2. 赣州绿林湾农牧有限公司，赣州 341103
, ZHAN Yanbo1, LIAO Guanxiang1, CHEN Xinfeng2, ZHANG Jian1, LI Yanjiao1, OUYANG Kehui1, QIU Qinghua1
2. Ganzhou Lülinwan Agriculture and Animal Husbandry Co. Ltd, Ganzhou 341103, China
随着动物营养研究方法和检测技术的深入发展，有关反刍动物后肠道的研究报道逐渐增加[1-3]。后肠道的微生物，如细菌、真菌会将未消化的营养物质进行发酵产生挥发性脂肪酸(VFA)和氨态氮(NH3-N)[4]。研究日粮营养物质在后肠道的消化情况通常需要获取后肠道内容物，一般可采用瘘管或者屠宰，但这两种方法对动物伤害较大[5]。国外有研究发现，奶牛粪便中的异丁酸含量可以作为后肠道发酵特性的标记物[6]。粪便样品容易获取、可重复强，并且对动物无伤害。因此，可以采用粪便样品间接指示后肠道的发酵特性。
赖氨酸是反刍动物主要的限制性氨基酸之一，与蛋氨酸一起被认为是以玉米为基础的奶牛日粮的第一限制性氨基酸[7]。在玉米-豆粕型和玉米-棉籽粕型饲粮的研究中均发现，添加过瘤胃赖氨酸可以提高反刍动物的生长性能、屠宰性能、肉品质，同时改善氮平衡和机体健康[8-10]。基于日粮、微生物和宿主生产性能三者之间的密切相关性[11-12]，可否通过改善发酵环境、促进微生物生长繁殖最终达到合成更多宿主所需营养物质的目的呢？在体外发酵试验条件下，有研究人员发现，添加谷氨酸或精氨酸能提高瘤胃发酵液的pH和微生物蛋白含量[13]，添加赖氨酸同样能提高瘤胃发酵液的pH，并且增加总VFA含量[14]。体内试验发现，添加0.20%赖氨酸可以提高瘤胃微生物的丰富度并改变部分菌属的相对丰度[15]。然而，上述报导均研究的是添加氨基酸对瘤胃发酵和微生物群落组成的影响，而添加赖氨酸对后肠道的发酵参数和微生物菌群结构影响如何，目前尚无报道。为此，本试验在上述体外和体内研究的基础上，进一步探究饲粮中添加赖氨酸对粪便发酵参数和微生物菌群结构的影响，以期为赖氨酸在反刍动物生产中的应用评估提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物和试验设计试验选取4头健康、体重相近((336±17)kg)、安装瘤胃瘘管的锦江牛，随机分为两组(对照组和处理组)，每组2头，采用有重复的2×2拉丁方设计。对照组(C)饲喂基础饲粮，处理组(T)在基础饲粮中额外添加0.20%的赖氨酸(畜禽用赖氨酸盐酸盐，饲料级98.5%)，添加剂量参照韦肖等[14]的研究。基础饲粮组成如下：玉米10.2%，豆粕3.6%，棉籽粕3.4%，麦麸1.4%，稻草80.0%，食盐0.5%，石粉0.3%，磷酸氢钙0.1%，预混料0.5%；所含营养成分如下：干物质88.2%，粗蛋白7.3%，综合净能5.9 MJ·kg-1，中性洗涤纤维60.0%，酸性洗涤纤维35.7%。试验全期共30 d，分2期进行，每期15 d，每期前10 d为预试期(适应期)，后5 d为正试期(采样期)。试验牛单栏饲养，自由采食，每天提供充足、新鲜、清洁的饮水。试验期间所有试验牛健康状况良好。
1.2 样品采集和前处理于采样期每天6点、12点和18点采用直肠取粪法收集粪便30 g左右(弃去前段50 g左右)，每个时间点采集的粪便样品均保存于－80 ℃冰箱。采样期结束后，将每头牛所有采样时间点的粪样在室温下解冻后均匀混合成一个样品，作为该个体的代表性样品。用于粪便发酵参数检测的样品通过蒸馏水溶解浸提制得溶液，具体操作是将5 g粪便与等量的蒸馏水充分溶解得到浸提液，立即采用便携式pH计测定pH；将浸提液在2 000×g转速下离心15 min得到上清液[16]，该上清液即为检测VFA和NH3-N的原液。用于DNA提取的粪便装于冻存管中，保存于－80 ℃冰箱。
1.3 测定指标及方法粪便的发酵参数包括pH、NH3-N和VFA，其中pH为混样后制得浸提液的pH，NH3-N采用苯酚-次氯酸钠比色法[17]，VFA采用基于峰面积的气相色谱法[18]。
粪便DNA的提取采用细菌DNA提取试剂盒，方法参照说明书严格执行。经过质量检测、纯化后的PCR产物送至生物科技公司进行V3-V4区的双尾测序，原始下机数据在QIIME 2平台完成。数据采用PEAR软件(v0.9.6)进行过滤、拼接，去除质量评分低于20，含有模糊碱基或与引物序列和条形码不完全匹配的序列；拼接时最小重叠区设置为10 bp，允许的最大错配率为0.10[19]。拼接后使用VSEARCH(v2.7.1)软件去除长度短于250 bp或者长于500 bp的序列，根据Gold Database数据库用UCHIME方法比对去除嵌合体序列。采用USEARCH(v10.0.240)软件对优质序列进行降噪后得到ASV信息。每个ASV对应的物种分类信息通过与细菌SILVA 132数据库比对确定，置信度阈值设定为0.70；同时在门和属水平注释其物种信息，由此得到每个样品各微生物的相对丰度。微生物α多样性通过QIIME 2平台基于ASV信息估算得到，衡量指标包括Chao 1、observed species、PD whole tree、Shannon index和Simpson index，其中前两个表示的是物种的丰富度，后三个展现的是物种的均匀度。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)使用R(v3.6.0)软件分析绘图。
1.4 统计分析所有数据采用SPSS软件里面的一般线性模型进行分析，赖氨酸处理为固定效应，时期和个体为随机效应，各检测指标为因变量。将P＜0.05定义为差异显著，P＞0.05表示差异不显著。
2 结果 2.1 粪便发酵参数饲粮中添加赖氨酸对肉牛粪便发酵参数的影响列于表 1。添加赖氨酸显著提高了粪便中异丁酸、异戊酸和支链挥发性脂肪酸的含量(P＜0.05)，对粪便pH、NH3-N、其他单一VFA、总VFA含量和所有单一VFA占比均没有显著影响(P＞0.05)。
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表 1 饲粮添加赖氨酸对肉牛粪便发酵参数的影响 Table 1 Effect of dietary lysine supplementation on fecal fermentation parameters of beef cattle |
表 2表示的是饲粮添加赖氨酸对肉牛粪便微生物α多样性的影响。添加赖氨酸对粪便微生物多样性中的Chao1、Observed species、PD whole tree、Shannon index和Simpson index均没有显著影响(P＞0.05)。
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表 2 饲粮添加赖氨酸对肉牛粪便微生物α多样性的影响 Table 2 Effect of dietary lysine supplementation on fecal microbial alpha diversity of beef cattle |
主坐标分析(PCoA，图 1)发现两组间有明显的重合，相似性分析(ANOSIM)显示两组间的P值为0.972，说明饲粮添加赖氨酸对肉牛粪便微生物群落结构无显著影响。
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图 1 粪便微生物基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA) Fig. 1 Principal coordinates analysis (PCoA) based on Bray-Curtis distance of fecal microbes |
饲粮添加赖氨酸对粪便微生物门和属水平物种相对丰度的影响分别列于表 3和表 4。在粪便微生物门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)的相对丰度位列前三，分别占据53.26%、36.92%和8.04%。添加赖氨酸对粪便微生物门水平上相对丰度大于0.1%的物种均没有显著影响(P＞0.05)。
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表 3 饲粮添加赖氨酸对肉牛粪便微生物门水平相对丰度(>0.1%)的影响 Table 3 Effect of dietary lysine supplementation on fecal bacterial composition of beef cattle at the level of phylum (relative abundance>0.1%) |
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表 4 饲粮添加赖氨酸对肉牛粪便微生物属水平相对丰度(>0.5%)的影响 Table 4 Effect of dietary lysine supplementation on fecal bacterial composition of beef cattle at the level of genus (relative abundance>0.5%) |
在粪便微生物属水平上，理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae RC9 gut group)和UCG-005的相对丰度最高，分别占据11.63%和10.55%。添加赖氨酸显著提高了粪便中毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae NK4A136 group)的相对丰度，降低了克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae R-7 group)的相对丰度(P＜0.05)。
3 讨论后肠道与瘤胃在将碳水化合物发酵生成VFA时有许多相似之处[4]，粪便中的发酵参数可为后肠道的发酵情况提供参考，研究粪便中的发酵参数可以间接反映反刍动物对日粮中营养物质的利用效率。本试验发现，饲粮中添加赖氨酸显著提高了粪便中支链VFA的含量，这是由于支链VFA主要来源于蛋白质的发酵[20]，而赖氨酸本身可以作为一种氮源(含氮量约19%)被后肠道微生物降解后生成支链VFA。已有研究发现，添加相同比例的赖氨酸并未对瘤胃中的支链VFA含量造成影响[15]，说明后肠道和瘤胃对营养物质的发酵存在一定差异，这种差异可能是瘤胃微生物和后肠道微生物群落结构差异引起的，也有可能是赖氨酸的补充改变了后肠道的发酵底物导致的。此外，添加赖氨酸没有对粪便中其他VFA含量或比例造成显著影响，说明饲粮中赖氨酸的添加并未改变发酵模式和发酵效率。
微生物α多样性指数可用来描述单一样品或混合样品的群落丰富度和均匀度，其中Chao 1和Observed species表示的是群落的丰富度，而PD whole tree和Shannon index表示的是群落的均匀度[21-22]。在本试验中，赖氨酸的添加没有显著改变粪便微生物群落的丰富度，对均匀度也没有显著影响，说明饲粮中添加赖氨酸不会显著改变粪便中微生物的多样性，这与主坐标分析和相似性分析的结果一致。在瘤胃微生物的物种组成中，拟杆菌门的相对丰度最高，厚壁菌门次之，而在粪便微生物的组成成分中，厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度依次降低[16, 23-24]，本试验发现了类似的结果，这是由于瘤胃和后肠道的发酵底物存在差异。疣微菌门广泛分布于土壤和水生环境中[25-26]，在动物粪便中也有分布[27-28]。本试验发现，粪便中的疣微菌门相对丰度高达8%，远高于肉牛瘤胃中的4%和奶牛粪便中的1%[15, 27]，这可能是由于日粮组成(精粗比、饲粮原料等)差异造成的。克里斯滕森菌科R-7群可利用糖类生成丁酸，增强机体抗炎症能力[29]。本试验发现，添加赖氨酸降低了粪便中克里斯滕森菌科R-7群的相对丰度，这与处理组中丁酸比例在数值上较低相对应。然而，相同试验条件下的克里斯滕森菌科R-7群在瘤胃中的相对丰度[15]与粪便中的趋势相反，暗示该属的相对丰度与所处的生态位可能有一定的关系，但具体关联性仍需进一步探究。毛螺菌科(Lachnospiraceae)可产生纤维素酶，加速纤维物质在肠道中的降解[30]，是一种潜在的有益肠道菌。添加赖氨酸后，粪便中毛螺菌科NK4A136群的相对丰度提高，暗示赖氨酸可以提高后肠道纤维物质的降解，这一点也可以从总VFA含量在数值上较高间接看出。
4 结论饲粮添加0.20%赖氨酸可以提高锦江牛粪便中异丁酸、异戊酸和支链挥发性脂肪酸的含量，同时提高粪便中毛螺菌科NK4A136群的相对丰度，降低克里斯滕森菌科R-7群的相对丰度。这些结果提示，饲粮添加0.20%赖氨酸会影响锦江牛粪便的发酵特性和部分菌属的相对丰度。
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(编辑 范子娟)