长期以来绵羊产羔数性状主要集中在细胞核染色体基因遗传效应领域，细胞核外的线粒体基因遗传效应研究则较少。研究报道猪产仔数不仅与卵母细胞数量高度相关，而且与线粒体DNA多态性[1]及线粒体tRNA-Lys变异显著相关[2]。本团队前期研究发现小尾寒羊线粒体tRNA-Lys基因(T7719G)变异与产羔数显著相关(P＜0.05)[3]。颗粒细胞是卵泡的重要组成成分，可分泌多种卵泡发育的所需因子调控卵母细胞的生长、分化和成熟[4-6]，其生理功能直接影响卵泡的发育和闭锁。绵羊一生中大约有106个卵泡，而大部分的卵泡会在体内发生闭锁，丧失排卵和激素释放的功能[7]，引起卵泡闭锁的主要原因是颗粒细胞的凋亡[8]。可见，线粒体tRNA-Lys基因(T7719G)变异可能通过调控颗粒细胞凋亡进而影响绵羊产羔数。
线粒体是细胞核外具有自身DNA(mtDNA)的细胞器，mtDNA编码的多肽是氧化磷酸化复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的组成成分，因此，mtDNA对于细胞呼吸和能量产生非常重要[9-10]。研究报道mt-tRNA突变会影响二级结构、稳态水平[11]，进而导致线粒体蛋白合成及呼吸链缺陷，同时引起mt-tRNA分子成熟不正常、降低与同源氨基酸结合及识别相应密码子的能力[12-13]。很多研究报道mt-tRNA突变不仅导致自身稳态和氨酰化水平降低，同时引发线粒体疾病。如线粒体肌病脑病伴乳酸中毒及中风样发作疾病杂交细胞中mt-tRNALeu(UUR)和氨酰化作用均降低50%以上[14-15]。研究表明人线粒体tRNA突变导致氧气消耗速率降低、呼吸复合物酶活性和ATP水平降低、膜电位改变、活性氧(ROS)水平升高，导致线粒体功能缺陷[16-17]，同时引起细胞凋亡[18]。本团队前期研究发现，线粒体tRNA-Lys(T7719G)变异影响绵羊颗粒细胞凋亡，其生理机制尚不清楚。为此，本研究开展线粒体tRNA-Lys(T7719G)基因变异对绵羊颗粒细胞生理功能及其分子机制的影响研究，为线粒体基因变异与细胞生理功能关系研究提供基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物卵巢来源于河北省保定市瑞丽屠宰场。屠宰后取卵巢组织用温生理盐水冲洗并用75%酒精喷洒消毒后，放于含有1%双抗和37 ℃生理盐水的保温壶中，在4 h内送至实验室进行后续试验。
1.2 引物设计根据绵羊线粒体基因组序列(GenBank：AF010406)，设计扩增含有tRNA-Lys(T7719G)位点序列的引物，引物序列：上游引物：5′-CTACGGTCAATGCT CAGAA-3′；下游引物：5′-GTTGTGGTAGAAGTTGTGTT-3′。该引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
1.3 组织采集与DNA提取按照组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书进行DNA提取，通过紫外分光光度计测定DNA样品在260 nm、280 nm处的OD值，计算DNA含量和OD260 nm/OD280 nm的比值，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
1.4 PCR测序检测变异PCR扩增反应体系(25 μL)：Mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 13.2 μL，模板DNA 1 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃总延伸5 min。使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其中电泳电压为100 V，电流为100 mA，时间为30 min。利用PCR产物进行测序，分析鉴定基因型。测序结果通过DNAMAN软件对其数据进行拼接，运用Oligo 7 Primer Analysis Software将试验绵羊序列与绵羊线粒体基因组标准序列(GenBank：AF010406)进行比对分析。
1.5 颗粒细胞分离培养选取G、T基因型母羊各3只，采集双侧卵巢并使用生理盐水、75%酒精清洗，切割适当大小卵泡并在超净台中收集卵泡液，加入10%胎牛血清、1%双抗和DMEM细胞培养基，将不同基因型每只母羊双侧卵巢颗粒细胞在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h后观察细胞贴壁情况并进行后续试验。
1.6 细胞检测1.6.1 线粒体tRNA稳态及氨酰化水平检测 使用AngleGene公司线粒体分离试剂盒进行线粒体分离，TRIzol® Plus RNA纯化试剂盒进行RNA提取。使用的地高辛标记的线粒体tRNA-Lys以及核基因编码的线粒体5S RNA寡核苷酸探针相关信息如表 1所示。参考文献[19]进行转膜和杂交试验。
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表 1 探针信息 Table 1 Probes information |
1.6.2 颗粒细胞ATP水平检测 使用发光法细胞活力检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)测定细胞的ATP产生水平，检测其荧光信号，记录试验数据。
1.6.3 线粒体膜电位测定 应用JC-10荧光染料(Abcam)并结合流式细胞术检测细胞线粒体膜电位水平。按照JC-10检测试剂盒说明操作，上镜检测，红绿荧光强度比代表线粒体膜电位水平。
1.6.4 线粒体耗氧量(OCR)和胞外产酸能力(ECAR)测定 将不同基因型的颗粒细胞分别以每孔约1.8×104个铺板到细胞培养微孔板中，于室温1 h后置于37 ℃细胞培养箱中培养过夜。加入1.5 μmol ·L-1寡霉素、0.5 μmol ·L-1羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙、复合体Ⅰ抑制剂鱼藤酮(0.5 μmol ·L-1)和复合体Ⅲ抑制剂抗霉素A(0.5 μmol ·L-1)，通过CyQuANT® Cell Proliferation Assay Kit检测孔中的细胞数。通过计算得到不同基因型颗粒细胞的基础OCR、ATP偶联OCR、质子漏OCR、最大OCR、缓冲OCR、非线粒体OCR的6个参数。通过检测培养基pH变化从而反映颗粒细胞ECAR，分别加入葡萄糖、寡霉素和2-脱氧葡萄糖，通过CyQuANT® Cell Proliferation Assay Kit检测孔中的细胞数，得到细胞的基础糖酵解能力、细胞的最大糖酵解能力、非糖酵解产酸值。
1.6.5 呼吸复合物酶活性检测 采用GENMED试剂盒检测动物线粒体呼吸酶复合物Ⅰ、复合物Ⅱ、复合物Ⅲ、复合物Ⅳ、复合物Ⅴ活性。使用酶标仪读取光吸收值。
1.6.6 细胞活性氧(ROS)含量检测 取出培养好的颗粒细胞，PBS清洗2~3次重悬细胞，加入1 mL含有100 μmol ·L-1 DCFH-DA的PBS，室温培养20 min，在激光共聚焦显微镜下观察细胞形态，拍照。
1.6.7 qRT-PCR测定线粒体基因组拷贝数 根据绵羊线粒体基因组序列(GenBank：AF010406.1)，采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件设计覆盖绵羊线粒体基因组序列引物，引物序列如表 2所示，qRT-PCR反应体系：SDW 8.0 μL，Power SYBR® Green Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA1.0 μL；反应程序：95℃1 min；95℃15 s，63 ℃ 25 s，55 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。根据mtDNA特异引物用于定量颗粒细胞的mtDNA含量，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基因，各个基因的相对表达水平以2-△△Ct进行统计分析，通过计算线粒体DNA与核DNA的丰度比值(mtDNA/nDNA)来反映样品的mtDNA拷贝数。
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表 2 引物序列信息 Table 2 Primers sequence information |
1.6.8 Western blot检测编码蛋白表达水平 使用线粒体分离试剂盒进行线粒体分离，参考BCA蛋白定量试剂盒中实验说明书，对所制取的13个蛋白(ND1、ND2、ND4、ND5、DN6、ND4L、COI、COII、COIII、Ctyb、ATP6、ATP8、COX IV)。参考文献[19]的Western blot方法检测颗粒细胞内线粒体编码相关蛋白表达水平。其中一抗为山羊抗鼠、二抗为山羊抗兔。
1.7 数据分析试验结果均为重复3次的数据，以“平均数±标准差”表示，使用SPSS 23.0统计分析软件进行单因素方差分析，对均值进行差异性比较，*P＜0.05为差异显著，**P＜0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 线粒体基因组拷贝数为明确不同基因型颗粒细胞的线粒体DNA拷贝数，采用荧光定量PCR检测每株细胞线粒体拷贝数。如图 1所示，G基因型颗粒细胞线粒体拷贝数与T基因型差异极显著(P＜0.01)，为T基因型细胞的1.78倍。
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图 1 线粒体细胞系的线粒体DNA拷贝数比较 Fig. 1 Comparison of mitochondrial DNA copy number in mitochondrial cell lines |
提取颗粒细胞中线粒体蛋白，检测其中线粒体呼吸酶复合物Ⅰ、复合物Ⅱ、复合物Ⅲ、复合物Ⅳ、复合物Ⅴ的表达水平。结果表明G基因型细胞线粒体复合物Ⅲ活性是T型细胞的1.25倍(P＜0.05)，两组间差异显著，T基因型细胞与G型细胞复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的活性均无显著差异(图 2)，表明G基因型细胞氧化呼吸功能增强。
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Ⅰ~Ⅴ.线粒体呼吸酶复合物Ⅰ、复合物Ⅱ、复合物Ⅲ、复合物Ⅳ、复合物Ⅴ Ⅰ-Ⅴ. Mitochondrial respiratory enzyme complex Ⅰ, complexⅡ, complexⅢ, complexⅣ, complexⅤ 图 2 线粒体tRNA-Lys变异对线粒体呼吸复合物酶活性检测 Fig. 2 Detection of mitochondrial tRNA-Lys variation on mitochondrial respiratory enzyme complex activity |
检测G、T两种基因型颗粒细胞分析氧耗速率的差异，如图 3所示，携带G基因型颗粒细胞与T基因型相比基础OCR、ATP偶联OCR分别提高了6.84%(P＜0.05)和15.46%(P＜0.01)，而最大OCR、缓冲OCR分别降低了14.75%(P＜0.01)、32.82%(P＜0.01)，质子漏OCR和非线粒体OCR并没有显著差异(P>0.05)。
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A.颗粒细胞在不同抑制剂处理下的OCR曲线；B.分析不同基因型颗粒细胞的6个参数，包括基础OCR、ATP偶联OCR、质子漏OCR、最大OCR、缓冲OCR、非线粒体OCR，这些参数可用于评估细胞线粒体功能的状态和特征 A.OCR curve of granulosa cells under different inhibitors treatment; B. Analysis of 6 parameters of granule cells with different genotypes, including basal OCR, ATP conjugated OCR, proton leak OCR, maximum OCR, buffer OCR, non-mitochondrial OCR, which can be used to assess the status and characteristics of cell mitochondrial function 图 3 颗粒细胞耗氧量检测 Fig. 3 Granulocyte oxygen consumption assay |
胞外酸化速率可以反映糖酵解水平。对不同基因型分组处理的细胞加入葡萄糖、寡霉素和2-DG，检测基础糖酵解能力、最大糖酵解能力和糖酵解潜力部分。结果表明，G基因型糖酵解能力显著降低(P＜0.01)(图 4)，起到保护线粒体的作用。
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A.不同抑制剂处理的颗粒细胞ECAR曲线; B.不同基因型颗粒细胞糖酵解能力 A. ECAR curve of granule cells treated with different inhibitors; B. Glycolytic capacity of granule cells with different genotypes 图 4 颗粒细胞胞外产酸能力检测 Fig. 4 Detection of extracellular acid production capacity of granulosa cells |
氧化呼吸链复合体亚基下调会抑制线粒体氧化呼吸链并发生障碍，从而会增加ROS的产生，因此检测G、T两种基因型颗粒细胞ROS的生成。结果表明，G基因型细胞ROS水平较T基因型细胞显著降低，平均降低了34%(图 5)，表现出更好的抗氧化作用。
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图 5 ROS产量检测 Fig. 5 ROS yield detection |
为检测不同基因型氧化磷酸化能力，采用荧光素/荧光素酶测定法检测ATP产量。如图 6所示，G基因型组ATP含量明显上升，为T基因型的1.25倍(P＜0.05)。
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图 6 荧光素酶测定法检测ATP产量 Fig. 6 ATP production detected by luciferase assay |
线粒体膜电位的改变往往是细胞凋亡的征兆。过量产生的ROS和线粒体膜电位的下降触发线粒体通透性转换孔开放，最终诱导细胞凋亡。JC-10染色后检测细胞荧光值，观察G、T两种基因型线粒体膜电位的变化。结果表明，G基因型细胞线粒体膜电位为T基因型的1.24倍(P＜0.01，图 7)。
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图 7 膜电位的检测 Fig. 7 Detection of membrane potential |
为确定T7719G变异是否对线粒体tRNA-Lys的代谢产生影响，提取G、T两种基因型的线粒体tRNA，与地高辛标记的线粒体tRNA-Lys以及核基因编码的线粒体5S RNA寡核苷酸探针进行Northern杂交。比较不同基因型颗粒细胞tRNA-Lys的稳态水平。如图 8所示，以细胞自身tRNA-5S作为参照，G基因型颗粒细胞较T基因型tRNA-Lys总量显著提高50%(P＜0.01)。
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A.线粒体tRNA-Lys的Northern blot分析。G、T线粒体RNA经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印，使用tRNA-Lys和tRNA-5S探针杂交，其中1~3为G基因型，4~6为T基因型。B.线粒体tRNA稳态表达水平的定量。以tRNA-5S为内参，对tRNA-Lys的总量进行标准化 A. Northern blot analysis of mitochondrial tRNA-Lys.G, T mitochondrial RNA was transprinted after polyacrylamide gel electrophoresis and hybridized using tRNA-Lys and tRNA-5S probes, where 1-3 were genotype G and 4-6 were T genotype.B. Quantification of the mitochondrial tRNA steady-state expression levels.The total amount of tRNA-Lys was normalized by using tRNA-5S as the internal reference 图 8 线粒体tRNA表达水平的比较 Fig. 8 Comparison of mitochondrial tRNA expression levels |
氨酰化tRNA与未氨酰化的tRNA经酸性-尿素变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离后，与地高辛标记的线粒体tRNA-Lys寡核苷酸探针进行Northern杂交，根据迁移速度，检测线粒体tRNA氨酰化水平。结果表明，无论是否氨酰化，G基因型细胞在凝胶中的迁移速度明显高于T基因型样品(图 9A)，G基因型细胞氨酰化tRNA-Lys比例较T型细胞提高33.4%(P＜0.01，图 9B)。因此，G型细胞含有赖氨酸的多肽翻译效率可能会提高。
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A.线粒体tRNA-Lys的Northern blot分析。G、T基因型线粒体RNA经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印，使用tRNA-Lys探针杂交，迁移速度较快的2, 4, 6条带为氨酰化tRNA，迁移速度较慢的1, 3, 5条带为未氨酰化的tRNA。B.线粒体tRNA氨酰化水平 A. Northern blot analysis of the mitochondrial tRNA-Lys. After G, T mitochondrial RNA was transprinted by polyacrylamide gel electrophoresis and hybridized using tRNA-Lys probe, 2, 4, 6 bands with faster migration were aminoacylated tRNA, 1, 3, 5 bands with slower migration rate were unaminoacylated tRNA. B. Aminoacylation levels of the mitochondrial tRNA 图 9 线粒体tRNA氨酰化水平检测 Fig. 9 Mitochondrial tRNA aminoacylation level assay |
为了探究蛋白质翻译表达是否与线粒体7719位点的变异相关，提取G、T基因型颗粒细胞蛋白，用Western blot方法检测NADH脱氢酶(复合体I)的ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6亚基；细胞色素C还原酶(复合体Ⅲ)的细胞色素B亚基(CtyB)；细胞色素C氧化酶(复合体Ⅳ)的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚基：COⅠ、COⅡ、COⅢ；ATP合成酶的ATP6、ATP8两个亚基。结果表明(图 10)：以COXⅣ为内参标准，G基因型细胞线粒体编码的蛋白质表达水平均显著升高(P＜0.05)。
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A.Western blot检测线粒体基因编码蛋白表达。样品1~3为T基因型，4~6为GT基因型。B.线粒体基因编码蛋白表达水平比较。以COXⅣ为内参标准，对13个蛋白质表达量进行标准化统计分析比较 A. Expression of proteins encoding by mitochondrion DNA throuhg Western blot. The genotype of sample 1, 2 and 3 were T; The genotype of sample 4, 5 and 6 were G. B. Comparison of expression of proteins encoding by mitochondrion DNA. The expression levels of 13 proteins were analyzed and compared, COXⅣ as the internal reference standard 图 10 线粒体tRNA-Lys变异对线粒体基因编码相关蛋白表达的影响 Fig. 10 The effects of mitochondrial tRNA-Lys variation on expression levels of mtDNA-encoded related proteins |
在蛋白质翻译过程中，线粒体tRNA的D环与氨基酰tRNA合成酶结合，使氨基酸与受体位点连接，很多研究指出线粒体变异与其自身的生理状态有关[19-22]，线粒体功能活性与二级结构的D环和茎环息息相关，因此，D环被认为是线粒体正常功能发挥至关重要的元素之一。D环变异可能导致线粒体功能受损，从而引起多种疾病。因此，了解D环的结构和功能对于阐明线粒体疾病的分子基础和开发有效的治疗策略至关重要。现已证实T7719G变异会导致D环的U变为G[23]，从而影响含有赖氨酸组成的蛋白质合成效率，进而影响一些由上述含有赖氨酸蛋白质调控的表型性状。在本研究中，G基因型颗粒细胞氨酰化tRNA的比例平均提高了33%，维持内环境稳态，改善tRNA的稳定性，使得tRNA-Lys水平提高了50%，进而避免了线粒体蛋白缺陷。表明G型细胞中含有赖氨酸的多肽翻译效率可能会提高。
线粒体是细胞中进行氧化反应并产生能量的主要细胞器，是细胞中的糖、脂质、氨基酸与氧气进行氧化还原反应，进而产生能量的唯一场所[24]。在细胞质基质中进行的糖酵解反应和在线粒体基质中进行的三羧酸循环可以生成多种高能分子，如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及还原型黄素二核苷酸(FADH2)，然后通过氧化磷酸化作用释放能量合成ATP[25]。线粒体tRNA-Lys 7719位点上的变异可以促进细胞产能，特别是线粒体ATP的生成，与T基因型细胞相比提高了25%。线粒体膜电势决定了细胞活力，反映了在氧化磷酸化和电子传递过程中，氢离子泵出线粒体内膜的情况[26]。线粒体跨膜电位的降低是细胞凋亡级联反应中的第一步，会引起线粒体膜通透性的增加，触发凋亡级联反应的凋亡因子增加[27]。本研究中，携带G基因型颗粒细胞的膜电位与对照组相比平均提高了24%，表明线粒体tRNA-Lys变异对线粒体功能起到了调节作用。
当线粒体功能发生障碍时，呼吸链中的氧化磷酸化水平降低，电子在传递过程中的泄漏[28]，尤其是复合体Ⅲ的损伤会造成更多电子的泄漏，伴随着NADH或FADH2的呼吸作用，会生成大量的ROS[29]。作为细胞中重要的活性分子，ROS水平不同对细胞调控结果也不同[30]。在正常生理条件下，ROS作为多种信号通路的信号分子，具有信号刺激的作用，对细胞和机体维持正常功能发挥了重要作用[31]。相反浓度较高时，会氧化损伤DNA导致线粒体DNA断链，干扰转录合成，对细胞造成严重的损伤；同时也会毒害细胞，破坏膜结构，释放细胞色素C导致凋亡[32]。当线粒体中的ROS水平增加，线粒体结构中的脂质物质如线粒体DNA分子，线粒体内、外膜的磷脂分子，线粒体的酶会通过ROS被过氧化导致拷贝数异常，线粒体氧化磷酸化功能受到相应的干扰，引发相应的功能障碍，导致ATP合成水平降低[33]。线粒体功能紊乱的增加反过来又导致自由基的产生增多，继续上述的过程并最终导致细胞和组织的死亡[34]。本研究中，G基因型颗粒细胞与T基因型相比，线粒体复合体Ⅲ活性及相应的编码蛋白表达水平得到改善，ROS的生成量减少，拷贝数增加。当线粒体呼吸链活性被抑制，细胞及机体的活动所需的能量将依赖于糖酵解，当糖酵解途径过度被激活，将会抑制丙酮酸的代谢，从而造成细胞内乳酸大量堆积。本研究中，G基因型变异组的糖酵解速率明显下降，这一现象与前面线粒体膜电位、OCR的结果完全一致。
4 结论本研究初步解析了线粒体tRNA-Lys(T7719G)变异影响绵羊颗粒细胞凋亡的生理机制，即tRNA-Lys(T7719G)变异影响tRNA-Lys稳态和氨酰化水平，影响mtDNA编码的多肽翻译效率，同时引起拷贝数、ATP水平、ROS含量和部分酶活性变化，进而改变线粒体能量代谢功能和细胞凋亡。
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(编辑 郭云雁)