畜牧兽医学报  2024, Vol. 55 Issue (5): 2253-2258. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.05.042    PDF    
引用本文
邓梏男, 张家祺, 保志鹏, 陈涛云, 喻琦胜, 丁露, 朱晨曦, 王怡, 任玉鹏, 贺超, 张斌. 猫疱疹病毒1型的检测及一株分离毒株的致病性[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(5): 2253-2258.  
DENG Gunan, ZHANG Jiaqi, BAO Zhipeng, CHEN Taoyun, YU Qisheng, DING Lu, ZHU Chenxi, WANG Yi, REN Yupeng, HE Chao, ZHANG Bin. Detection of Feline Herpesvirus Type 1 and Pathogenicity of an Isolated Strain[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2024, 55(5): 2253-2258.  
猫疱疹病毒1型的检测及一株分离毒株的致病性
邓梏男1, 张家祺1, 保志鹏4, 陈涛云1, 喻琦胜1, 丁露1, 朱晨曦1, 王怡1, 任玉鹏1,2, 贺超3, 张斌1,2     
1. 西南民族大学畜牧兽医学院，成都 610041;
2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室，成都 610041;
3. 四川省兽药监察所，成都 610041;
4. 云南农业职业技术学院, 昆明 650212
收稿日期：2023-06-15
基金项目：国家农业产业技术体系四川兽药创新团队(SCCXTD-2020-18)；西南民族大学人才支持基金项目(RQD2021004)
作者简介：邓梏男(1996-)，男，四川宜宾人，硕士生，主要从事动物疫病防控研究，E-mail：1181389642@qq.com.
通信作者：张斌，主要从事动物病原分子生物学研究，E-mail：binovy@sina.com; 贺超，主要从事动物疫病防控研究及兽药监察工作，E-mail: 525069528@qq.com.
摘要：旨在调查成都地区的猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1, FHV-1)的流行及遗传变异情况。试验选取2020—2023年从成都地区采集的178份具有呼吸道症状猫的眼、鼻及口咽拭子进行FHV-1核酸检测、gE基因遗传进化分析、FHV-1的分离鉴定和致病性研究。结果发现，成都地区FHV-1阳性率为11.8%(21/178)；其中宠物医院FHV-1阳性率为6.4%(7/110)，猫舍FHV-1阳性率为20.6%(14/68)，表明在猫舍中FHV-1感染率更高。FHV-1 gE基因的遗传进化分析结果表明，本研究扩增出的5株gE基因和疫苗株的核苷酸同源性在99.1%~100%，并发现PX-9株存在3个独特的氨基酸突变位点(L259Q、C294I、W295F)。通过CRFK细胞对5份阳性样本进行病毒的分离培养，结果PX-9毒株被成功分离鉴定。对PX-9毒株进行动物回归试验，结果表明攻毒组猫只表现出眼鼻分泌物增多，打喷嚏等临床症状，在接毒后第4天病毒拷贝数最高，为9.05×107 copies·μL-1，且排毒期较长；攻毒猫只FHV-1病毒载量检测结果显示，气管及肺组织病毒拷贝数分别为1.7×107和3.5×104 copies·μg-1，其它组织核酸阴性。综上表明，在成都地区仍然存在FHV-1流行，并且流行毒株有较强的致病性。
关键词：FHV-1    流行情况    遗传变异    动物回归试验    
Detection of Feline Herpesvirus Type 1 and Pathogenicity of an Isolated Strain
DENG Gunan1, ZHANG Jiaqi1, BAO Zhipeng4, CHEN Taoyun1, YU Qisheng1, DING Lu1, ZHU Chenxi1, WANG Yi1, REN Yupeng1,2, HE Chao3, ZHANG Bin1,2     
1. College of Animal and Veterinary Sciences, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China;
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education/Sichuan Provine, Chengdu 610041, China;
3. Sichuan Provincial Veterinary Drug Supervision Institute, Chengdu 610041, China;
4. Yunnan Vocational and Technical College of Agriculture, Kunming 650212, China
Corresponding author: ZHANG Bin, E-mail: binovy@sina.com; HE Chao, E-mail: 525069528@qq.com.
Abstract: The aim of this study was to investigate the prevalence and genetic diversity of feline herpesvirus-1 (FHV-1) in Chengdu city. From 2020 to 2023, a total of 178 conjunctiva, pharynx and nose swabs were collected from cats with respiratory symptoms in Chengdu city. The collected samples were subjected to FHV-1 PCR detection, gE gene genetic evolutionary analysis, viral isolation and identification, as well as pathogenicity. The results showed that, the FHV-1 positivity rate in Chengdu city was 11.8% (21/178). In which the FHV-1 positivity rate of veterinary hospitals was 6.4% (7/110) and 20.6% (14/68) in catteries, suggested that the higher rate of FHV-1 infection was in catteries. The genetic evolutionary analysis of five FHV-1 gE genes showed that the nucleotide homology was 99.1%~100% to the vaccine strains, and three unique amino acid mutation sites were found in PX-9 strain (L259Q, C294I, W295F). Five positive samples were isolated and cultured by CRFK cell, only PX-9 strain was successfully isolated and identified from CRFK cells. The results of animal regression experiment by PX-9 strain showed that all cats in the infected group exhibited clinical symptoms, such as increased ocular, nasal secretions and sneezing. The highest viral load was found on the 4th day after inoculation (9.05×107 copies·μL-1), and the detoxification period is relatively long. The results of FHV-1 viral load were 1.7×107 and 3.5×104 copies·μg-1 in trachea and lungs of infected group, respectively. The other tissues were negative for FHV-1 DNA. The results of this study indicated that FHV-1 was still prevalent in Chengdu and the prevalent strains had highly pathogenicity.
Key words: FHV-1    prevalence    genetic variation    animal regression experiment    

猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1，FHV-1)是引起猫上呼吸道疾病的主要病原[1]。感染该疾病主要表现为眼鼻分泌物增多、打喷嚏等，呈典型的上呼吸道感染症状；有的患猫还会出现舌和硬腭溃疡、呼吸困难等症状[2]。

FHV-1属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属成员。病毒粒子直径为120~180 nm，呈20面体，由囊膜、核芯、衣壳组成，为线性双链DNA基因组[3]。FHV-1基因组长度约为126~134 kb, G+C含量约为50%，并由独特长区(UL)和独特短区(US)组成。整个基因组编码了多种主要的囊膜糖蛋白以及非结构蛋白，其中gE基因位于US区，属于结构蛋白，通常被认为是辅助蛋白，但是在自然感染中也是必不可少的[4]。在以前的研究中，FHV-1 gE基因和毒力相关，强弱毒株之间存在gE基因的差异，缺失gE基因会导致FHV-1的病毒毒力降低，但保持有良好的免疫原性[5]。另有研究证据表明，FHV-1 gE基因具有影响组织趋向、趋化病毒向组织转移的特性[6]。

本研究采集成都地区部分宠物医院及猫舍中具有呼吸道症状猫的眼、鼻及口腔拭子，分析成都地区FHV-1的流行及gE基因的遗传变异情况；对分离出的FHV-1毒株进行动物回归试验，以期丰富FHV-1的流行病学资料，为防控FHV-1提供有力支持。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样本采集 　　2020—2023年从成都地区宠物医院以及猫舍采集具有呼吸道症状(咳嗽、流鼻涕)猫的眼、鼻及口腔拭子样本，记录猫的采样来源、年龄等信息。

1.1.2 细胞与试验动物 　　猫肾细胞(crandell reese feline kidney，CRFK)为本实验室保存；试验动物为6只8~12周龄田园猫(FHV、FPV、FCV病毒核酸均为阴性)。

1.1.3 主要试剂与仪器 　　Quick Taq Hs DyeMix购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；STE缓冲液、蛋白激酶K、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa生物技术有限公司；E. coli DH5α购自北京天根生化科技有限公司；PCR核酸扩增仪购自杭州博日科技有限公司；电泳仪、紫外凝胶成像分析仪购自上海天能有限公司。

1.1.4 引物 　　参考文献[3]及GenBank中FHV-1 gE基因序列设计引物对其进行扩增(登录号：MH070347.1、MH070347.1)，引物序列信息见表 1。

表 1 引物序列信息 Table 1 Primer sequence information
1.2 方法

1.2.1 FHV-1检测及gE基因的扩增 　　采用酚-氯仿法提取猫样本总DNA，使用表 1中的引物对样本的FHV-1进行检测和gE基因的扩增。

1.2.2 FHV-1 gE基因遗传进化分析 　　将本研究获得的FHV-1 gE基因全长序列与GenBank中已发表的FHV-1 gE基因利用MEGA7.0序列分析软件，采用邻近法(Bootstrap自举值选择1 000次)构建系统遗传发育树。

1.2.3 FHV-1分离培养及纯化鉴定 　　将阳性样本接种于CRFK细胞，每日观察细胞病变情况，盲传三代后利用特异性引物进行PCR检测；鉴定正确后采用空斑纯化方法进行纯化，并根据Reed-Muench法计算TCID50；同时使用本实验室保存的兔源FHV-1阳性血清作为一抗进行间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。

1.2.4 FHV-1动物回归试验 　　将6只8~12周龄的中华田园猫随机分为2组，每组3只，对攻毒组进行滴鼻500 μL分离纯化毒株病毒液(107.2 TCID50 ·mL－1)，对照组接种等量的生理盐水，隔天采集眼、鼻、口腔拭子保存，攻毒后第9天将对照组猫只安乐死，采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法[7]检测内脏组织中FHV-1的分布并计算病毒拷贝数，同时运用GraphPad Prism软件进行分析，P＜0.05或＜0.01，则认为数值差异具有统计学显著性或高度显著性。

2 结果 2.1 PCR检测结果与分析

对178份成都地区猫的眼、鼻及口腔拭子进行病毒核酸检测，结果共检测出21份FHV-1阳性，阳性率为11.8%(CI=7.5%~17.5%)；宠物医院中的阳性率为6.4%(CI=2.6%~12.7%)；猫舍中的阳性率为20.6%(CI=11.7%~32.1%)；幼龄猫(≤6月龄)阳性率为22.2%(CI=10.0%~39.2%)，成年猫(＞6月龄)阳性率为11.7%(CI=4.4%~23.9%)；结果显示FHV-1的感染情况在采样地点间具有显著差异(P=0.004)，年龄间没有显著差异(P=0.195)，表明FHV-1在猫舍等猫群聚集的地方传播性较强，并且FHV-1在成年猫和幼年猫中都会造成感染。

2.2 FHV-1 gE基因的遗传进化及同源性分析

本文所分离的5株FHV-1 gE基因全长序列(登录号：OR105893-OR105897)大小为1 599 bp，经过序列比对及系统进化树结果表明其中1株(下文命名为PX-9)gE基因与疫苗株Companion(GenBank No.KR381803)相比，存在L259Q、C294I和W295F氨基酸位点突变。5株分离株均处于同一分支，其gE基因核苷酸同源性为99.7%~100%，与疫苗株Companion同源性为99.1%~100%。(图 1A)。

A. 基于FHV gE序列利用邻近法构建的遗传进化树：▲. 本研究毒株；B. PX-9毒株空斑纯化结晶紫染色观察；C. 正常CRFK细胞，标尺大小：200 μm；D. CRFK细胞病变，标尺大小：200 μm；E. 纯化后病毒液PCR鉴定: M. Marker; 1.纯化病毒液；2.阳性对照；3.阴性对照。F. PX-9分离株的IFA鉴定结果，标尺大小：100 μm A. Phylogenetic tree based on FHV gE sequences constructed using the neighbor-joining (NJ) method: ▲. Strains in the current study; B. purification of empty spots of PX-9 strain by crystal violet staining; C. Normal CRFK cells, Scale size: 200 μm; D. Lesions of CRFK, Scale size: 200 μm; E.PCR identification of purified virus liquid: M.Marker; 1.Purified virus solution; 2.Positive control; 3.Negative control. F. IFA identification results of PX-9 isolates, scale size: 100 μm 图 1 基于FHV gE序列利用邻近法构建的遗传进化树及PX-9毒株分离鉴定 Fig. 1 Phylogenetic tree based on FHV gE sequences constructed using the neighbor-joining (NJ) method and the isolation and characterization of PX-9 strain
2.3 FHV-1的分离培养和鉴定

接种眼、鼻、口腔拭子处理液的CRFK细胞在24 h左右出现细胞聚集、圆缩，成“葡萄串样”，正常细胞无病变情况，对其空斑纯化后进行PCR检测，结果有单一的目的条带，IFA结果表明感染FHV-1的CRFK细胞有特异性荧光绿，对照则无(图 1B~图 1F)，表明该病毒为FHV-1，并命名为PX-9毒株；采用Reed-Muench法计算其TCID50为107.2 TCID50 ·mL-1。

2.4 FHV-1致病性试验

攻毒组猫在第3天开始出现打喷嚏、分泌脓性鼻液(图 2A)等症状；第9天将对照组猫安乐死后观察内脏组织病变情况。结果显示，攻毒组猫肺出现明显的淤血现象，伴随出血斑点，对照组猫肺则无病变现象(图 2B~2C)。荧光定量PCR检测结果显示，在攻毒组猫的气管和肺检出核酸阳性，其病毒拷贝数分别为1.7×107和3.5×104 copies ·μg－1；经过GraphPad Prism软件分析，气管的病毒载量极显著高于肺组织的病毒载量(P＜0.000 1, 图 2D)，口、鼻、眼拭子样品经检测，第4天攻毒组猫只的平均病毒载量极显著高于第2、6和8天攻毒组猫只(P＜0.000 1、P=0.000 2、P＜0.000 1)，第4天病毒载量最高，为9.05×107 copies ·μL－1(图 2E)。

A. 攻毒第3天临床观察结果；B. 攻毒组肺观察结果；C. 对照肺观察结果；D. 各组织平均病毒载量；E. 攻毒猫拭子样品病毒载量。***表明在统计学上具有显著性；****表明在统计学上具有高度显著性 A. Clinical observation results on the third day after infection; B. Results of lungs observation in attack group; C. Results of lungs observation in the control group; D. Mean viral load results of each tissue; E. Viral load of swab samples in the infected group. *** indicates statistically significant; **** indicates highly statistically significant 图 2 临床症状及内脏组织病变观察及攻毒组猫组织及拭子样品病毒载量情况 Fig. 2 Clinical symptoms, visceral tissue lesions and viral load of cat tissue and swab samples in the infected group
3 讨论

FHV-1是在美国由Crandell和Maurer从患有呼吸道疾病的幼猫中首次分离出来，国内则是在2010年首次分离出FHV-1[8]。FHV-1作为引起猫呼吸道疾病的主要传染病原之一，严重威胁着猫的健康，并且猫在隐性感染时和感染康复后都会长期排毒，成为一个潜在的传染源[9]，且有研究表明，猫在免疫力下降的时候容易造成二次感染[10]。

全球FHV-1的阳性率在7%~63%之间，感染差异较大[11-16]，在我国FHV-1的阳性率为16.3%[17]，本研究中，成都地区FHV-1的阳性率仅为11.8%，相比我国华东部分地区的阳性率较低(57.8%)[18]，但是高于我国华南部分地区FHV-1的阳性率(9.8%)[19]；本研究发现，猫舍的FHV-1阳性率相比宠物医院高，分析由于在宠物医院的采样群体中，较多进行疫苗注射，具有抗体保护，并且宠物猫的生活环境大多为独居环境，感染的几率较低；而猫舍的猫生活环境多为群居生活，当健康猫在接触到被FHV-1污染的饲料、水源、用具及在相互接触的同时容易被感染[20]，因此检测出的阳性率较高。

本研究通过CRFK病毒分离及空斑纯化，成功分离出1株能稳定传代的FHV-1毒株，命名为PX-9。该毒株与疫苗株Companion相比有3个氨基酸位点的突变，通过动物回归试验表明，感染该毒株的猫会出现打喷嚏、眼鼻分泌物增多等情况，这与黄明[21]报道相符合；同时具有较长时间的排毒期[22]，此外PX-9毒株会在呼吸道造成感染，并且具有较强的致病性，可用于当下疫苗保护效果评价以及开发新疫苗提供备选毒株。

4 结论

本研究调查了2020—2023年成都地区FHV-1的流行率，分析了FHV-1 gE基因的遗传变异情况，并且成功分离出1株FHV-1毒株，命名为PX-9，进行动物回归试验发现PX-9毒株会造成严重的呼吸道感染。

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(编辑   范子娟)