2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室, 成都 610041
, TIAN Xinyuan1, LIAO Wensheng1, ZHANG Huanrong1, REN Yupeng1, YANG Falong1, ZHU Jiangjiang2
, XIANG Hua1
2. Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 610041, China
细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)是一类由细胞产生并反馈性阻断细胞因子信号转导过程的免疫调控因子[1]。SOCS家族作为炎症因子转导的负反馈调节因子，可通过抑制炎症相关信号通路的核转录因子(NF-κB)和丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的过度激活而发挥作用，调节促炎细胞因子的过量释放，进而抑制炎症反应[2-3]。
同时，SOCS蛋白对先天性免疫和适应性免疫起着重要的生理调节作用[4]。SOCS2作为SOCS家族中的成员，该基因在部分动物中，可参与调节多种细胞因子依赖的信号转导转录激活蛋白(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)的信号通路[5]；进而调控机体的生理和病理过程，包括细胞凋亡[6]、细胞增殖[7]、细胞周期[8]、肿瘤[9]和炎症反应[10]等。在代谢方面，研究发现在脂肪肝组织和正常肝组织中，SOCS2的表达模式存在差异[11]。在猪脂肪原代细胞中过表达SOCS2基因能够抑制生长激素(growth hormone，GH)诱导的脂解作用[12]。在肿瘤方面，大量的研究表明，SOCS2基因的表达水平变化与肿瘤的发生有显著相关性[13-14]。在肝癌患者中发现其癌组织中SOCS2表达水平显著下降，且SOCS2基因表达下降的肝癌患者的无病生存期显著缩短，前列腺癌患者组织中SOCS2表达水平显著上调[15]。而且，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)外泌体可以通过SOCS2和JAK3/STAT761信号通路激活成纤维细胞(fibroblasts，NFs)，从而影响肿瘤微环境[16]。在免疫方面，有研究发现SOCS2基因可调节肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)等炎性细胞因子的水平，说明SOCS2有可能与炎症反应和炎性因子转录有关，从而减少炎性细胞的数目[17]。
同时，SOCS被认为是STATs的靶基因，可以直接作用于JAK/STAT信号通路抑制STATs活化，进而影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程[18-19]。解云菲[20]研究发现，SOCS3可以通过调控STAT3蛋白磷酸化激活JAK2/STAT3通路，进而调节该通路下游凋亡相关基因的表达，最终抑制TNF-α诱导的前体脂肪细胞凋亡。Duan等[21]研究发现，毛花苷C(lanatoside C)可通过调控JAK2/STAT6/SOCS2信号通路，降低线粒体膜电位来触发细胞凋亡，诱导人宫颈癌细胞周期停滞在S期和G2/M期。SOCS2是STAT5a、STAT5b下游靶基因，在催乳素作用下，SOCS2表达显著升高，继而调节牛乳腺细胞的增殖与泌乳[22]。SOCS2还可以抑制巨噬细胞内NF-κB信号通路激活，从而抑制细胞凋亡[23]。然而，对于SOCS2调控细胞周期及凋亡方面的具体机制尚不清楚，目前，尚无山羊SOCS2基因序列以及其对细胞周期和凋亡调控作用的研究报道。本研究选用简州大耳山羊作为材料，采用RT-PCR技术对山羊SOCS2的基因序列进行了克隆和序列分析；在构建pcDNA3.1-SOCS2真核表达载体的基础上，将其转染山羊鼻甲骨细胞，研究SOCS2对细胞周期、凋亡、增殖以及周期和凋亡相关基因的影响；同时干扰SOCS2的表达，探究其对细胞周期、凋亡、增殖及周期和凋亡相关基因表达的影响，为进一步全面揭示SOCS2功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 样本采集、总RNA提取及细胞本试验在2022年于西南民族大学完成。6只1周岁健康简州大耳山羊购于四川简阳大哥大牧业有限公司。将山羊空腹屠宰后，采集每只山羊心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、大肠和小肠组织8个组织样本，然后用无菌DEPC水冲洗干净，用锡箔纸包好后快速放入液氮保存待用。采用Trizol法进行组织和山羊鼻甲骨细胞总RNA的提取，质量检测合格后将其反转录为cDNA。山羊鼻甲骨细胞由西南民族大学动物医学实验室保存。pcDNA3.1(+)真核表达载体由西南民族大学青藏高原研究院惠赠。
1.2 主要仪器与试剂多功能免染蛋白印记系统购自日本Cytiva公司；高速离心机5804购自Eppendorf公司；PCR仪、CO2恒温培养箱购自ThermoFisher Scientific公司；凝胶成像仪、半干转移电泳槽购自Tanon公司；荧光倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司。
BamHⅠ限制性内切酶、T4连接酶、Premix TaqTM、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、XbaⅠ限制性内切酶购自TaKaRa公司；PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自北京索莱宝公司；Trizol、LipoGeneTM 3000转染试剂购自ThermoFisher Science公司产品；胎牛血清(FBS)购自北京全式金公司；细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI Kit凋亡检测试剂盒购自北京四正柏生物公司；ECL化学发光底物购自美国Millipore公司；鼠anti-Flag单抗(sc-166355)、HRP标记山羊抗鼠IgG购自Abmart公司；DMEM培养基购自Gibco公司。
1.3 试验方法1.3.1 山羊SOCS2基因克隆及序列分析 根据GenBank中山羊SOCS2基因预测序列(XM_027967202.1)设计克隆山羊SOCS2的特异性引物(表 1)。以山羊肝组织cDNA为SOCS2基因PCR扩增模板，并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测。检测无误后胶回收，产物与pMD19-T Simple载体连接后转化，阳性菌落PCR检测和测序确定无误后，将重组质粒命名为pMD19-SOCS2。参考王宪军等[24]方法对山羊SOCS2基因进行序列分析。
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表 1 引物信息 Table 1 Primers information |
1.3.2 真核表达载体pcDNA3.1-SOCS2构建及siRNA的合成 以SOCS2的CDS区序列为基础设计亚克隆引物，序列见表 1。上、下游引物划线部分分别为BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点，斜体部分为Kozak序列，划线加粗部分为Flag标签。使用BamHⅠ和XbaⅠ酶对载体pcDNA3.1(+)和亚克隆获得的SOCS2的CDS区序列进行双酶切，随后用T4连接酶对回收纯化产物进行连接转化，经测序验证正确后的真核表达载体命名为pcDNA3.1-SOCS2。使用BamH Ⅰ和XbaⅠ酶对pcDNA3.1-SOCS2质粒进行双酶切鉴定。将“ 1.3.1 ”克隆获得的SOCS2基因的CDS区序列送上海吉玛基因股份有限公司合成2条siRNA干扰片段和一条阴性对照序列(表 2)。
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表 2 siRNA序列 Table 2 siRNA oligo |
1.3.3 山羊SOCS2基因的组织表达差异检测 以“1.1”中反转录的cDNA为模板，表 1中SOCS2基因克隆引物采用RT-qPCR检测SOCS2基因在不同组织中的表达差异。以泛素表达转录因子(ubiquitously-expressed transcript，UXT)基因作为内参基因，序列见表 1。每个待测样本设置3次生物学重复。
1.3.4 山羊鼻甲骨细胞的复苏培养和转染 本试验所用鼻甲骨细胞为实验室前期分离和纯化获得[25]。复苏实验室冻存的鼻甲骨细胞，即细胞接种于含体积分数为15% FBS和1% 双抗的DMEM培养基中进行培养。待第6代细胞生长到70%~80%时，根据LipofectamineTM3000转染试剂说明书进行转染，操作程序参考文献[26]。山羊SOCS2过表达组设置pcDNA3.1-SOCS2组和pcDNA3.1(+)阴性对照组。山羊SOCS2干扰组设置SOCS2-siRNA1、SOCS2-siRNA2和阴性对照组(Negative control，NC)。转染48 h后，提取细胞的总RNA并反转录为cDNA，RT-qPCR技术检测SOCS2基因的mRNA表达水平，筛选出有效的siRNA干扰片段。每组试验设置生物学重复3次。
1.3.5 检测SOCS2蛋白在山羊鼻甲骨细胞中的表达 按照“1.3.4”方式进行山羊SOCS2过表达组的转染，转染48 h后，收集蛋白样品。经SDS-PAGE电泳后，转入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上并进行封闭过夜。随后分别添加鼠源Flag单克隆抗体和兔源β-Actin，4 ℃孵育过夜。然后再分别添加HRP标记的山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG，室温摇床孵育2 h，最后使用ECL试剂显色，成像。
1.3.6 SOCS2对山羊鼻甲骨细胞增殖的影响 参照“1.3.4”方式进行转染，待96孔培养板内细胞生长至70%~80%时，将真核表达载体pcDNA3.1-SOCS2和pcDNA3.1(+)分别转染细胞，分别培养24、48、72和96 h。按照MTT试剂说明书测定不同时间段562 nm波长处各孔光吸收OD值并绘制细胞生长曲线。同样，将干扰效率70%以上的干扰片段和阴性对照组分别转染细胞，培养24、48、72和96 h，按照类似的步骤检测干扰SOCS2表达后对细胞增殖的影响。每组设置5个重复，试验重复3次。
1.3.7 SOCS2对山羊鼻甲骨细胞周期及周期相关基因表达的影响 参照“1.3.4”方式进行转染，待12孔培养板内细胞生长至70%~80% 时，将真核表达载体pcDNA3.1-SOCS2和pcDNA3.1(+)分别转染细胞，转染48 h后，按细胞周期检测试剂盒操作步骤收样，流式细胞仪检测SOCS2过表达对细胞周期的影响。同样，将干扰效率70%以上的干扰片段和阴性对照组分别转染细胞，转染48 h后，按照类似的步骤检测干扰SOCS2表达后对细胞周期的影响。同时以UXT作为内参基因，参照王宪军等[27]设计的检测细胞周期相关基因表达的引物(表 1)，采用RT-qPCR测定SOCS2对细胞周期相关基因mRNA表达水平的影响。每组设3个重复孔，试验重复3次。
1.3.8 SOCS2对山羊鼻甲骨细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响 参考“1.3.4”方式进行转染。转染48 h后，根据细胞凋亡检测试剂盒说明书收样，使用流式细胞仪分别检测SOCS2过表达和干扰对细胞凋亡的影响。同时，参照但一昕等[28]设计的检测细胞凋亡相关基因的引物(表 1)。以UXT作为内参基因，采用RT-qPCR测定SOCS2过表达和干扰对细胞凋亡有关基因mRNA表达水平的影响。每组设3个重复孔，试验重复3次。
1.3.9 数据统计与分析 以UXT为内参基因，采用2-ΔΔCt方法对实时荧光定量数据进行分析。使用SPSS20.0软件对试验数据进行单因素方差分析，P＜0.01为差异极显著，P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。
2 结果 2.1 山羊SOCS2基因CDS区的克隆及序列分析胶回收产物克隆转化后，经测序得到SOCS2基因序列长度为1 065 bp，其中，CDS区长597 bp，共编码198个氨基酸(图 1A)。SOCS2蛋白分子式为C990H1562N270O297S8，分子质量为22.258 475 ku，为亲水蛋白(图 1B)，主要分布在核内，不存在信号肽(图 1C)，无跨膜区(图 2A)。SOCS2共有24个磷酸化位点，包括10个苏氨酸(Thr)、10个丝氨酸(Ser)、4个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点(图 2B)。提交NCBI数据库得到山羊SOCS2基因的GenBank登录号为MZ_055377。SOCS2二级结构预测发现α螺旋、无规则卷曲和延伸链分别占27.78%、52.02%和18.69%(图 2C)，SOCS2的三级结构如图 2D。从STRING数据库检索到与SOCS2蛋白可能存在互作的蛋白包括JAK1、JAK2、STAT5A、STAT5B、SOCS1、LCK、GHR、CUL5、TCEB1、TCEB2(图 2E)。系统进化树显示，山羊SOCS2基因与绵羊亲缘关系最近，然后是牦牛、牛、猪、人、马、小鼠，亲缘关系最远的是大鼠(图 2F)。
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A.山羊SOCS2基因的克隆扩增(M. 2000 bp DNA相对分子质量标准；1~3. 目的基因；N. 阴性对照)B. SOCS2蛋白质疏水结构预测；C. SOCS2蛋白信号肽预测 A. Clonal amplification of the SOCS2 gene in goats (M. 2000 bp DNA relative molecular mass standard; 1-3. The target genes; N. Negative control); B. Prediction of hydrophobic structure of SOCS2 protein; C. Prediction of SOCS2 protein signal peptide 图 1 山羊SOCS2基因克隆及SOCS2蛋白生物信息学分析 Fig. 1 Cloning of SOCS2 prediction of SOCS2 protein domain in goat |
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A.SOCS2蛋白跨膜结构预测；B.SOCS2蛋白磷酸化位点预测；C.山羊SOCS2蛋白二级结构预测；D.山羊SOCS2蛋白三级结构预测；E.山羊SOCS2蛋白与其他蛋白相互作用网络；F.不同物种间SOCS2蛋白的系统进化树 A. Prediction of the transmembrane structure of SOCS2 protein; B. Prediction of phosphorylation site of SOCS2 protein; C. Secondary structure prediction of SOCS2 protein in goats; D. The interaction network of goat SOCS2 with other proteins; E. Goat SOCS2 protein interacts with other proteins; F. Phylogenetic tree of SOCS2 protein among different species 图 2 不同品种山羊SOCS2蛋白功能和氨基酸序列的预测 Fig. 2 Prediction results of SOCS2 protein function and amino acid sequence of different species in goats |
由图 3可知，在山羊的心、脾、肝、肾、肺、瘤胃、大肠和小肠8个组织样本以及鼻甲骨细胞中都能检测到SOCS2基因的mRNA表达，然而肝中的SOCS2基因mRNA表达水平显著高于其他组织，其次是大肠，最低的是脾和瘤胃。
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不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；相同字母表示差异不显著(P>0.05) Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); identical letters indicate insignificant differences (P>0.05) 图 3 山羊SOCS2基因的组织表达谱 Fig. 3 Tissue expression profile of SOCS2 gene in goats |
对纯化后的质粒pcDNA3.1-SOCS2进行BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，得到5 400和600 bp左右长度片段(图 4A)。测序结果与预期相同，表明真核表达载体构建成功。
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A. 真核表达载体pcDNA3.1(+)-SOCS2双酶切鉴定[M. 8000 bp DNA相对分子质量标准；1. pcDNA3.1-SOCS2; 2. pcDNA3.1(+)]；B.SOCS2在山羊鼻甲骨细胞内的表达；C. 不同siRNA感染效果检测。*. P<0.05, **. P<0.01 A. Double digestion of eukaryotic expression vector pcDNA3.1-SOCS2 (M. 8000 bp DNA relative molecular Mass standard; 1. pcDNA3.1-SOCS2; 2. pcDNA3.1(+)); B. The expression of SOCS2 in goat turbinate bone cells; C.Detection of different siRNA infection effects.*. P<0.05, **. P<0.01 图 4 真核表达载体pcDNA3.1-SOCS2双酶切鉴定以及SOCS2的过表达和干扰效率检测 Fig. 4 Double enzyme digestion identification of eukaryotic expression vector pcDNA3.1-SOCS2 and detection of overexpression and interference efficiency of SOCS2 |
以β-Actin为内参基因，Western blot检测结果显示，转染了pcDNA3.1-SOCS2重组质粒的细胞中检测到了标签蛋白Flag的表达(22.258 475 ku)，而转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞内无Flag蛋白的表达，表明SOCS2在鼻甲骨细胞内成功表达，可用于该蛋白的功能研究(图 4B)。RT-qPCR检测结果显示，干扰SOCS2(SOCS2-siRNA 1和SOCS2-siRNA 2)后其相对表达量均显著低于对照组，其中SOCS2-siRNA2干扰效果最好，可降低SOCS2基因mRNA表达水平达70%，达到了极显著水平(P<0.01) (图 4C)，可作为后续试验材料。
2.5 SOCS2对山羊鼻甲骨细胞增殖的影响试验结果见图 5。与对照细胞组相比，转染pcDNA3.1-SOCS2组山羊鼻甲骨细胞增殖受到了一定程度的抑制(P<0.05)，但是随着时间的延长，其抑制作用减弱。相反，转染SOCS2-siRNA2促进了山羊鼻甲骨细胞增殖(P<0.05)，且随着时间的延长，其促进作用减弱。
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A.转染pcDNA3.1-SOCS2质粒对鼻甲骨细胞增殖的影响；B.转染SOCS2-siRNA2对鼻甲骨细胞增殖的影响。*. P<0.05, **. P<0.01 A. Effects of proliferation of turbinate osteocytes transfected with pcDNA3.1-SOCS2 plasmids; B. Effect of transfection of SOCS2-siRNA2 on proliferation of turbinate osteocytes.*. P<0.05, **. P<0.01 图 5 SOCS2对山羊鼻甲骨细胞增殖的影响 Fig. 5 Effect of SOCS2 on the proliferation of turbinate bone cells in goats |
与空载体pcDNA3.1(+)(41.73%±0.40%)相比，转染pcDNA3.1-SOCS2组G0/G1期细胞数(28.54%±0.22%)极显著降低；而与空载体(48.27%±0.31%)相比较，pcDNA3.1-SOCS2组的G2/M+S期占比约为(61.46%±0.50%)，细胞数上升极显著(图 6 A)。与阴性对照组(93.61%±0.25%)相比较，转染SOCS2-siRNA2组的G0/G1期细胞数(105.36%±0.14%)显著增加；而与阴性对照组(10.96%±0.58%)相比较，SOCS2-siRNA2组G2/M+S期细胞占比约为(4.63%±0.15%)，细胞数减少极显著(图 6 B)。可见，SOCS2可以将细胞阻滞于G2/M+S期。周期相关基因的检测结果显示，与pcDNA3.1(+)空载体组相比，pcDNA3.1-SOCS2转染组CDK2和p21基因的mRNA表达水平下调(P<0.01)(图 6 C)。而与阴性对照组相比，干扰SOCS2表达可上调CDK2和p21基因的mRNA表达(P<0.01)(图 6 D)。
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A. SOCS2过表达对鼻甲骨细胞的细胞周期的影响；B.干扰SOCS2对鼻甲骨细胞细胞周期的影响C. SOCS2过表达对鼻甲骨细胞细胞周期相关基因表达影响；D.干扰SOCS2对鼻甲骨细胞细胞周期相关基因表达影响。*. P<0.05, **. P<0.01 A. Effects of SOCS2 overexpression on cell cycle of turbinate bone cells; B. Interference with the effect of SOCS2 on the cycle of turbinate osteocytes; C. Effects of SOCS2 overexpression on cycle related gene expression in turbinate osteocytes; D. Interference with SOCS2 on cycle related gene expression in turbinate osteocytes.*. P<0.05, **. P<0.01 图 6 过表达或干扰SOCS2对鼻甲骨细胞周期及周期相关基因表达的的影响 Fig. 6 Overexpression or interference with SOCS2 detection of the turbinate bone cells cycle and cycle-related genes |
结果显示，转染空载体pcDNA3.1(+)组的细胞早期凋亡率为9.89%±0.09%、晚期凋亡率为3.90%±0.20%；pcDNA3.1-SOCS2转染组细胞的早期凋亡率为33.77%±0.12%、晚期凋亡率24.34%±0.11%。转染Negative Control片段组细胞的早期凋亡率为4.34%±0.11%、晚期凋亡率1.62%±0.07%；SOCS2-siRNA2转染组细胞的早期凋亡率为2.24%±0.04%，晚期凋亡率为0.68%± 0.06%。可见，SOCS2促进了山羊鼻甲骨细胞的凋亡作用(图 7)。细胞凋亡相关基因检测结果显示，与空载体pcDNA3.1(+)组相比，SOCS2过表达可极显著上调细胞内促凋亡基因Caspase3、Caspase7、Bax、p53、BCL2L11和抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达(P<0.01)，但对PARP1无显著作用。敲低SOCS2基因表达可极显著下调Caspase3、Bax mRNA水平(P<0.01)，显著下调p53和PARP1水平(P<0.05)，对Caspase7、BCL2L11、Bcl-2 mRNA表达无显著影响(图 8)。
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A.转染pcDNA3.1-SOCS2的山羊鼻甲骨细胞凋亡检测；B.转染pcDNA3.1(+)的山羊鼻甲骨细胞凋亡检测；C.转染SOCS2-siRNA2的山羊鼻甲骨细胞凋亡检测；D.转染对照siRNA的山羊鼻甲骨细胞凋亡检测；E.SOCS2过表达对山羊鼻甲骨细胞凋亡影响的统计结果；F.干扰SOCS2表达对山羊鼻甲骨细胞凋亡影响的统计结果。*. P<0.05, **. P<0.01 A. Goat turbinate bone cell apoptosis assay group transfected with pcDNA3.1-SOCS2; B. Apoptosis assay in goat turbinate osteocytes transfected with pcDNA3.1(+).; C. Apoptosis assay of goat turbinate bone cells transfected with SOCS2-siRNA2; D. Apoptosis assay of goat turbinate bone cells transfected with control siRNA; E. Statistical results of the effect of SOCS2 overexpression on apoptosis of goat turbinate bone cells; F. Statistical results of interfering with the effect of SOCS2 expression on apoptosis of goat turbinate osteocytes.*. P<0.05, **. P<0.01 图 7 过表达或干扰SOCS2表达对鼻甲骨细胞凋亡的检测 Fig. 7 Overexpression or interference of SOCS2 expression on turbinate cell apoptosis detection |
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A.SOCS2过表达对鼻甲骨细胞凋亡相关蛋白基因表达影响的检测；B.干扰SOCS2表达对鼻甲骨细胞凋亡相关蛋白基因表达影响的检测。*. P<0.05, **. P<0.01 A.Detection of the effect of SOCS2 overexpression on protein genes associated with nasal turbinate bone cells apoptosis; B. The effect of SOCS2 interference on turbinate bone cells apoptosis related protein gene detection.*. P<0.05, **. P<0.01 图 8 过表达或干扰SOCS2表达对鼻甲骨细胞凋亡相关基因表达影响检测 Fig. 8 Effect of overexpression or interference with SOCS2 expression on the expression of genes associated with apoptosis in turbinate bone cells |
目前，关于SOCS2功能的研究主要集中于人[29]、牛[30]、鼠[31]等，但尚未有关SOCS2基因功能的研究报道。同时，山羊鼻甲骨原代细胞常被用于山羊宿主细胞蛋白功能研究以及羊口疮病毒的增殖和致病机制研究的理想细胞类型之一[25, 32-33]。本研究的对象为简州大耳山羊，通过克隆得到山羊SOCS2基因序列，总长为1 065 bp，CDS区长为597 bp，编码198个氨基酸。生物信息学分析显示，SOCS2蛋白无跨膜结构域且不存在信号肽结构，二级结构中以无规则卷曲最多，其次是α螺旋，推测SOCS2蛋白为非分泌型Mixed样蛋白且该蛋白可能不在生物膜上行使功能。JAK2、STAT5A、STAT5B、SOCS1等蛋白常被报道参与细胞增殖、凋亡及机体炎症反应等。如，马涛等[34]研究发现，阿曼托双黄酮(amentoflavone，AF)可通过抑制SW579细胞中JAK2-STAT3通路活化及其下游基因的表达进而抑制SW579细胞的增殖同时促进细胞凋亡。施姮和舒芳芳[35]研究发现，干扰SOCS1基因的表达后，连翘苷的作用被抑制，促进了肺泡上皮细胞的凋亡、周期和氧化应激。Xiao等[36]研究发现，过表达RNF7后可以通过泛素化SOCS1激活JAK/STAT3信号通路，从而抑制肾癌细胞的凋亡。结合本研究互作蛋白的预测结果，推断SOCS2蛋白与这几种互作蛋白可能存在联系，从而一起调控细胞的凋亡和增殖。
细胞周期的运转受到许多不同种类的蛋白质、复合物以及细胞周期检测点等复杂物质的参与，这些物质之间相互影响、相互作用，共同协调和控制着细胞周期的运转，以确保细胞能够正常地分化、生长和凋亡[37]。有研究发现，当细胞的DNA受到损害时，细胞会利用其周期蛋白协同调控细胞周期进程，以便将细胞周期阻滞在某个特定的阶段，从而为DNA修复损伤提供充足的时间[38]。同时，当细胞DNA受到轻微损伤时，细胞更容易停滞在G0/G1期，相反则容易停滞在G2/M期，从而有助于细胞的生存[39]。本研究结果显示，过表达SOCS2后可将细胞周期阻滞于G2/M+S期，同时下调p21 mRNA表达抑制细胞的增殖，而干扰SOCS2表达后的结果相反。由此推测这种现象的发生可能是，当SOCS2表达发生变化时影响细胞的增殖以及CDK和p21基因的表达，从而调控细胞周期进程，为DNA的损伤修复赢取时间。这相比彭胜建等[40]的研究，更进一步的研究了增殖与周期之间的关系。除此之外，细胞周期进程还受细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)、p21、内源性CDK抑制剂(cycin-dependent kinase inhibitors，CK)的影响[41-43]。细胞周期蛋白K(cyclin K，CCNK)作为细胞周期蛋白家族成员之一，可以调节前复合体的组装，且表达量与细胞增殖呈正相关[44]。在本研究中，SOCS2过表达后可抑制细胞的增殖，且下调CDK的mRNA表达，此结果与上述报道一致。作者从干扰SOCS2表达后对细胞的影响再次证实上述结果。
在细胞凋亡信号传递过程中，有多种不同的信号传递系统参与其中，这些系统会触发细胞凋亡程序，其中包括Bcl-2、Casepases、P53、BCL2L11和PARP1等多种蛋白的调节[45-46]。这些蛋白中Bcl-2家族(Bcl-2，BCL2L11)又在细胞凋亡过程中发挥着关键性的作用，它可以通过降低线粒体释放的细胞色素C来调控细胞凋亡的过程[47]。本研究结果显示，过表达SOCS2后可促进山羊鼻甲骨细胞的凋亡并上调细胞内促凋亡基因Caspase3、Caspase7、Bax、p53、BCL2L11 mRNA的表达。同时，参考Hirunagi等[48]的方法，设计、筛选到有效的干扰片段SOCS2-siRNA2，并将其转染细胞，发现干扰SOCS2表达后可抑制细胞凋亡并且下调Caspase3、Bax、p53和PARP1 mRNA水平。进而从相反方向证实了SOCS2的功能，这与Li等[23]、Shi等[49]报道的结果相符合。已有研究显示，Bcl-2/Bax的比值被认为是调节细胞凋亡的开关，对细胞的存活有很大影响，其比值下降预示细胞凋亡增加，其比值上升预示细胞凋亡减少[50]。干扰SOCS2表达后，Bcl-2虽未有明显变化，但Bcl-2/Bax比值显著上升，表明细胞凋亡被抑制了。同时，在试验中发现，过表达SOCS2基因后，Bcl-2/Bax比值同样也出现了上升现象，作者推测在SOCS2基因调控的细胞凋亡信号通路中，可能还存在其他因子共同参与调控Bcl-2、Bax基因的表达。本研究发现，SOCS2过表达可上调细胞内促凋亡基因Caspase7、BCL2L11 mRNA表达，PARP1无显著变化；而干扰SOCS2表达可下调PARP1水平，Caspase7、BCL2L11无显著变化。据此可以推断PARP1、Caspase7和Bcl-2家族在表达上可能存在一定的相互作用，但具体作用尚不清楚，有待进一步研究。
4 结论山羊SOCS2基因总长1 065 bp其CDS区长597 bp，从ATG开始，到TAA结束，共编码198个氨基酸残基，与绵羊的SOCS2基因同源性最近，与大鼠小鼠同源性最远，SOCS2在山羊肝中表达最高，脾中表达最低。SOCS2可显著促进山羊鼻甲骨细胞凋亡，抑制增殖，增加G2/M期和S期细胞数量。这些结果为进一步探究山羊SOCS2功能奠定了基础。
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(编辑 白永平)