2. 中国农业科学院兰州兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室, 兰州 730046;
3. 白银市农业综合行政执法队, 白银 730900
, GAO Guiqin3, ZHOU Guangqing2, WU Jinyan2, YAN Xinmin2, CAO Xiaoan2, HE Jijun2, YUAN Ligang1
, SHANG Youjun2
2. State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China;
3. The Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Team of Baiyin, Baiyin 730900, China
山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal adenocarcinoma，ENA) 是由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats，ENTV-2)引起的一种慢性、进行性、接触性传染病[1]。与绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)[2]、绵羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of sheep，ENTV-1)[3]类似，ENTV-2属于β反转录病毒属，为线性单股正链RNA病毒，基因组大小约7 500 bp，其结构类似于真核细胞内的mRNA，5′端为甲基化的帽结构(mGpppGmp)，3′端为多聚A (poly A)，基因组的两端为非编码区，中间编码区由一个相互重叠的gag-pro-pol-env基因组成[3-5]。ENTV-2病毒粒子为圆形，直径90~110 nm，最外层是囊膜，其表面附有大量的纤突，纤突的直径约为9 nm[1, 6]。病羊的肿瘤组织和鼻液中含有大量病毒粒子。研究者已经在ENTV-2的体外培养方面做了很多探索，但目前为止仍未找到可以稳定培养病毒的细胞系或成熟感染性的克隆[7]。ENTV-2的env基因的开放阅读框始于pol基因内部，它编码的多肽前体长约为617个氨基酸残基，预测分子量为68 ku[3, 8]。env的开放阅读框编码具有两个切割位点的多聚蛋白前体，一个蛋白酶切割位点将该基因切割成表面蛋白(surface protein，Su)和跨膜蛋白(transmembrane protein，Tm)，另一个位点位于信号肽序列之后，Su含有与靶细胞的表面受体Hyal2结合的位点[9-11]。研究表明env是一个癌基因，但env内没有形成肿瘤的组织特异性因子，其组织嗜性由3′特异元件(unique 3′ region，U3)和env共同决定[12-14]。宿主感染病原后临床上表现为浆液性鼻液，明显呼吸困难，消瘦，因肿瘤组织的增生使得山羊面部甚至颅骨变形，眼球突出[15]。该病潜伏期长，自然感染动物的潜伏期从几个月到2~4年不等，通常以死亡为转归[16]，发病初期很难通过临床症状进行判断，对山羊养殖业造成严重威胁。
该病于1939年首次在德国报道，此后在其他国家和地区相继被报道。我国于1995年在内蒙古首次报道以来，湖南、四川、安徽、陕西、贵州、福建、重庆均有山羊ENA病例[15]。目前, 既没有有效的药物，也没有疫苗防治该病，给山羊养殖业造成巨大的经济损失[17]。因此，建立快速、准确、高效的检测方法对该病的诊断和防控具有重要意义。
荧光定量PCR作为一种快速、灵敏的诊断方法已被广泛应用于病原检测、分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面，相比传统RT-PCR检测手段具有明显的优势。本研究基于TaqMan探针的荧光定量RT-PCR方法建立了山羊地方性鼻内肿瘤的快速检测方法，以期为ENTV-2的流行病学调查与防控提供技术手段。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 临床样品 山羊鼻内肿瘤组织材料、鼻拭子采自重庆、云南、陕西等地山羊养殖场。
1.1.2 主要试剂与材料 DL2000 DNA Marker、One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)、逆转录试剂盒、pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；2×Pro Taq预混液购自艾科瑞生物；胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒阳性核酸由本实验室保存。
1.2 试验方法1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank中公布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物(ENTV-2 F：5′-TGGTACGATGAGACTGCCTTAGAG-3′；ENTV-2 R：5′-CACTTTCGTGACATTATATGACAGG-3′)和TaqMan探针(ENTV-2 P：FAM-CCGCAAGGAAAGAAGTGTGAGCCTGATT-BHQ1)，引物的特异性目的片段长度为204 bp。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2.2 核酸提取 Trizol提取法提取病料样品总RNA，将制备好的核酸样本保存于-80 ℃冰箱备用。
1.2.3 质粒标准品的构建 按照反转录试剂盒说明书将“1.2.2”中获得的RNA反转录为cDNA，以设计的ENTV-2引物对进行PCR反应。按试剂盒说明书加入各反应组分并充分混匀，反应程序：94 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 循环数为35；最终72 ℃延伸2 min。反应结束后, 通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性片段经胶回收纯化后克隆至pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞。扩大培养、提取重组质粒，并将阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的重组质粒作为阳性标准品，并用NanoDrop2000测定重组质粒DNA浓度，根据公式：重组质粒的拷贝数(copies·μL-1)=重组质粒的浓度(g·μL-1)×6.02×1023/345×重组质粒的碱基长度，计算重组质粒拷贝数。
1.2.4 反应体系的优化 以重组质粒为模板，采用矩阵法对荧光定量RT-PCR反应体系中引物和探针的浓度进行优化，PCR反应体系中上游引物ENTV-2 F (10 μmoL·L-1)、下游引物ENTV-2 R (10 μmoL·L-1) 加液量分别为0.2、0.4、0.6、0.8 μL，探针ENTV-2 P (10 μmoL·L-1) 加液量为0.4、0.8、1.2、1.6 μL。反应条件为42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 20 s，40个循环，选择Ct值小且荧光强度大的最佳引物和探针组合作为最优反应体系。
1.2.5 荧光定量RT-PCR方法建立 将重组质粒标准品进行10倍倍比稀释，选取浓度为6.30×102~6.30×107 copies·μL-1标准质粒建立标准曲线。反应体系为20 μL：包括2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS(5 U·μL-1)、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ、上下游引物(10 μmoL·L-1)和探针(10 μmoL·L-1)各0.4 μL，质粒模板1.0 μL，无RNA酶水7.0 μL。每个稀释度设3个重复，并设置阴性对照。反应条件为42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 20 s，40个循环，在60 ℃处采集荧光信号。
1.2.6 特异性试验 以健康山羊鼻拭子和肾组织中提取的RNA作为内源性鼻内肿瘤病毒的阳性样本，以口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、蓝舌病毒核酸以及内源性鼻内肿瘤病毒核酸为模板，自然感染ENTV-2重组质粒为阳性对照，并设置阴性对照，用所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定其特异性。
1.2.7 灵敏性试验 选取10倍梯度稀释的重组质粒，浓度为6.30×100~6.30×107 copies·μL-1作为模板，每个浓度重复3次，阴性模板为无RNA酶水，进行荧光定量RT-PCR反应，根据Ct值和扩增曲线，以确定该方法的最低检测浓度, 同时用普通PCR扩增对本方法进行进一步的评估。
1.2.8 重复性试验 分别以6.30×104、6.30×105、6.30×106 copies·μL-1 3个稀释度作为模板，进行3次组内和组间重复试验，对Ct值进行分析，用以评价该方法的重复性。
1.2.9 临床样本检测 利用本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法对29份疑似感染ENTV-2的山羊组织和鼻拭子进行检测，以自然感染NTV-2山羊鼻拭子中提取的RNA为阳性对照，无RNA酶水为阴性对照，并和普通PCR方法进行比较[18]。
2 结果 2.1 重组质粒标准品的制备将样品中提取的RNA反转录为cDNA，以此为模板，PCR扩增出约204 bp大小的目的片段(图 1A)。切胶回收目的条带，连接至pMD18-T载体。提取的质粒经双酶切(图 1B)与测序鉴定，表明成功构建出阳性重组质粒。测得质粒浓度为200 ng·μL-1，换算成拷贝数约为6.30×1010 copies·μL-1。
|
A. 目的基因片段PCR扩增(M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1. 阳性对照；2. PCR扩增产物；3. 阴性对照)；B. 重组质粒双酶切鉴定(M. DL5000 DNA相对分子质量标准；1. 重组质粒的双酶切产物) A. PCR results of target gene fragment (M. DL2000 DNA marker; 1. Positive control; 2. PCR products; 3. Negative control); B. Double restriction endonuclease digestion identification of recombinant plasmid (M. DL5000 DNA marker; 1. Double enzyme digestion products of recombinant plasmid) 图 1 目的基因片段PCR扩增和重组质粒双酶切鉴定结果 Fig. 1 Results of PCR amplification of target gene fragments and double restriction endonuclease digestion identification of recombinant plasmid |
对引物浓度和探针浓度优化后，最终确定的最佳反应体系为20 μL，其中2× One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS(5 U·μL-1)、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ、上下游引物(10 μmoL·L-1)和探针(10 μmoL·L-1)各0.4 μL，质粒模板1.0 μL，无RNA酶水7.0 μL。反应条件为42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环，在60 ℃处采集荧光信号。
2.3 标准曲线的构建测序正确的阳性重组质粒，以6.30×102~6.30×107 copies·μL-1浓度为模板进行荧光定量RT-PCR扩增，并绘制标准曲线。扩增曲线和标准曲线(图 2)显示，拷贝数对数值(x轴)与Ct值(y轴)线性方程为Y=-2.953X+34.651，R2=0.996 5，E=110%，表明建立的方法具有较好的线性关系。
|
图 2 荧光定量RT-PCR标准曲线 Fig. 2 Standard curve of ENTV-2 detected by TaqMan RT-qPCR |
分别以口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、蓝舌病毒核酸以及内源性鼻内肿瘤病毒核酸为模板，自然感染ENTV-2羊鼻拭子中提取的RNA为阳性对照，无RNA酶水为阴性对照，进行荧光定量RT-PCR反应。结果(图 3)显示，该方法仅对ENTV-2具有特异性，其他病毒基因组和阴性对照均无特异性扩增曲线，表明该方法具有较强的特异性。
|
图 3 ENTV-2荧光定量RT-PCR特异性试验结果 Fig. 3 Specificity of TaqMan RT-qPCR in detecting ENTV-2 |
将所构建的重组质粒标准品10倍稀释，以6.30×100~6.30×107 copies·μL-1作为模板, 分别用荧光定量PCR和普通PCR进行扩增反应。结果显示，普通PCR的最低检出限为6.30×103 copies·μL-1，荧光定量RT-PCR对6.30×101 copies·μL-1仍可扩增出特异性曲线(图 4)，因此荧光定量RT-PCR比普通PCR的敏感性高。
|
1~8. 标准品浓度分别为6.30×107~6.30×100拷贝·μL-1；9. 阴性对照 1-8. The standard concentrations are 6.30×107-6.30×100 copies·μL-1; 9. Negative control 图 4 荧光定量RT-PCR灵敏性试验结果 Fig. 4 Sensitivity of the TaqMan RT-PCR assay for ENTV-2 |
以浓度分别为6.30×104、6.30×105、6.30×106 copies·μL-1 3个稀释度的重组质粒标准品作为模板进行3次重复性试验，结果显示，组间和组内的变异系数均在2%以内。表明建立的荧光定量RT-PCR方法重复性好。
2.7 临床样品检测应用本试验所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR和普通PCR方法对收集的29份临床样品分别进行检测，结果显示，本试验建立的荧光定量RT-PCR检测到ENTV-2阳性样品10份，检出率为34.48%(10/29)；普通PCR检测到ENTV-2阳性样品6份，检出率为20.69%(6/29)，二者的符合率为86.2%。表明本研究所建立的荧光定量RT-PCR检测方法较普通RT-PCR检测方法灵敏度更高。
3 讨论ENT特征是山羊鼻道筛骨上皮细胞发生肿瘤性转化，该病一年四季均可发生，多呈散发，潜伏期长，致死率高，对山羊养殖业的发展造成巨大影响[19]。除了澳大利亚和新西兰以外，大部分国家均有该病的报道。近年来，我国多地相继报道了该病的存在，严重影响我国山羊养殖业的健康发展[15, 20]。由于该病毒无法体外培养且无感染性分子克隆，限制了ENTV-2致瘤分子机理和免疫特性方面的研究[21-22]，目前，针对该病并没有有效的药物和疫苗来控制其发生和流行[23]，羊场一旦出现该病，难以清除，只能淘汰并且会造成长期危害。
因此，通过早期诊断及时淘汰患病羊降低经济损失对ENTV-2的防控具有重要意义。对该病的检测，常用方法为临床症状结合组织病理学方法，但组织病理学方法取材困难，程序复杂，耗时较长[1, 19]。研究者认为ENTV-2感染羊后并不能诱导特异性的免疫应答，或者病毒本身具有免疫抑制性，故血清学诊断方法难以实现[24-26]。
普通PCR灵敏度低，且感染早期患羊体内病毒载量可能并不高，容易产生假阴性结果，因此，此方法存在一定的局限性。实时荧光定量RT-PCR检测方法操作简单，灵敏度高，特异性好，已广泛应用于临床检测。染料法(SYBR Green)和探针法(TaqMan probe)是荧光定量PCR最常用的。染料法虽然价格低廉且不需要设计探针，但SYBR染料在浓度较高时会抑制PCR的反应，低浓度时不能充分结合DNA链，灵敏性没有探针法高。探针法虽然需要合成昂贵的特异性探针，但其能够精确地识别模板，比染料法特异性更强，灵敏度更高，并且探针法能够对病原进行早期诊断。但由于羊源内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses，ERVs)的存在，建立ENTV-2的PCR诊断方法仍存在一定困难[27]。近些年来，随着全基因序列的测定为建立PCR检测方法提供了基础。
本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针，建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法。用构建的阳性标准质粒进行标准曲线的制备，标准曲线线性关系好，相关系数R2为0.996 5。建立的ENTV-2荧光定量RT-PCR方法能检测的最低拷贝数为6.30×101 copies·μL-1。使用该方法对与其他常见病原及内源性逆转录病毒进行检测，均未扩增出特异性曲线，说明建立的方法对ENTV-2具有较强的特异性。通过对3个不同浓度的质粒进行检测，组间和组内的变异系数均在2%以内，说明该方法具有良好的重复性。应用本研究建立的荧光定量RT-PCR方法和普通PCR方法对29份临床样品进行检测，检出率分别为34.48% 和20.69%，敏感性高于普通PCR方法。本研究建立的ENTV-2 TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法可作为山羊ENT的一种有效的临床诊断工具，为ENTV-2快速诊断和流行病学调查提供支持。
4 结论通过检测标准质粒的各种参数和临床样本，证明本研究建立的ENTV-2的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点，可以补充现有的ENTV-2检测技术，为ENTV-2快速诊断和流行病学调查提供技术支持。
| [1] |
DE LAS HERAS M, ORTIN A, COUSENS C, et al. Enzootic nasal adenocarcinoma of sheep and goats[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2003, 275: 201-223. |
| [2] |
WOOTTON S K, HALBERT C L, MILLER A D. Envelope proteins of Jaagsiekte sheep retrovirus and enzootic nasal tumor virus induce similar bronchioalveolar tumors in lungs of mice[J]. J Virol, 2006, 80(18): 9322-9325. DOI:10.1128/JVI.00865-06 |
| [3] |
COUSENS C, MINGUIJON E, DALZIEL R G, et al. Complete sequence of enzootic nasal tumor virus, a retrovirus associated with transmissible intranasal tumors of sheep[J]. J Virol, 1999, 73(5): 3986-3993. DOI:10.1128/JVI.73.5.3986-3993.1999 |
| [4] |
WALSH S R, LINNERTH-PETRIK N M, LAPORTE A N, et al. Full-length genome sequence analysis of enzootic nasal tumor virus reveals an unusually high degree of genetic stability[J]. Virus Res, 2010, 151(1): 74-87. DOI:10.1016/j.virusres.2010.04.002 |
| [5] |
WALSH S R, GERPE M C R, WOOTTON S K. Construction of a molecular clone of ovine enzootic nasal tumor virus[J]. Virol J, 2016, 13(1): 209. DOI:10.1186/s12985-016-0660-x |
| [6] |
OZMEN O, SAHINDURAN S, HALIGUR M, et al. Clinical, pathological, immunohistochemical and ultrastructural observations on enzootic nasal adenocarcinoma in five goats[J]. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 2010, 16(4): 633-639. |
| [7] |
HE Y P, ZHANG Q, WANG J, et al. Full-length genome sequence analysis of enzootic nasal tumor virus isolated from goats in China[J]. Virol J, 2017, 14(1): 141. DOI:10.1186/s12985-017-0795-4 |
| [8] |
LIU S L, MILLER A D. Transformation of Madin-Darby canine kidney epithelial cells by sheep retrovirus envelope proteins[J]. J Virol, 2005, 79(2): 927-933. DOI:10.1128/JVI.79.2.927-933.2005 |
| [9] |
COTE M, ZHENG Y M, LIU S L. Receptor binding and low pH coactivate oncogenic retrovirus envelope-mediated fusion[J]. J Virol, 2009, 83(22): 11447-11455. DOI:10.1128/JVI.00748-09 |
| [10] |
HULL S, LIM J, HAMIL A, et al. Analysis of jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) envelope protein domains in transformation[J]. Virus Genes, 2012, 45(3): 508-517. DOI:10.1007/s11262-012-0793-y |
| [11] |
WALSH S R, DE JONG J G, VAN VLOTEN J P, et al. Truncation of the enzootic nasal tumor virus envelope protein cytoplasmic tail increases Env-mediated fusion and infectivity[J]. J Gen Virol, 2017, 98(1): 108-120. DOI:10.1099/jgv.0.000654 |
| [12] |
ROSALES GERPE M C, VAN LIESHOUT L P, DOMM J M, et al. The U3 and Env proteins of jaagsiekte sheep retrovirus and enzootic nasal tumor virus both contribute to tissue tropism[J]. Viruses, 2019, 11(11): 1061. DOI:10.3390/v11111061 |
| [13] |
YU D L, CHOW N, WOOTTON S K. JSRV intragenic enhancer element increases expression from a heterologous promoter and promotes high level AAV-mediated transgene expression in the lung and liver of mice[J]. Viruses, 2020, 12(11): 1266. DOI:10.3390/v12111266 |
| [14] |
WOOTTON S K, METZGER M J, HUDKINS K L, et al. Lung cancer induced in mice by the envelope protein of jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) closely resembles lung cancer in sheep infected with JSRV[J]. Retrovirology, 2006, 3: 94. DOI:10.1186/1742-4690-3-94 |
| [15] |
YE C, HUANG Q Y, CHEN T T, et al. First detection and genotypic analysis of goat enzootic nasal tumor virus 2 in Chongqing, China[J]. Arch Virol, 2019, 164(6): 1647-1650. DOI:10.1007/s00705-019-04211-2 |
| [16] |
SOBHY N M, YOUSEF S G, YOUSSEF C R B, et al. Molecular detection of mixed infection with peste des petits ruminants and retroviruses in Egyptian sheep and goats[J]. Trop Anim Health Prod, 2023, 55(2): 102. DOI:10.1007/s11250-023-03504-8 |
| [17] |
ZHAI S L, LÜ D H, XU Z H, et al. A novel enzootic nasal tumor virus circulating in goats from Southern China[J]. Viruses, 2019, 11(10): 956. DOI:10.3390/v11100956 |
| [18] |
郝中香, 谢智勇, 廖红, 等. 山羊鼻内肿瘤病毒RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学, 2014, 44(9): 933-938. HAO Z X, XIE Z Y, LIAO H, et al. Establishment of an RT-PCR method for detection of enzootic nasal tumor virus in goat[J]. Chinese Veterinary Science, 2014, 44(9): 933-938. (in Chinese) |
| [19] |
ORTÍN A, COUSENS C, MINGUIJON E, et al. Characterization of enzootic nasal tumour virus of goats: complete sequence and tissue distribution[J]. J Gen Virol, 2003, 84(Pt 8): 2245-2252. |
| [20] |
张靖鹏, 陈芹, 刘维巍, 等. 福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒2型感染流行病学调查[J]. 中国动物检疫, 2023, 40(6): 25-30. ZHANG J P, CHEN Q, LIU W W, et al. Epidemiological investigation on goat endemic intranasal tumor virus type 2 in Fuqing City of Fujian Province[J]. China Animal Health Inspection, 2023, 40(6): 25-30. (in Chinese) |
| [21] |
MAEDA N, INOSHIMA Y, DE LAS HERAS M, et al. Enzootic nasal tumor virus type 2 envelope of goats acts as a retroviral oncogene in cell transformation[J]. Virus Genes, 2021, 57(1): 50-59. DOI:10.1007/s11262-020-01808-7 |
| [22] |
WALSH S R, STINSON K J, MENZIES P I, et al. Development of an ante-mortem diagnostic test for enzootic nasal tumor virus and detection of neutralizing antibodies in host serum[J]. J Gen Virol, 2014, 95(Pt 8): 1843-1854. |
| [23] |
MAEDA N, FAN H. Signal transduction pathways utilized by enzootic nasal tumor virus (ENTV-1) envelope protein in transformation of rat epithelial cells resemble those used by jaagsiekte sheep retrovirus[J]. Virus Genes, 2008, 36(1): 147-155. DOI:10.1007/s11262-007-0193-x |
| [24] |
王彬. ENTV和enENTV全基因组分析及ENA组织miRNA差异表达分析[D]. 雅安: 四川农业大学, 2016. WANG B. Genomic sequence analysis of oncogenic and endogenous enzootic nasal tumor virus of goats and analysis of ENA tissue miRNA expression difference[D]. Ya'an: Sichuan Agricultural University, 2016. (in Chinese) |
| [25] |
KOHLSTAEDT L A, WANG J, FRIEDMAN J M, et al. Crystal structure at 3. 5 Å resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor[J]. Science, 1992, 256(5065): 1783-1790. DOI:10.1126/science.1377403 |
| [26] |
MANGENEY M, HEIDMANN T. Tumor cells expressing a retroviral envelope escape immune rejection in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(25): 14920-14925. DOI:10.1073/pnas.95.25.14920 |
| [27] |
APOSTOLIDI E D, PSALLA D, CHASSALEVRIS T, et al. Development of real-time PCR-based methods for the detection of enzootic nasal tumor virus 2 in goats[J]. Arch Virol, 2019, 164(3): 707-716. DOI:10.1007/s00705-018-04138-0 |
(编辑 白永平)