2. 江苏省农业科学院兽医研究所, 南京 210014
, SHANG Hongqi2, ZHANG Xue2, QIAN Jiali2, WANG Chuanhong2, SONG Xu2, BAO Meiying2, LIU Shiyu2, ZHANG Gege2, GUO Rongli2, ZHAO Yongxiang2, FAN Baochao2
, LI Bin1,2
2. Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)属冠状病毒属、α-冠状病毒科，为有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV基因组大小约28 kb，包括7个开放阅读框(ORF)：ORF1a、ORF1b和ORF2~ORF6。其中ORF2~ORF6分别编码刺突蛋白(S)、非结构蛋白ORF3、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)[1-2]。PEDV可通过粪口传播引起新生仔猪以急性腹泻、呕吐、脱水为特征的高度传染性肠道疾病，死亡率高达100%。目前，尚无治疗PEDV的特效药，疫苗接种仍然是预防和控制PEDV的最有效方法。虽然市场上已有多种商品化疫苗，但效果并不理想。针对PEDV感染，宿主的多种蛋白或因子具有抵抗其感染作用，例如最新发现的胞苷/尿苷单磷酸激酶2(CMPK2)和前信使核糖核酸加工因子(PRPF19)[3]，但对于PEDV与宿主间的相互作用关系的了解仍不全面。发现新的抗病毒复制宿主因子，对新抗病毒药物的研发具有重要的意义。
C8orf4，也称为甲状腺癌1(TC1)，最初是从甲状腺癌及其周围正常甲状腺组织克隆而来[4-7]，该基因编码的蛋白是一种促生存蛋白[8]，在脊椎动物中普遍表达[8]，具有跨物种的序列保守性。研究表明C8orf4编码蛋白在多种癌症中高表达，并与甲状腺癌[5-6]、肺癌[9-11]、胃癌[12]、结直肠腺癌[13]等癌症发生有关，C8orf4编码蛋白具有增强Wnt/β-catenin信号传导[8, 14]，抑制Notch2信号传导作用[15]，表明其可能参与癌干细胞自我更新的监管[15]；C8orf4编码蛋白还通过有丝分裂原激活的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路来促进细胞周期的转变，在细胞周期控制以及转录和翻译调节中起重要作用[16]；C8orf4也是核因子κB(NF-κB)的靶基因，并作为内皮炎症调节因子增强NF-κB活性[17]。此外，C8orf4可以通过转化生长因子β(TGF-β)途径和白细胞介素-1β(IL-1β)/肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)途径上调[18]。近期研究发现C8orf4在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)和流感病毒H1N1感染中表达上升[19]，但是，C8orf4与PEDV感染之间的关系并不清楚。因此，本研究通过研究C8orf4编码蛋白对PEDV增殖的影响，为深入研究C8orf4的功能奠定基础，也为抗病毒药物设计提供新思路。
1 材料与方法 1.1 细胞、病毒、质粒Vero细胞、PEDV AH2012/12株(GenBank No.：KU646831)、表达载体pcDNA3.1均由江苏省农业科学院兽医研究所保存；表达C8orf4基因(GenBank No.：NM_001193991.1)的重组质粒pcDNA3.1-C8orf4-His由南京金斯瑞公司合成。
1.2 主要试剂Trans5α感受态细胞购自北京全式金生物技术股份有限公司；质粒中提试剂盒购自Omega公司；Lipofectamine 3000转染试剂购自Thermo Fisher公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培养基购自Gibco公司；PEDV-N蛋白鼠单克隆抗体由本实验室保存；His标签鼠单克隆抗体与GAPDH鼠单克隆抗体均购自Proteintech公司；兔抗C8orf4基因编码蛋白多抗购自ABclonal公司；RIPA蛋白裂解液和胰酶、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG购自碧云天生物公司；RNA提取试剂盒Fastpure cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、5×HiScript ⓇⅡ qRT SuperMix for qPCR逆转录酶、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均购自Vazyme公司。
1.3 引物的设计与合成根据非洲绿猴C8orf4基因序列，设计扩增其CDS区域255~575 nt片段的qRT-PCR引物C8orf4-F/R，病毒及内参引物PEDV N-F/R和GAPDH-F/R由本实验室提供；C8orf4的特异性siRNA片段委托Gene Pharma公司设计并合成。引物及siRNA序列如表 1所示。
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表 1 引物及siRNA序列 Table 1 Primer and siRNA sequences |
为测定PEDV感染后对C8orf4的影响。将Vero细胞铺于24孔板, 置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，长满单层后，使用PEDV AH2012/12毒株，以0.1 MOI剂量感染Vero细胞，并设置不接种病毒阴性对照组。于接种后6、12和24 h(6、12、24 hpi)分别收取细胞样品，用于C8orf4、PEDV N和GAPDH mRNA和编码蛋白水平的检测。
1.5 过表达C8orf4编码蛋白对PEDV复制的影响为测定过表达C8orf4编码蛋白对PEDV复制的影响，待24孔细胞板中Vero细胞密度达70%~80%，采用Lipofectamine 3000分别将pcDNA3.1-C8orf4-His和pcDNA3.1以2 μg ·孔-1转染细胞，37 ℃温箱培养24 h后，使用AH2012/12以0.1 MOI剂量感染细胞，并设置pcDNA3.1空载转染组为阴性对照，继续培养24 h后收获各组细胞样品，用于过表达C8orf4、PEDV N和GAPDH的mRNA和编码蛋白水平检测。
1.6 抑制C8orf4表达对PEDV复制的影响由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成C8orf4基因的siRNA(表 1)。待24孔细胞板中Vero细胞密度达70%~80%，采用Lipofectamine 3000分别将siC8orf4-1、siC8orf4-2或si-NC，以2×10-5或4×10-5μmol ·孔-1剂量转染细胞，37 ℃温箱培养24 h后，收获各组细胞样品，用于C8orf4和GAPDH mRNA和编码蛋白水平的检测，筛选出对C8orf4基因抑制效果较好的siRNA。后采用相同的方法进行siRNAs转染，使用AH2012/12以0.1 MOI剂量感染细胞，继续培养24 h后收获各组细胞样品，用于C8orf4、PEDV N和GAPDH的mRNA和编码蛋白水平检测。
1.7 C8orf4编码蛋白对PEDV复制周期的影响前期细胞铺板、培养和转染同“1.5”所描述。
为探究C8orf4编码蛋白对病毒吸附阶段的影响，待细胞转染24 h后，PEDV AH2012/12株按照0.5 MOI剂量接种，置于4 ℃作用30 min，使用预冷的PBS清洗细胞3次后，收取细胞样品用于qRT-PCR的测定。
为探究C8orf4编码蛋白对病毒内化阶段的影响，待细胞转染24 h后，PEDV AH2012/12株按照0.25 MOI剂量接种，置于37 ℃作用1 h，使用无菌PBS清洗细胞3次后，收取细胞样品用于qRT-PCR的测定。
为探究C8orf4编码蛋白对病毒生物合成阶段的影响，待细胞转染24 h后，PEDV AH2012/12株按照0.1 MOI剂量接种，后置于37 ℃作用1 h，使用无菌PBS清洗细胞3次，加入维持液于37 ℃继续培养24 h，然后使用无菌PBS清洗细胞3次，收取细胞样品用于qRT-PCR的测定。
1.8 qRT-PCR检测细胞总RNA提取和cDNA合成参照细胞总RNA提取试剂盒及反转录酶说明书进行，并以cDNA为模板，利用引物C8orf4-F/R、PEDV-N-F/R和GAPDH-F/R，采用染料法qPCR Master Mix试剂检测C8orf4、PEDV N和GAPDH基因的转录水平，反应体系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 2 μL，用无菌ddH2O将体系补至20 μL；反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。并采用2-ΔΔCt法计算qRT-PCR结果，利用GraphPad Prism 5软件对结果进行分析。
1.9 Western blot检测取出24孔细胞板, 每孔加入150 μL蛋白裂解液RIPA(含PMSF), 置于4 ℃冰箱裂解15 min, 使用细胞刮板将细胞刮下，12 000 r ·min-1离心5 min，取上清，加入5×Loading buffer，95~100 ℃变性8 min, 瞬时离心后进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭后分别加入兔抗C8orf4基因编码蛋白多抗(稀释度1 ∶500)，小鼠抗PEDV-N蛋白单抗(稀释度1 ∶500)，小鼠抗His单克隆抗体(1 ∶5 000)和内参抗体GAPDH(稀释度1 ∶10 000)，置于4 ℃孵育过夜。之后使用PBST缓冲液清洗3次，每次30 min, 分别加入HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L)(稀释度1 ∶10 000)和HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(稀释度1 ∶10 000)室温孵育1.5 h，用PBST清洗3次，每次30 min，最后在化学发光仪上显色曝光，观察目的蛋白表达情况。
1.10 数据统计与分析使用SPSS 19.0对试验数据进行独立样本t检验分析，结果以“平均值±标准误(x±sx)”表示，应用GraphPad Prism 6.0软件对数据进行绘图。*表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001, ****表示P < 0.000 1。
2 结果 2.1 PEDV感染对C8orf4表达的影响Vero细胞接种PEDV(MOI=0.1)后，于6、12和24 hpi分别收取细胞样品，检测C8orf4表达水平。荧光定量检测结果(图 1A)显示，随PEDV感染时间的延长，C8orf4 mRNA水平显著上升；Western blot检测结果(图 1B、C)同样发现，随PEDV感染时间的延长，C8orf4编码蛋白表达水平显著上升。上述结果表明，PEDV感染具有上调C8orf4表达的作用。
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A. PEDV感染6、12和24 h后C8orf4 mRNA表达水平；B. PEDV感染6、12和24 h后C8orf4编码蛋白表达水平；C. PEDV感染6、12和24 h后C8orf4编码蛋白表达水平的灰度值分析；*. P < 0.05；**. P < 0.01；***. P < 0.001；****. P < 0.000 1 A. C8orf4 mRNA expression levels at 6, 12 and 24 h after PEDV infection; B. C8orf4 encoding protein expression levels at 6, 12 and 24 h after PEDV infection; C. Gray value analysis of C8orf4 encoding protein expression levels at 6, 12 and 24 h after PEDV infection; *. P < 0.05; **. P < 0.01; ***. P < 0.001; ****. P < 0.000 1 图 1 PEDV感染对C8orf4表达的影响 Fig. 1 Effect of PEDV infection on C8orf4 expression |
采用转染重组质粒pcDNA3.1-C8orf4-His过表达C8orf4编码蛋白，检测其对PEDV复制的影响。通过已建立的PEDV基因拷贝数检测方法[20]进行检测发现，与空载体pcDNA3.1转染组相比，过表达C8orf4编码蛋白组上清和细胞中PEDV拷贝数显著下降(图 2A)；Western blot结果显示，与空载体pcDNA3.1转染组相比，过表达C8orf4编码蛋白组细胞中PEDV-N蛋白表达水平显著下降(图 2B、C)。以上结果表明过表达C8orf4编码蛋白抑制PEDV的复制。
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A. 过表达C8orf4编码蛋白后测定PEDV N mRNA表达水平；B. 过表达C8orf4编码蛋白后测定PEDV N蛋白表达水平；C. 过表达C8orf4编码蛋白后测定PEDV N蛋白表达水平的灰度值分析；**. P < 0.01；***. P < 0.001；****. P < 0.000 1 A. PEDV N mRNA expression was measured after overexpression of C8orf4 encoding protein; B. PEDV N protein expression level was determined after overexpression of C8orf4 encoding protein; C. Gray value analysis of PEDV N protein expression levels determined after overexpression of the C8orf4 encoding protein; **. P < 0.01; ***. P < 0.001; ****. P < 0.000 1 图 2 过表达C8orf4编码蛋白抑制PEDV复制 Fig. 2 Overexpression of C8orf4 encoding protein inhibited PEDV replication |
对C8orf4基因的特异性siC8orf4-1和siC8orf4-2进行筛选及最佳剂量摸索。如图 3A~C所示，与siC8orf4-1相比，siC8orf4-2对C8orf4的抑制效果更好，且添加剂量为2×10-5μmol ·孔-1时，便抑制了绝大部分C8orf4编码蛋白的表达。
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A. 转染不同浓度siC8orf4-1和siC8orf4-2后测定C8orf4 mRNA表达水平；B. 转染不同浓度siC8orf4-1和siC8orf4-2后测定C8orf4编码蛋白表达水平；C. 转染不同浓度siC8orf4-1和siC8orf4-2后测定C8orf4编码蛋白表达水平灰度分析；D. 转染siC8orf4-2后接种PEDV，测定PEDV-N mRNA表达水平；E. 转染siC8orf4-2接种PEDV，测定PEDV N和C8orf4编码蛋白表达水平；F. 转染siC8orf4-2接种PEDV，测定PEDV-N和C8orf4编码蛋白表达水平灰度分析；*. P < 0.05；**. P < 0.01；***. P < 0.001；****. P < 0.000 1 A. C8orf4 mRNA expression levels were measured after transfection with different concentrations of siC8orf4-1 and siC8orf4-2; B. C8orf4 encoding protein expression levels were measured after transfection with different concentrations of siC8orf4-1 and siC8orf4-2; C. Gray scale analysis of C8orf4 encoding protein expression levels after transfection with different concentrations of siC8orf4-1 and siC8orf4-2; D. After siC8orf4-2 transfection, PEDV was inoculated and PEDV-N mRNA expression level was measured; E. siC8orf4-2 was transfected and PEDV was inoculated. The protein expression levels of PEDV-N and C8orf4 encoding protein were measured; F. Gray-scale analysis of PEDV-N and C8orf4 encoding protein expression levels after siC8orf4-2 transfection and PEDV inoculation; *. P < 0.05; **. P < 0.01; ***. P < 0.001; ****. P < 0.000 1 图 3 干扰C8orf4基因表达促进PEDV复制 Fig. 3 Promoting PEDV replication by interfering C8orf4 |
随后，选取siC8orf4-2以2×10-5μmol ·孔-1剂量转染Vero细胞后，接种PEDV，于24 hpi收取细胞样，进行病毒蛋白和基因表达水平的检测。结果显示，与si-NC组相比，干扰C8orf4表达后，PEDV-N基因表达水平显著升高(图 3D)；Western blot检测发现，干扰C8orf4表达后，PEDV-N蛋白表达水平显著升高(图 3E、F)；以上结果表明干扰C8orf4表达可促进PEDV的复制。
综合上述结果，C8orf4基因编码蛋白具有抑制PEDV复制作用。
2.4 C8orf4编码蛋白对PEDV复制周期的影响为了探索C8orf4编码蛋白对PEDV复制周期的影响，通过qRT-PCR检测C8orf4编码蛋白过表达后，病毒在吸附、内化、生物合成三个阶段的病毒基因组和PEDV-N基因的mRNA水平。结果显示(图 4)，在病毒的吸附和内化阶段，过表达C8orf4编码蛋白对PEDV基因组RNA水平无显著影响；但是在病毒后期生物合成阶段，过表达C8orf4编码蛋白组细胞中PEDV-N基因mRNA水平显著降低。这些结果表明，C8orf4编码蛋白在PEDV生物合成阶段发挥抑制病毒增殖的功能。
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****. P < 0.000 1 图 4 C8orf4编码蛋白对PEDV复制周期的影响 Fig. 4 Effect of C8orf4 encoding protein on PEDV replication cycle |
PEDV的持续变异及广泛流行，严重威胁全球养猪业的健康发展。深入了解PEDV与宿主间的相互作用关系，将对PEDV致病机制和免疫防控技术研究提供新的见解和思路。C8orf4作为一种与炎症有关的新型调节因子，其可通过TGF-β、IL-1β/TNF-α和FGFR2途径上调[18]。Nunnari等[19]发现C8orf4在SARS-CoV-2、MERS-CoV和H1N1感染中表达上升。在本研究中，作者同样发现PEDV感染可显著上调C8orf4的表达，且PEDV感染对TGF-β、IL-1β和TNF-α细胞因子具有上调作用[20-21]，病毒感染导致的多种细胞因子的上调也许与C8orf4表达上升相关。
C8orf4对内皮细胞的关键炎症基因具有上调作用[17, 22]，C8orf4可通过增强NF-κB核易位和DNA结合活性，使NF-κB从IκB中释放并易位细胞核，以调节宿主免疫和炎症反应相关基因的转录[23-25]，通过调节NF-κB转录来增强关键的炎症介质和炎症反应[17]。针对PEDV，有研究发现病毒感染会抑制Vero细胞中TNF-α表达，并激活NF-κB信号通路[26]，而NF-κB的激活可进一步抑制PEDV的复制[27]。徐新刚等[28]发现，在感染PEDV的细胞内TRIM56表达上调，TRIM56过表达显著增加了IRF3和NF-κB P65的磷酸化，增强了IFN-β抗病毒反应，TRIM56的过表达通过正向调节TLR3介导的抗病毒信号通路来抑制PEDV复制。在本研究中，作者发现PEDV感染会上调C8orf4的表达，并且C8orf4编码蛋白具有抑制病毒复制能力。因此，作者猜测C8orf4抑制PEDV复制可能与NF-κB激活有关，但上调的C8orf4是否通过对NF-κB的激活，进一步发挥抑制PEDV复制的作用仍需后续的研究。
病毒感染宿主细胞主要包括吸附、内化和复制等环节[29]。本研究参考Shan等[30]方法，通过过表达C8orf4编码蛋白后接毒，分别检测病毒感染不同期间的病毒量的变化。结果发现C8orf4编码蛋白对PEDV的吸附和内化无影响，但对病毒的生物合成阶段具有显著的抑制作用。研究已发现，PEDV可通过p53途径引起Vero细胞周期阻滞在G0/G1期，细胞在G0/G1期的阻滞有利于PEDV的复制[31]。而C8orf4编码蛋白可通过调节丝裂原激活的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路来促进细胞周期的G(1)到S相转变，从而在细胞周期控制以及转录和翻译调节中起重要作用[17]。C8orf4编码蛋白对细胞周期的控制也许是影响PEDV胞内生物合成的因素。
4 结论本研究首次研究了C8orf4与PEDV感染间的相互作用关系，发现PEDV感染显著上调C8orf4表达，而C8orf4编码蛋白具有抑制PEDV复制能力，并作用于病毒的生物合成阶段。但C8orf4与PEDV复制间相互作用的内在机理仍需深入探究。该研究发现了一个新的抗PEDV感染的宿主靶点，为进一步揭示C8orf4基因编码蛋白的抗病毒机制奠定了基础。
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(编辑 白永平)