猪圆环病毒4(porcine circovirus 4，PCV4)是2019年首次报道的圆环病毒科，圆环病毒属成员，是由二十面体衣壳内的环状单链基因组DNA组成的小型球形无包膜病毒^[1-2]，全基因包含12个开放阅读框(open reading frame，ORF)，ORF1和ORF2是两个主要的开放阅读框，分别编码复制酶蛋白(replicase protein，Rep)和衣壳蛋白(capsid protein，Cap)。在这之前，已经报道的猪圆环病毒有三种，分别为猪圆环病毒1(PCV1)、猪圆环病毒2(PCV2)和猪圆环病毒3(PCV3)。其中PCV1无致病性^[2-5]。PCV2和PCV3具有致病性，PCV2可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)和猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)^[4-5]，PCV3则与PDNS和繁殖障碍的产生有关^[6-7]。其中PCV2、PCV3对猪的感染均主要集中在淋巴结、脾、扁桃体等免疫器官^[8-9]。

PCV4在全球的流行越来越广泛，目前PCV4已经在中国、韩国和泰国等多个国家被检测到^{[1, 10-11]}，同时，多篇报道表明PCV4呈现跨物种传播的特征，不仅在猪群中检测到，在其他物种，包括犬类、奶牛和毛皮动物的临床样本中均发现PCV4的感染^[12-15]。2019年首次在湖南省发现的感染PCV4的猪群中，大多数猪具有严重的临床体征，包括呼吸道疾病、肠炎和PDNS等^[1]。多篇报道表明PCV4主要在感染了其它PCVs的猪样本中被检测到^[16-18]，推测PCV4可能对疾病的产生具有协同作用或一定的致病性。在最近的报道中，Niu等^[19]将PCV4从感染性克隆中拯救出来，接种仔猪后虽未产生明显的临床症状，但仔猪的肺、脾、肾、肝和淋巴结均出现不同程度的病理变化。这进一步表明了PCV4可能具有致病性，因此控制PCV4的传播显得极为重要，需要对PCV4的分子流行病学和血清学进行更多的调查。

目前，关于PCV4在中国各省份的分子流行病学调查已有多篇报道，而血清学调查相对较少。在课题组之前的研究中建立了基于PCV4 Rep蛋白的ELISA方法，并对中国17个省的1 790份血清样本进行了PCV4的血清流行病学调查，总阳性率为43.97%^[20]。2021年Lian等^[21]建立了基于PCV4-Cap蛋白的ELISA方法，对江苏省2018—2021年采集的1 048份血清样本进行了PCV4血清学调查，阳性率为3.44%。2022年Hu等^[22]建立了分别以Cap和Rep蛋白为包被抗原的PCV4间接ELISA，并应用于江西省507份血清的PCV4血清流行病学调查，阳性率分别为3.35%和7.10%。这几份血清流行病学调查之间存在较大差异，可能是采集样本的数量和样本覆盖范围不同或者样本的年龄阶段不同导致的。因此，为了进一步调查PCV4在中国的流行率，并且验证课题组之前利用Rep-ELISA进行血清流行病学调查的结论^[20]，本研究建立了一种基于PCV4 Cap蛋白的间接ELISA方法，用于检测PCV4抗体，随后采用建立的ELISA方法对中国18个省的不同年龄阶段的2 298份血清进行了PCV4血清学调查，以了解PCV4的感染情况，从而为控制PCV4的传播提供更加清楚、可靠的信息。

1 材料与方法 1.1 血清

PCV2、PCV3、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus, PRV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)阳性血清由本实验室保存。PCV4阴性血清和阳性血清为经定量PCR和PCV4 Rep-ELISA检测，PCV4核酸和抗体均为阴性或阳性的临床血清样本。2 298份临床猪血清样本采自安徽、福建、广西、广东、贵州、河北、湖北、湖南、河南、江苏、江西、吉林、内蒙古、山东、山西、四川、新疆和云南共18个省份，其中母猪血清824份、仔猪血清629份、保育猪血清333份、育肥猪血清512份。

1.2 主要试剂和材料

96孔酶标板购自Costar公司；Ni-NTA亲和层析树脂购自QIAGEN公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG、TMB显色液均购自KPL公司。

1.3 原核表达质粒的构建

根据PCV4-AHG-2019基因组序列(GenBank登录号：MK986820)，对其进行密码子优化，分别在优化后的序列的5′和3′端加入NdeⅠ和BamHⅠ两种酶切位点，合成PCV4 Cap基因全序列。将人工合成的PCV4 Cap全长序列与载体pET28a(+)分别用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ进行酶切，回收酶切产物后进行连接，并转化入大肠杆菌DH5α。用PCR筛选阳性克隆，对其增菌培养后提取质粒进行双酶切鉴定，最终获得重组质粒pET28a-PCV4Cap。

1.4 重组蛋白的表达与纯化

根据生产商说明将重组质粒pET28a-PCV4Cap转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性菌落，在LB培养基(含50 μg ·mL^-1卡那霉素)中培养至OD_{600 nm}为0.6，加入终浓度为0.5 mmol ·L^-1的IPTG，并在37 ℃、180 r ·min^-1下表达5 h，离心收集细菌进行超声破碎。将重组蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，用SDS-PAGE蛋白电泳对纯化后的PCV4 Cap重组蛋白进行验证。

1.5 PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA方法的建立与优化

参照之前研究建立的ELISA方法中的孵育条件^[20]，使用方阵法确定抗原包被浓度和血清稀释倍数。将纯化的PCV4 Cap重组蛋白从3 μg ·mL^-1倍比稀释至0.375 μg ·mL^-1包被96孔酶标板，同时按1 ∶50、1 ∶100和1 ∶200稀释之前建立的PCV4 Rep间接ELISA方法检测的阴、阳性血清。根据阳性血清OD_{450 nm}值/阴性血清OD_{450 nm}值的比值(P/N值)，以P/N值最大的条件作为最佳反应条件。确定最佳抗原包被浓度及血清稀释倍数后，将酶标二抗进行1 ∶250、1 ∶500和1 ∶1 000稀释，选取P/N值最大的酶标二抗浓度为最佳反应浓度。

1.6 临界值的确定

为确定ELISA的临界值，取89份经定量PCR和PCV4 Rep-ELISA检测均为阴性的保育猪血清作为阴性血清样品，与阳性对照血清同时进行ELISA检测，计算阴性血清平均S/P值(阴性血清样品OD_{450 nm}值/阳性对照OD_{450 nm}值)和标准偏差(s)。临界值=阴性血清平均S/P值+3 s。

1.7 交叉反应分析

采用建立的PCV4 Cap-ELISA方法对PCV2、PCV3、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的阳性血清进行检测，以评估ELISA的特异性。

1.8 重复性试验

为了评估PCV4 Cap-ELISA的批内重复性，取4份不同抗体水平的阳性血清和4份阴性血清用同一批次制备的蛋白包被板在3个不同的时间点分别进行检测。为了评估PCV4 Cap-ELISA的批间重复性，取4份不同抗体水平的阳性血清和4份阴性血清用三块不同的抗原包被板进行检测。分别计算每份血清样品平均OD_{450 nm}值(x)和标准偏差(s)，变异系数(CV)=(s/x)×100%。

1.9 与Rep-ELISA的结果对比分析

本文中建立的Cap-ELISA方法与之前建立的Rep-ELISA方法共同检测血清845份，其中母猪352份，仔猪149份，保育猪125份，育肥猪219份。将Cap-ELISA方法与Rep-ELISA方法检测结果进行对比分析，以评定两种方法的符合率。

2 结果 2.1 原核表达质粒的鉴定

使用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ对pET28a-PCV4Cap重组质粒进行双酶切鉴定，获得690 bp的目的片段和5 327 bp的pET-28a载体片段(图 1)。说明重组表达质粒pET28a-PCV4Cap构建成功。

2.2 重组蛋白的表达与纯化

SDS-PAGE结果显示(图 2)，PCV4 Cap重组蛋白在大肠杆菌表达系统中为可溶性表达，在约32 ku处出现特异性条带。

2.3 PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA方法的优化

使用方阵法确定抗原包被浓度和血清稀释倍数。结果显示，当抗原以1.5 μg ·mL^-1进行包被，血清样本100倍稀释时得到最大P/N值。以此为条件，当酶标二抗以1 ∶250、1 ∶500和1 ∶1 000稀释时P/N值分别为26.467、18.459和9.698，因此选用1 ∶250作为最佳二抗稀释倍数。将上述条件作为临床血清样本检测的最终条件。

2.4 临界值的确定

采用本研究建立的Cap-ELISA方法对89份阴性血清样品进行检测，计算得出其平均S/P值为0.16，标准偏差为0.031 5。因此将Cap-ELISA临界值设为0.25。即当S/P值≥0.25时判定为阳性，S/P值＜0.25时判定为阴性。

2.5 交叉反应分析

采用建立的PCV4 Cap-ELISA方法同时检测PCV4和PCV2、PCV3、CSFV、PRV、PRRSV的阳性血清，结果显示，除PCV4阳性血清外，所有血清S/P值均小于临界值0.25，表明本抗原与其他常见猪病毒阳性血清无交叉反应，具有良好的特异性。

2.6 重复性试验

用建立的Cap-ELISA方法对4份不同抗体水平的阳性血清和4份阴性血清分别进行批内和批间重复性试验。结果表明，批内变异系数为2.91%~6.26%，批间变异系数为3.90%~8.33%，均小于10%，证明本研究建立的Cap-ELISA方法具有良好的重复性。

2.7 临床血清样品

我国18个省区中有17个省区的猪群可检测到PCV4抗体(表 1)，PCV4总阳性率为34.94%。母猪血清阳性率为59.95%，育肥猪阳性率为31.64%，仔猪和保育猪阳性率分别为21.14%和4.20%(图 3)。

2.8 与Rep-ELISA的结果对比分析

在Rep-ELISA和Cap-ELISA共同检测的845份血清样本中(表 2)，PCV4 Cap蛋白检测阳性的血清共269份，总阳性率为31.83%，平均S/P值为0.586；PCV4 Rep蛋白检测为阳性的血清共296份，总阳性率为35.03%，平均S/P值为0.462。以PCV4 Rep抗体检测试剂盒检测结果为标准计算，结果一致的血清样本有700份，两种检测方式总符合率为82.84%。其中母猪符合率为81.25%，育肥猪75.34%，仔猪85.91%，保育猪最高，为96.80%(图 4)。

3 讨论

基于本研究建立的PCV4 Cap间接ELISA方法对我国18个省份进行了PCV4血清学调查，其中有17个省检测出PCV4抗体。山西省采集的59份血清样本来自同一猪场，其中包括30份母猪血清和29份仔猪血清。推测山西省未检出PCV4阳性样本的原因是采集的样本数量较少或来源局限，此检测结果也与课题组之前报道的PCV4 Rep间接ELISA检测结果完全符合。本研究调查的中国2298份血清样本中，PCV4总阳性率为34.94%，PCV4抗体可在多个阶段的猪群中检测到，其中母猪血清阳性率为59.95%，育肥猪阳性率为31.64%，仔猪和保育猪阳性率分别为21.14%和4.20%。在各阶段猪群中，仔猪阳性率较高可能是因为母源抗体的存在。保育猪PCV4抗体阳性率大幅降低，仅为4.20%，这可能是仔猪阶段高水平的母源抗体在保育阶段大幅下降，导致其低阳性率。母猪和育肥猪的高阳性率表明PCV4感染可能主要发生在育肥猪中，随着日龄的增长，在母猪阶段大幅增加。

本研究建立的PCV4 Cap-ELISA方法与之前建立的PCV4 Rep-ELISA方法^[20]共同检测845份血清，其中Cap蛋白检测总阳性率为31.83%，Rep蛋白检测总阳性率为35.03%。检测结果一致的血清样本占82.84%。这表明我们建立的两种方法一致性高，具有较强的可信度。两种方法检测PCV4在各阶段猪群中的阳性率变化规律一致，呈现从仔猪到保育猪阶段逐渐降低，随后在育肥猪阶段开始上升，母猪阶段达到最高。从抗体消长规律来分析，两种方法都说明猪群感染PCV4主要在育肥猪和母猪阶段。研究表明Cap蛋白抗体阳性率与Rep蛋白抗体阳性率相当，少量阳性样本检测结果不一致的样品主要集中在育肥猪阶段，这也是猪群感染PCV4的初期。Rep-ELISA比Cap-ELISA检测此阶段样品的阳性率更高，分别为33.33%和23.29%，推测猪群感染PCV4后，机体针对Rep蛋白产生抗体时间更早，这可能与病毒感染早期复制相关的Rep蛋白的表达量更高有关。两种方法共同检测845份血清样本，Cap蛋白抗体阳性的血清共269份，平均S/P值为0.586，其中S/P值1.0以上的血清30份且平均S/P值为2.094；Rep蛋白抗体阳性的血清共296份，平均S/P值为0.462，其中S/P值1.0以上的血清15份且平均S/P值为1.558。Cap蛋白抗体在阳性率更低的情况下，S/P值1.0以上的血清数及其平均抗体S/P值反而明显高于Rep蛋白抗体，推测机体对Cap蛋白产生的体液免疫反应更强，这可能与Cap蛋白是病毒表面结构蛋白从而具有更强的抗原性有关。基于这些分析可以解释为何Cap蛋白检测与Rep蛋白出现少量结果不一致的情况。总而言之，不论是课题组之前研究中建立的PCV4 Rep间接ELISA方法，还是本研究建立的PCV4 Cap间接ELISA方法，其PCV4血清学调查的阳性率都远高于之前Lian等^[21]和Hu等^[22]对江苏省和江西省的PCV4血清学调查，这可能是由于采集样本的年龄阶段不同导致的，在本研究中，采用建立的方法检测保育猪阳性率仅为4.20%。同时本研究采集样本的范围更广，样本量更多，这些因素也可能导致阳性率有较大差异。

随着PCV4在全球的流行越来越广泛，并且呈现跨物种传播和混合感染的特征，又有研究表明PCV4可能具有致病性^[19]，因此迫切的需要建立一种PCV4的检测方法。ELISA是一种高通量的、快速的、低成本的检测方法，目前，还未有商品化的试剂盒用于检测PCV4抗体。本研究建立了PCV4 Cap间接ELISA方法，并采用建立的ELISA方法对中国18个省份的不同阶段的猪群进行了血清流行病学调查。该方法特异性高，重复性好，与之前建立的PCV4 Rep间接ELISA方法具有较高的符合率，对PCV4的ELISA商品化试剂盒的开发具有很大的参考意义。同时，本研究有助于更深入的了解目前PCV4在我国的流行情况以及在猪群中的感染和免疫应答规律，从而为应对其潜在的疫病风险和建立有效的防控方案提供理论依据。

4 结论

成功建立了PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法，利用该方法对中国18个省份的猪群进行PCV4血清流行病学调查，结果表明PCV4在猪群中感染普遍，且主要感染阶段为育肥猪和母猪。本研究进一步提供了PCV4在我国的最新血清流行病学信息，有助于了解其感染规律和应对其潜在的疫病风险。