2. 江苏省农业科学院兽医研究所, 南京 210014;
3. 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心, 泰州 225327;
4. 怀化职业技术学院动物科技学院, 怀化 418099;
5. 南京农业大学动物医学院, 南京 210095;
6. 江苏省农业科学院动物免疫工程研究所, 南京 210014;
7. 湖南医药学院医学人文与信息管理学院, 怀化 418000
, YIN Ruiru2,3,5, XIE Xing2,3,5, WANG Haiyan3,6, LIU Hudong7, HU Hui4, XIONG Qiyan2,3,5, FENG Zhixin2,3,5, SHAO Guoqing2,3,5, YU Yanfei2,3,5
2. Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
3. Guotai(Taizhou) Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals, Taizhou 225327, China;
4. Department of Animal Science and Technology, Huaihua Polytechnic College, Huaihua 418099, China;
5. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
6. Institute of Veterinary Immunology and Engineering, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
7. School of Medical Humanity and Information Management, Hunan University of Medicine, Huaihua 418000, China
猪肺炎支原体(Mesomycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 是造成猪气喘病的重要病原，在全世界几乎所有的猪场广泛流行，发病率高达38%~100%[1]，我国超过99%的猪场存在Mhp感染[2]，给养猪业造成严重的经济损失。目前的防控手段存在生物安全控制成本高，免疫接种不能彻底消除感染，抗生素治疗存在耐药性，一旦感染很难彻底清除等诸多问题。而Mhp的致病机制尚未完全阐明，对于毒力因子的相关研究尚不深入，极大阻碍有效防控策略的制定。
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是一种由LDHA和LDHB两种亚基组成的四聚体酶，是糖代谢途径中一种关键的氧化还原酶。除了在糖代谢中的作用外，越来越多的研究表明LDH与病原微生物的毒力和致病性相关。如粪肠球菌LDH维持氧化还原平衡的能力决定了该菌对不同环境胁迫的抵抗力[3]；敲除LDH基因的化脓性链球菌、肺炎球菌、禾谷镰刀菌生长受阻，毒力下降[4-6]；LDH的抑制剂(棉酚)可用于控制巴贝丝虫的感染，综上表明，LDH在病原微生物致病过程中也发挥重要作用[7]。在Mhp的研究中，LDH被报道是一种早期的特异性免疫原性蛋白，可通过与宿主受体细胞的纤连蛋白、肝素等结合发挥作用[8]。前期研究中也发现LDH蛋白在Mhp强毒株中高表达[9]，但其在Mhp致病过程中的作用尚不清楚。Mhp感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡，导致气管及支气管纤毛上皮细胞清除异物的能力下降，从而继发其他细菌和病毒的混合感染，造成更严重的猪呼吸系统综合征[8]。为了进一步探究LDH在Mhp致病过程中的作用，本文以LDH蛋白和Mhp靶细胞PBEC为研究对象，探究Mhp的LDH对PBEC凋亡的影响，为Mhp致病机制的研究提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 质粒、菌株和细胞选取Mhp强毒株168(F110+)和168经多次体外传代致弱的弱毒株168 L(F300+，即168弱毒疫苗株)、猪支气管上皮细胞PBEC和支原体KM2培养基(一种改良的Friis培养基，含15%猪血清)由江苏省农业科学院兽医研究所提供；BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
Mhp 168和Mhp 168 L采用KM2培养基，置于37 ℃培养箱中静置培养，待培养基由红变黄时进行传代或后续试验。PBEC采用DF12培养基(含4%胎牛血清、0.5% G418、1%生长因子)培养，置于含5% CO2培养箱中，37 ℃静置培养，待生长密度达到80%时，进行后续试验。
1.2 试剂DF12培养基、抗生素G418、胰酶、血清购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；气管上皮细胞生长因子购自LONZA公司；总RNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒购自BD Pharmingen公司；HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反转录试剂盒、SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒(10%)购自上海雅酶生物医药科技有限公司；细胞裂解缓冲液Ⅱ、蛋白Marker、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；PMSF溶液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、增强型CCK-8试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；内毒素检测试剂盒(L00350)购自金斯瑞生物科技股份有限公司；Bax抗体、BCL-2抗体、GAPDH抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；Caspase 3抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记羊抗兔抗体、HRP标记羊抗小鼠抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；ECL电化学发光底物试剂盒购自上海天能生命科学有限公司。
1.3 主要仪器超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；蛋白电泳仪、凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；半干法转印仪购自通用电气公司；ELx800酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司；C6 Plus流式细胞仪购自BD Biosciences公司；ABI7500荧光定量PCR仪、CO2恒温细胞培养箱购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；显微镜购自卡尔蔡司光学(中国)有限公司。
1.4 LDH原核表达及纯化LDH编码序列在强毒株Mhp 168和弱毒株Mhp 168L中高度同源，而前期比较蛋白组学发现LDH在强毒株Mhp 168中高表达[9]，推断其与Mhp毒力相关。根据Mhp 168菌株LDH的基因序列(登录号：MHP168_RS00895)进行密码子优化，采用原核表达载体pET-32a (+)，通过BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点构建重组质粒，并命名为pET-32a-LDH，由金斯瑞生物科技股份有限公司进行密码子优化及合成；将重组质粒10 μL加入到100 μL冰上融化的BL21(DE3)感受态细胞中，42 ℃热击60 s，然后迅速置于冰上2 min，加入900 μL LB培养基，37 ℃静置培养1 h；取100 μL均匀涂布于含0.1%氨苄西林的LB平板上。37 ℃倒置培养过夜(约16 h)。挑取3~5个单菌落，37 ℃ 180 r·min-1震荡培养12~16 h后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得的序列信息经核酸序列比对分析后，选取正确的单克隆按1:100的比例接种于含0.1% 氨苄西林的LB液体培养基中。37 ℃、180 r·min-1震荡培养3 h，呈云雾状(OD600 nm值为0.6~0.8)时加入终浓度0.5 mmol·L-1的IPTG。在16 ℃ 180 r·min-1诱导表达23 h后收菌，同时设立未诱导前对照。
将1L诱导表达的菌体洗涤后，经70 mL含30 mmol·L-1咪唑的PBS重悬后，进行冰上超声波破碎(超声功率450 W，工作时间3 s，停止时间6 s，超声时间60 min)。11 000 r·min-1，4 ℃离心60 min，分离上清和沉淀；收集上清，用0.45 μm滤器过滤，转入经30 mmol·L-1咪唑平衡后的镍柱，以1 mL·min-1的流速流过镍柱。重复2次，收集穿流液备用；依次采用10倍柱体积的含30、100、250、500 mmol·L-1咪唑的PBS洗脱镍柱，分别收集洗脱液。
将未诱导全菌蛋白、诱导后的全菌蛋白、过柱后的穿流液和各浓度咪唑的洗脱液分别进行SDS-PAGE检测。将纯度较好的蛋白洗脱液合并转移到10 ku超滤管内浓缩，并采用PBS进行换液。完成后的蛋白溶液再次进行SDS-PAGE检测样品纯度和分子量，同时采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定，采用内毒素检测试剂盒进行内毒素含量检测。
1.5 兔抗rLDH多克隆抗体(Anti-rLDH)的制备和鉴定将纯化后的rLDH经超滤浓缩后使浓度达到2 mg·mL-1以上，选取2 kg新西兰大白兔，每只兔使用免疫原1 mg，体积1 mL，免疫3次。首次免疫时，使用弗氏完全佐剂与纯化后的rLDH以1:1的比例进行乳化。二免及三免时，采用弗氏不完全佐剂和纯化后的rLDH按1:1比例混合制备免疫原。每次免疫间隔时间为14 d，三免后7 d采血，无菌分离血清，于-40 ℃保存备用。
Mhp 168菌株在KM2培养基中培养48 h，收集20 mL培养物，11 000 r·min-1离心20 min，使用5 mL PBS缓冲液重悬，450 w超声破碎5 min后14 000 r·min-1，4 ℃离心15 min，收集上清，采用BCA蛋白检测试剂盒进行浓度检测，制备全菌蛋白。在全菌蛋白中按比例加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)混合均匀，沸水浴10 min制备样品，每孔上样20 μg进行SDS-PAGE电泳，通过半干法转印至PVDF膜。用含5%脱脂乳的TBST缓冲液在37 ℃封闭2 h，TBST洗3次，10 min·次-1。然后加入一抗rLDH兔血清(1:2 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次后加入HRP标记的羊抗兔抗体作为二抗(稀释比例1:10 000)37 ℃孵育1 h。TBST清洗3次后将ECL电化学发光底物试剂均匀滴加于PVDF膜上，采用Bio-Rad Image LabTM software进行显影成像，通过Western blot鉴定该多克隆抗体的特异性。
1.6 rLDH对细胞形态影响的显微镜观察为评估rLDH对PBEC形态的影响，待PBEC接种到6孔板中，待培养到密度为80%左右时，弃去培养基，清洗细胞，分别加入含不同浓度的rLDH (0、10、50、100和200 μg·mL-1)和Mhp 168(MOI= 100:1和MOI=1 000:1)的维持培养基(含2%胎牛血清的DF12培养基)作用24 h，采用光学显微镜观察细胞形态。
1.7 CCK-8试剂盒法检测细胞活力进一步评估不同rLDH浓度和处理时间对PBEC活力的影响。将PBEC接种到96孔板中，待细胞密度为80%左右时，弃去培养基，清洗细胞，分别加入含不同浓度的rLDH(0、10、50、100和200 μg·mL-1)和Mhp 168(MOI=100:1和MOI=1 000:1)的维持培养基作用24 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液。同时设立含rLDH或Mhp 168、维持培养基和CCK-8溶液但无细胞的孔作为对照，在含5% CO2的培养箱中37 ℃静置培养2 h，然后使用酶标仪测OD450 nm值。为避免高浓度的rLDH对细胞产生毒性作用，筛选细胞活力与对照组无统计学差异的rLDH和Mhp 168浓度为后续试验的最高处理浓度。
1.8 流式分析检测细胞凋亡将PBEC接种到6孔板中，待细胞密度为80%左右时，弃去培养基，清洗细胞。根据不同浓度rLDH对细胞形态及活力的影响结果分别设置高低浓度rLDH试验组(rLDH的终浓度分别为50和100 μg·mL-1)、阴性对照组(维持培养基)和Mhp对照组(Mhp 168和Mhp 168 L菌株，MOI=100:1)与细胞进行孵育。各试验组和对照组均设置3个复孔，在5% CO2的培养箱37 ℃静置培养24 h。细胞清洗消化后，用400 μL 1×Binding buffer重悬成密度为1×106·mL-1的单细胞悬液。每管细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，室温避光孵育5 min，补加100 μL 1×Binding buffer后立即进行流式分析。
1.9 RNA提取和反转录将PBEC接种到24孔板中，待细胞密度为80%左右时，弃去培养基，清洗细胞。设置阴性对照组(维持培养基)和高低浓度rLDH试验组(rLDH的终浓度分别为50和100 μg·mL-1)和Mhp 168株对照组(MOI=100:1)分别孵育细胞，置于5% CO2培养箱中，37 ℃静置培养24 h。弃去上清，清洗细胞，按照试剂盒(R1200-100 T)说明书进行总RNA提取，并通过NanoDrop 2000检测在260、280 nm处的吸光值，要求OD260 nm/OD280 nm的值为1.8~2.0。将得到的RNA按照HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反转录试剂盒(R233-01)说明书进行反转录。
1.10 引物合成和RT-qPCR检测RT-qPCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因名称和参考序列见表 1[10-12]。将反转录得到的cDNA作为模板，GAPDH作为内参进行RT-qPCR扩增。RT-qPCR的反应体系为20 μL，其中2×One Step SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火与延伸30 s，循环40次。按照公式2-ΔΔCt进行目的基因Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、BCL-2、Bax的相对定量分析，明确试验组目的基因相对对照组转录水平的变化情况。
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表 1 RT-qPCR引物序列 Table 1 The primers sequences of RT-qPCR |
采用GraphPad Prism 8.3.0进行统计学分析及图形绘制，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多重比较。*代表两组数据间存在统计学差异性的程度，其中，*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001；****.P<0.000 1。
1.12 Western blot检测采用6孔板按“1.10”的分组和方法孵育细胞24 h后，用预冷的PBS清洗细胞2次，然后每孔加入含1%PMSF的细胞裂解液60 μL，冰上裂解5 min。收集细胞裂解液于1.5 mL EP管，置于四维旋转混合仪4 ℃旋转裂解30 min。14 000 r·min-1，4 ℃离心15 min，收集上清，制备蛋白。以每孔20 μg的蛋白按照“1.5”中的方法进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。其中一抗的稀释比例分别如下：BCL-2 (1:1 000)；Bax (1:5 000)；Caspase 3 (1:1 000)；GAPDH (1:5 000)。HRP标记的羊抗兔抗体或HRP标记的羊抗小鼠抗体二抗稀释比例为1:10 000。采用Image J进行灰度值统计分析。
2 结果 2.1 rLDH的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备将重组质粒pET-32a-LDH转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，经测序验证克隆正确后，采用0.5 mmol·L-1 IPTG诱导LDH表达。SDS-PAGE结果显示(图 1A)，52 ku左右出现明显的目的条带，与LDH重组蛋白理论大小一致，证明LDH蛋白被成功诱导表达。将菌体超声后的上清和不同浓度的咪唑洗脱液进行SDS-PAGE电泳，结果显示，rLDH可以以可溶性的形式表达，且10和250 mmol·L-1咪唑洗脱液中均含有明显的目的条带(图 1A)。因此，收集100和250 mmol·L-1咪唑洗脱液，通过超滤管进行蛋白浓缩与换液。SDS-PAGE分析超滤结果，在52 ku左右出现目的条带(图 1B)。通过BCA法检测蛋白浓度为5.4 mg·mL-1，通过内毒素检测试剂盒测定内毒素含量为0.621 EU·mL-1。-80 ℃保存，用于后续试验。将获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔后收集血清，采用Mhp 168株全菌蛋白进行SDS-PAGE，转印之后与rLDH高免血清进行Western blot分析。结果如图 1C所示，在34 ku的位置出现条带，大小与LDH蛋白大小一致，未见明显杂带，表明制备的LDH多克隆抗体与Mhp 168全菌蛋白中的LDH蛋白发生了特异性结合，制备的LDH抗体具有较好的特异性。
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A、B. SDS-PAGE分析(M.蛋白质相对分子质量标准；1. 未经IPTG诱导的重组菌；2. 经IPTG诱导后的重组菌；3. 穿流液；4~7. 经30、100、250、500 mmol·L-1咪唑洗脱液；8. 纯化的重组蛋白rLDH)；C. Western blot分析(M.蛋白质相对分子质量标准；9. rLDH抗血清与Mhp 168全菌蛋白的反应) A, B. SDS-PAGE analysis (M. Protein marker; 1. Bacteria was not induced by IPTG; 2. Bacteria was induced by IPTG; 3. Liquid that has flowed through the nickel column; 4-7. 30, 100, 250, 500 mmol·L-1 Imidazole eluent; 8. Purified recombinant protein rLDH); C. Western blot analysis (M. Protein marker; 9. The reactivity of anti-rLDH serum to the total protein of Mhp 168) 图 1 rLDH的表达、纯化及多克隆抗体制备 Fig. 1 Expression, purification and polyclonal antibody preparation of rLDH |
采用不同浓度的rLDH(0、10、50、100和200 μg·mL-1)和Mhp 168(MOI=100:1和MOI=1 000:1)分别与PBEC孵育24 h，使用光学显微镜观察细胞形态。结果如图 2所示，PBEC形态的异常变化与rLDH的浓度呈正相关。随着rLDH浓度的增加，PBEC细胞形态逐渐出现不规则现象，细胞脱落数量增多，细胞出现异常的程度随之加重。当rLDH浓度为200 μg·mL-1时，细胞出现微弱的形态变化。当rLDH的浓度≤100 μg·mL-1时，对细胞形态无明显影响。采用Mhp 168感染PBEC后，当感染的MOI=100:1时，细胞形态无明显变化，但当感染的MOI=1 000:1时，细胞形态发生改变，细胞碎片增加。
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A. 不含rLDH的对照组；B~E. rLDH浓度分别为10、50、100和200 μg·mL-1的处理组；F. Mhp 168处理组(MOI=100:1)；G. Mhp168处理组(MOI=1 000:1)；比例尺=100 μm A. Control group without rLDH; B-E. Experimental groups with rLDH of 10, 50, 100 and 200 μg·mL-1, respectively; F. Experimental groups with Mhp (MOI=100:1); G. Experimental groups with Mhp 168 (MOI=1 000:1); the scale bar=100 μm 图 2 光学显微镜观察PBEC细胞形态 Fig. 2 Observation the morphology of PBEC by optical microscope |
采用不同浓度的rLDH(0、10、50、100和200 μg·mL-1) 和Mhp 168(MOI=100:1和MOI=1 000:1)与PBEC孵育24 h，通过CCK-8法测定细胞活力。结果如图 3所示，与对照组相比，随着rLDH和Mhp浓度的增高，细胞活力逐渐下降。当rLDH的浓度为10、50、100 μg·mL-1时，细胞活力差异不显著(P>0.05); rLDH浓度达到200 μg·mL-1时，细胞活力下降显著(P<0.05)；当Mhp 168的MOI值达到1 000:1时，细胞活力下降极显著(P<0.000 1)。综上，为了减少因细胞形态和活力的变化带来的影响，选用LDH(100 μg·mL-1)和Mhp 168 (MOI=100:1) 为开展后续试验的最高浓度。
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*.P<0.05；****.P<0.000 1；ns.(P>0.05)；下同 *.P<0.05; ****.P<0.000 1; ns. (P>0.05); the same as below 图 3 rLDH对猪支气管上皮细胞活力的影响 Fig. 3 Effect of rLDH on the viability of PBEC |
分别选用对细胞的形态和活力没有显著影响的50和100 μg·mL-1的rLDH与PBEC孵育，进行细胞凋亡研究。Annexin V/PI检测是检测细胞凋亡的重要手段之一，正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只位于细胞膜脂质层的内侧，当细胞出现早期凋亡时，会使脂酰丝氨酸外翻，与FITC标记的Annexin V结合，细胞被荧光染料着色。PI是一种核酸染料，当细胞出现晚期凋亡时，核膜破坏，可使细胞核染色。采用流式细胞仪检测rLDH引起的PBEC凋亡率(早期凋亡Annexin-V+PI-)，结果如图 4所示，正常PBEC培养24 h后细胞的早期凋亡率为1.46%±0.19%；低浓度的rLDH(50 μg·mL-1)和高浓度的rLDH(100 μg·mL-1)诱导PBEC的早期凋亡率分别为4.93%±0.04%和10.3%±1.79%；Mhp 168和Mhp 168L诱导PBEC的早期凋亡率分别为10.07% ±0.4%和6.29%±2.71%；结果表明，Mhp 168和Mhp 168L及rLDH均能显著引起PBEC产生细胞凋亡现象，且rLDH的浓度越高，诱导PBEC的细胞凋亡率越高, Mhp 168引起更高的早期凋亡率。
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A. 细胞对照组；B. 低浓度rLDH处理组(50 μg·mL-1)；C. 高浓度的rLDH处理组(100 μg·mL-1)；D. Mhp 168处理组(MOI=100:1)；E. Mhp 168L处理组(MOI=100:1)；F.细胞凋亡率比较。*.P<0.05, **.P<0.01, ****.P<0.000 1 A. Control group; B. Experimental groups with low rLDH (50 μg·mL-1); C. Experimental groups with high rLDH (100 μg·mL-1); D. Experimental groups with Mhp 168 (MOI=100:1). E. Experimental groups with Mhp 168L (MOI=100:1); F. Comparison of apoptosis of group A to E. *.P<0.05, **.P < 0.01, ****.P<0.000 1 图 4 流式细胞仪检测rLDH对PBEC凋亡的影响 Fig. 4 Effect of rLDH on the apoptosis of PBEC by flow cytometry |
为了进一步确定Mhp及其重要蛋白rLDH对PBEC凋亡的诱导作用，采用RT-qPCR法检测凋亡通路上各标志基因mRNA水平的变化。从图 5可以看出，PBEC经Mhp 168孵育后，促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平呈不同程度的升高，而抗凋亡因子BCL-2的mRNA水平下降。采用不同浓度的rLDH孵育细胞后，随着rLDH浓度的增加，caspase 3的mRNA水平逐渐升高。其中，低浓度rLDH处理组(50 μg·mL-1)的PBEC caspase 3 mRNA水平显著上调(P<0.05)，高浓度rLDH处理组(100 μg·mL-1)的caspase 3 mRNA水平极显著上调(P<0.000 1)，且极显著地高于Mhp 168处理组(P<0.000 1)；低浓度rLDH处理组(50 μg·mL-1)的PBEC caspase 9 mRNA水平无显著差异(P>0.05)，而高浓度rLDH处理组(100 μg·mL-1)的caspase 9 mRNA水平极显著上调(P<0.001)；高浓度rLDH处理组促凋亡因子Bax的mRNA水平极显著上调(P<0.001)，且极显著地高于Mhp 168处理组(P<0.01)；抗凋亡因子BCL-2的mRNA水平极显著下调(P<0.01)，而无论高浓度rLDH处理还是低浓度rLDH处理的PBEC的caspase 8 mRNA水平均没有显著变化(P>0.05)。由于caspase 3是凋亡级联反应的执行者，是所有凋亡途径的共同通路，因此Mhp及rLDH诱导caspase 3的显著转录再次证明Mhp及rLDH能诱导PBEC产生细胞凋亡的现象；而外源性凋亡途径主要导致caspase 8的激活，内源性凋亡途径主要导致caspase 9激活，受BCL-2和Bax控制，因此RT-qPCR分析从mRNA水平证明Mhp感染PBEC的过程中，可能通过LDH诱导促凋亡因子Bax、Caspase 9和抗凋亡因子BCL-2的作用，从而调节细胞内源性凋亡过程。
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与对照组相比，*.P<0.05, **.P<0.01，***.P<0.001，****.P<0.000 1，下同 Compared to control, *.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, ****.P < 0.000 1, the same as below 图 5 RT-qPCR检测PBEC凋亡相关因子的mRNA水平 Fig. 5 Detection the mRNA levels of apoptosis-related factors in PBEC by RT-qPCR |
采用Western blot方法进一步确认rLDH诱导PBEC凋亡标志蛋白表达水平的变化。结果如图 6所示，与对照组相比，孵育Mhp 168菌株后，PBEC的caspase 3和促凋亡因子Bax表达水平显著升高，而抗凋亡因子BCL-2的蛋白表达水平极显著下调。不同浓度的rLDH孵育PBEC后，caspase 3和Bax的蛋白表达水平均显著升高，证明rLDH对凋亡相关因子caspase 3和Bax表达起促进作用。不同浓度的rLDH孵育PBEC后，BCL-2的蛋白表达水平均极显著下降，证明rLDH对凋亡相关因子BCL-2表达起抑制作用。rLDH及Mhp 168菌株均能引起PBEC三种凋亡相关蛋白表达水平的显著变化，进一步从蛋白水平证实Mhp 168感染PBEC的过程中，可能通过LDH上调促凋亡因子Bax的表达和下调抗凋亡因子BCL-2的作用，引起细胞内源性凋亡的作用。
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图 6 Western blot检测PBEC凋亡相关因子的蛋白水平 Fig. 6 Detection protein levels of apoptosis-related factors in PBEC by Western blot |
细胞凋亡是机体内外因素刺激后诱发的细胞程序性死亡，机体可通过诱导自身细胞凋亡来抵御病原体的入侵，同时，病原体也可能通过诱导细胞凋亡引发机体损伤[13-14]。多种动物支原体被报道可诱导细胞凋亡，如牛支原体、鸡毒支原体、猪鼻支原体和Mhp等[15-18]。Mhp是猪地方性肺炎的病原，会引起猪群免疫力下降及生长速度减缓。其造成的感染病程长且难以净化，给世界养猪业带来重大的经济损失。Mhp感染后可诱导呼吸道气管上皮及支气管上皮细胞的损伤及凋亡，导致纤毛倒伏、破坏，清除异物能力下降，从而造成更严重的继发及混合感染[8]。但Mhp导致细胞凋亡的机制尚不明确。作者前期从比较蛋白组学的角度筛选Mhp毒力相关因子，结果发现LDH在Mhp强毒株中高表达，可能参与其致病过程[9]。
LDH是糖代谢的关键酶之一，与机体细胞的物质和能量代谢息息相关。此外，除了作为机体能量代谢的关键酶外，也有大量研究表明LDH作为一种兼职蛋白，还参与到病原微生物的致病过程。敲除LDH基因的肺炎球菌及禾谷镰刀菌的菌株被报道生长受阻，毒力下降[5-6]。在抗寄生虫药物的研究中也发现，常见抗寄生虫药物吡喹酮、青蒿素、甲苯咪唑等均对LDH有抑制作用[19]，这些研究表明LDH除了作为代谢途径中的关键酶之外，还可能作为毒力相关因子参与病原菌的致病过程。这种兼职功能对于Mhp这类基因组极端俭省的病原微生物发挥致病力作用显得尤为重要。
为了探究LDH在Mhp致病过程中发挥的作用，本研究通过原核重组表达和亲和层析获得高纯度LDH蛋白，将其与Mhp重要的靶细胞PBEC相互作用，发现rLDH能呈剂量依赖性地诱导PBEC发生细胞凋亡，其作用与Mhp菌株的作用一致。细胞凋亡分为外源性凋亡和内源性凋亡[13]，外源性凋亡途径由TNF或FAS受体的激活诱导，进而导致caspase 8的激活。内源性凋亡途径主要受促凋亡因子Bax和抗凋亡因子BCL-2的控制。当Bax在细胞中过表达时，死亡信号增强，导致线粒体释放细胞色素C，激活caspase 9[20]。BCL-2表达的下调和Bax表达的上调可作为细胞凋亡的重要指标, 活化的caspase 8和caspase 9都可诱导细胞caspase 3的激活。因此, caspase 3是凋亡级联反应的执行者，是所有凋亡途径的共同通路，可通过剪切细胞结构蛋白，直接使细胞发生凋亡[21-22]。本研究中rLDH蛋白和Mhp菌株均可诱导caspase 3和促凋亡因子Bax的mRNA水平和蛋白表达水平的显著上调，而抗凋亡因子BCL-2的mRNA水平和蛋白表达水平发生显著下调，caspase 9的mRNA水平显著上调；caspase 8的mRNA水平却没有显著变化，初步表明Mhp可导致PBEC发生细胞凋亡。重组LDH蛋白对PBEC凋亡的作用及凋亡相关因子的影响趋势与菌株一致，证明在Mhp感染PBEC的过程中，可能通过LDH诱导促凋亡因子Bax和caspase 9及抗凋亡因子BCL-2的作用，调节细胞内源性凋亡。
遗憾的是，Mhp难以接受外源基因，其基因编辑是世界性难题，加上LDH是支原体代谢中的关键酶，因此短期内难以实现LDH的敲除，无法通过相应基因缺失株进一步验证上述发现。但该研究为进一步探究Mhp破坏呼吸道屏障，引起呼吸系统疾病的机制提供了重要理论依据。
4 结论在感染靶细胞PBEC的过程中，猪肺炎支原体可能通过LDH蛋白诱导PBEC内源性细胞凋亡，凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。
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(编辑 白永平)