性和样本适应性试验 对不同浓度的质粒进行扩增，并重复3孔，结果PEDV、PoRVA和PDCoV组内变异系数为0.11%~0.43%，组间变异系数为0.12%~0.70%，均小于1%。检测拭子、泥土、饲料等不同类型样本，变异系数小于1%。说明本方法重复性和样本适应性良好。
2.4.3 稳定性试验 将建立的三重RT-qPCR方法全混后于不同条件下进行试验，如表 2，本方法在-20 ℃保存7 d及冻融5和10次均有较高的检测水平，稳定性较好。
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表 2 三重RT-qPCR预混体系稳定性试验结果 Table 2 Stability test results of triple RT-qPCR premixed system |
本方法PEDV和PoRVA与商品化试剂盒的检测符合率为92.5%和97.5%，多检出了3份PEDV和1份PoRVA临界值的阳性样本；用另一方法对本方法多检出的5份PDCoV样本进行检测, 结果也为阳性且病原含量较高，说明本方法对PDCoV毒株检测范围更广。
2.6 检测方法的初步应用80份临床样本均未检测到PDCoV。40份拭子样，70%(28份)为PEDV阳性，17.5%(7份)为PoRVA阳性，两种病毒混合感染占10%(4份)。40份环境样，55%(22份)为PEDV阳性，2.5%(1份)为PoRVA阳性。说明该猪场猪群腹泻主要是由PEDV导致的，同时伴随了少量的PoRVA混合感染。
3 讨论“预防为主”是疾病防治的合理措施，具备敏感性高、特异性好、检测稳定和检测周期时间短的一种检测方法更有利于疾病的早期诊断及预防。本研究针对在不同毒株间具有较好保守性[6-8]的PEDV N基因、PoRVA VP6基因和PDCoV M基因设计引物和探针，建立的方法敏感性较高，对PEDV、PoRVA和PDCoV的最低检测限均达到1 copies·μL-1，相比施开创等[9]和高艺祥等[10]根据PEDV N基因、PoRVA VP6基因和PDCoV M基因建立的多重RT-qPCR方法敏感性有较大进步且检测的基因区间存在差异。同时，本研究还做了更为全面的方法评测，进行了特异性试验、重复性试验、样本适应性试验和稳定性试验，均表现良好。据孙博览[11]的研究，目前国内PDCoV的M基因在一定程度上有所变异。相比于某些早期研发的商品化试剂盒，本研究PDCoV项目保守性更强，对本次采集的变异毒株有较好的检测水平，在一定程度上减少了PDCoV的漏检情况，对变异毒株的检测方法进行了实时更进与优化。用本方法检测了40份临床腹泻猪只的肛门拭子样，其中PEDV阳性率为70%，PoRVA阳性率为17.5%，未检测到PDCoV，说明目前本次临床案例导致猪群腹泻的最主要病毒性疾病为PED。在检测的40份栏舍环境样中，PEDV阳性率为55%，对环境进行彻底的消毒处理，对于该病毒的防控具有非常重要的意义。
4 结论本研究成功建立了一种可同时快速检测PEDV、PoRVA和PDCoV的TaqMan三重RT-qPCR方法，具有敏感性高、特异性好、稳定性强和检测时间短(仅需1.5 h)等优势，为临床腹泻样本的检测提供了一种方法，也为检测方法的研究提供了一定的参考。
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(编辑 白永平)