2. 藏猪遗传改良与繁殖工程重点实验室，林芝 860000;
3. 西藏特色农牧资源研发省部共建协同创新中心，林芝 860000
, WANG Haoqi1,2,3, ZE Licuo1,2,3, GAO Yufan1,2,3, ZHANG Feifan1,2,3, ZHANG Jian1,2,3, DUAN Mengqi1,2,3, SHANG Peng1,2,3
, QIANG Bayangzong1,2,3
2. Key Laboratory of Tibetan Pig Genetic Improvement and Reproduction, Linzhi 860000, China;
3. Tibet Collaborative Innovation Center for the Research and Development of Unique Agricultural and Animal Resources, Linzhi 860000, China
西藏自治区是中国典型的高原低氧地区，在这种极端环境下长期居住的生物体，经历了遗传上的适应性变化，包括免疫器官、组织和细胞等方面的发展。特别是在高海拔高寒地区生活的动物种群如藏猪，形成了独特的生存特性[1]。藏猪主要分布在海拔约3 000 m的青藏高原农牧区。由于长期适应高寒高海拔环境，藏猪具有强大的免疫功能、耐低氧、耐低温、适应粗饲料和抗紫外线等特性[2]。然而，尽管已经了解到藏猪具有这些独特的特性，目前仍存在一个关键问题，即为什么藏猪在如此恶劣的高原环境下能够表现出如此卓越的抗逆性和抗病能力。这个问题的答案对于理解高原动物的适应性演化以及免疫系统的功能至关重要。
促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因在免疫反应中扮演着关键的角色，它们可能是解释藏猪抗病能力和适应高原环境的关键因素之一[3-4]。IL-1β基因是一种自然的促炎细胞因子，其在炎症反应中发挥主导作用，同时也参与了机体适应性免疫应答的调控。有研究指出，异常的IL-1β基因信号传导可能与遗传性自身炎症性疾病有关[5]。TNF-α基因主要由Th1型细胞分泌，在细胞免疫应答中扮演着重要的角色[6-8]。IL-6基因则由Th2型细胞产生，在调节体液免疫反应方面发挥重要作用[9]。这些细胞因子在机体内紧密协作，以维持免疫平衡和应对各种感染和疾病。
脂多糖(LPS)，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分，革兰阴性菌在环境中普遍存在，生产活动使用抗生素等药物对其消杀后，其释放出大量的LPS，而LPS对猪可产生广泛的损害，包括发热、炎症反应、组织损伤及生产性能下降等[10-11]。当动物感染LPS时，会触发全身性的免疫反应，导致体内促炎性细胞因子如TNF-α、干扰素-γ、IL-6和IL-1的表达量升高[12-14]，继而引发一系列免疫反应，这些促炎因子的表达情况也反映了动物的抗病能力[15-17]。
本试验以长期生活在林芝地区的藏猪为主要研究对象，以同在此地长期饲养的约克夏猪作为对照参考，通过血液生理指标测定、RT-qPCR技术、一代测序技术及藏猪外周血淋巴细胞的培养、设置不同浓度LPS对照组刺激该原代细胞并检测促炎因子mRNA表达情况等方法，查明藏猪与约克夏猪在血液生理方面的表现差异，进一步探究两者间抗逆性、低氧适应性的具体差异表现，为深入开展藏猪低氧适应性、抗逆性等方面的具体调控机制提供参考。通过比较它们与约克夏猪的差异，有望获得有益的信息，不仅可以为养殖业提供重要的参考，还能对动物的健康管理和免疫调节方面提供有价值的数据。
1 材料与方法 1.1 样品采集试验动物为长期生活在西藏自治区林芝市(海拔2 900 m)的180日龄藏猪(TP，Tibetan pig)和约克夏猪(YY，Yorkshire pig)。随机选取阉割公藏猪(TP)和阉割公约克夏猪(YY)各40头按品种分为两个试验组，分别采集猪外周淋巴血以及新鲜血液快速放入准备好的肝素钠采血管中用于血液生理指标测定及外周血淋巴细胞的培养，并采集耳组织样品，放入含有75%酒精的离心管中，置于－20 ℃冰箱用于SNP的筛选。随机选取藏猪和约克夏猪各8头进行屠宰，使用5 mL的一次性采血针由前腔静脉采集新鲜血液，提取血液RNA，屠宰后采集黄豆样大小的肝脏、脾脏、下颌淋巴结组织放入含有RNA保存液的样品管中，快速放入液氮中速冻，随即－80 ℃保存用于RNA的提取。
1.2 血液生理指标测定使用兽用全自动血液细胞分析仪(mindary，BC-2 006Vet)对待测血样进行测定，所有步骤及注意事项按照该设备说明书规范操作。
1.3 检测不同组织中IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA的表达Trizol法(Thermo，USA)提取血液及组织样本总RNA，琼脂糖凝胶电泳及微量核酸检测仪(Thermo，NanoDrop 2000C)检测RNA样品的质量。快速反转录cDNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司，KR180123)合成cDNA。从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分别下载目的基因IL-1β(登录号：NM_214055.1)、IL-6(登录号：NM_214399.1)、TNF-α(登录号：NM_214022.1)及内参基因β-actin(登录号：AY550069)的mRNA序列，用Primer Premier 5.0软件进行定量引物设计，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，引物信息见表 1。利用RT-qPCR技术对藏猪和大约克猪各8头的脾脏、肝脏、下颌淋巴结和血液组织进行IL-1β、IL-6、TNF-α基因的mRNA的表达情况检测。每个个体样品设置3个重复，检测结果使用2-ΔΔCt法统计。
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表 1 IL-1β、IL-6、TNF-α基因和β-actin基因定量引物信息 Table 1 Quantitative primers information for IL-1β, IL-6, TNF-α and β-actin genes |
登录GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，分别下载猪IL-1β、IL-6、TNF-α基因5′端起始密码子(ATG)上游2 000 bp的DNA序列以及3′端终止密码子(TGA)下游2 000 bp的DNA序列(登录号：NC_010 445.4、NC_010 451.4、NC_010 449.5)。使用Primer Premier 5.0软件设计用于多态性分析的引物，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列和扩增区域见表 2、表 3。
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表 2 5′侧翼区引物信息列表 Table 2 List of primers information in the 5′ flanking region |
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表 3 3′侧翼区引物信息列表 Table 3 List of primers information in the 3′ flanking region |
使用Sanger测序法对IL-1β、IL-6、TNF-α基因各个区域混池产物进行测序，使用SnapGene和Excel软件分别对IL-1β、IL-6、TNF-α基因各个区域测序结果进行分析，筛选SNPs位点。针对所筛选出的SNPs位点进行单个个体扩增测序和基因分型，统计基因型频率与等位基因频率。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载IL-1β、IL-6、TNF-α基因序列，进行转录因子预测，查看SNPs位点突变前后转录因子结合位点的变化。
1.5 藏猪外周血淋巴细胞的分离将采集的新鲜血液放入肝素钠抗凝管内，快速常温运回实验室。加入等量的PBS稀释血液，随后缓慢加入到提前已加入外周血淋巴细胞分离液的离心管中，使血液处于分离液上层，1 000 g离心25~30 min，直至出现明显的四分层现象(从上至下分别为：稀释液+血浆层、淋巴细胞层、分离液层、红细胞+粒细胞层)，收集淋巴细胞，PBS/D-Hanks缓冲液清洗2次，最后加入完全培养基(RPMI 1640+5% FBS+1% PS)重悬细胞。
1.6 RT-qPCR法检测不同浓度LPS刺激下藏猪外周血淋巴细胞促炎因子表达情况以每孔1×106个·cm-2细胞接种至96孔细胞培养板内。设置0、1、10、100 μg·mL-1四个不同浓度LPS的组别，置37 ℃孵育箱培养0、24、36、48、72 h，每个浓度的LPS重复3份，并在0、24、36、48、72 h收集细胞，进行细胞RNA的提取，反转为cDNA，RT-qPCR技术检测促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA水平表达情况。
1.7 统计分析使用IBM SPSS Statisties 26.0软件对数据进行单因素方差分析，使用Sigma Plot 10.0软件绘图。数据结果用“平均值±标准误差”表示，*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)，无标注表示差异不显著(P＞0.05)。
2 结果 2.1 血液生理指标检测结果血液生理指标测定结果如表 4所示，藏猪白细胞数量(WBC)、红细胞数量(RBC)、血红蛋白数量(HGB)、红细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、血小板数量(PLT)和降钙素原(PCT)的数值都相对较高，其中藏猪的平均MCV和PCT显著高于约克夏猪(P＜0.05)，WBC、RBC、HGB、HCT和PLT水平极显著高于约克夏猪(P＜0.01)。
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表 4 藏猪和约克夏猪血液生理指标比对结果 Table 4 Comparison of blood physiological parameters between Tibetan pigs and Yorkshire pigs |
RT-qPCR结果显示(图 1)，IL-1β、IL-6和TNF-α基因在藏猪血液中的相对表达量最高，且均极显著高于约克夏猪(P＜0.01)。在脾脏和肝脏组织中，藏猪的IL-1β、IL-6和TNF-α基因mRNA水平表达量也均极显著高于约克夏猪(P＜0.01)。在下颌淋巴结组织中，藏猪的IL-6基因mRNA水平表达量极显著高于约克夏猪(P＜0.01)，IL-1β和TNF-α基因的表达量显著高于约克夏猪(P＜0.05)。
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图 1 IL-1β、IL-6、TNF-α基因在血液和免疫器官中的mRNA表达量 Fig. 1 mRNA expression of IL-1β, IL-6, and TNF-α genes in blood and immune organs |
2.3.1 IL-1β、IL-6、TNF-α基因突变位点的基因型频率和等位基因频率 由表 5可知，IL-1β基因3′侧翼区共存在5个突变位点，分别为：G690T、C1383G、C1454T、C1480T、A1497G。品种内，上述位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。品种间，G690T、C1383G、C1480T、A1497G位点在藏猪和约克夏猪群体存在极显著差异(P＜0.01)，C1454T位点在藏猪和约克夏猪群体存在显著差异(P＜0.05)。由表 6可知，IL-6基因5′侧翼区和3′侧翼区各发现一个突变位点，分别为：A-72G、C265T。品种内，上述位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。品种间，A-72G位点在藏猪和约克夏猪群体存在极显著差异(P＜0.01)；C265T位点在藏猪和约克夏猪群体差异不显著(P>0.05)。由表 7可知，TNF-α基因3′侧翼区未发现突变位点，5′侧翼区发现一个突变位点，为：G-1017A。品种内，该位点符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。品种间，该位点在藏猪和约克夏猪群体差异不显著(P＞0.05)。
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表 5 IL-1β基因3′侧翼区SNP位点基因型频率及卡方检验 Table 5 Frequency of genotype at SNP sites in the 3′ flanking region of the IL-1β gene and Chi-Square test |
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表 6 IL-6基因5′侧翼区和3′侧翼区SNP位点基因型频率及卡方检验 Table 6 Frequency of genotype at SNP sites in the 5′ and 3′ flanking regions of the IL-6 gene and Chi-Square test |
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表 7 TNF-α基因5′侧翼区SNP位点基因型频率及卡方检验 Table 7 Frequency of genotype at SNP site in the 5′ flanking region of the TNF-α gene and Chi-Square test |
2.3.2 IL-1β、IL-6、TNF-α基因转录因子预测结果 为进一步探究IL-1β、IL-6、TNF-α基因突变位点前后的转录因子变化情况，将突变位点前后碱基进行转录因子预测(网站：http://jaspar.binf.ku.dk/)。结果显示，IL-1β基因的5个位点、TNF-α基因G-1017A位点突变前后未发生转录因子的变化；IL-6基因A-72G位点突变后，新增了一个转录因子结合位点，为ETS1，同时，在A突变为G之后，造成了转录因子RUNX1和NR2F1的缺失。
2.4 不同浓度LPS对藏猪外周血淋巴细胞及其促炎因子表达情况的影响2.4.1 不同浓度LPS对藏猪外周血淋巴细胞增殖的影响 结果如图 2所示，在0、1 μg·mL-1浓度的LPS刺激下，藏猪外周血淋巴细胞数量呈逐渐上升的趋势。这种上升趋势始于36 h前，并在一段时间后达到了增殖的高峰，随后开始下降；在10 μg·mL-1浓度的LPS刺激下，与前两种情况不同的是，上升趋势在24 h时达到了增殖的高峰，之后开始下降，保持下降趋势；在100 μg·mL-1浓度的LPS刺激下，对淋巴细胞也有一定的增殖效果，在24 h时达到最高峰，随后迅速开始下降。综上，10 μg·mL-1浓度的LPS对藏猪外周血淋巴细胞的增殖效应最为显著。
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* 为显著差异(P＜0.05)，**为极显著差异(P＜0.01) * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates highly significant difference (P<0.01) 图 2 不同浓度LPS对藏猪外周血淋巴IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA表达量的影响 Fig. 2 The impact of different LPS concentrations on the mRNA expression of IL-1β, IL-6, and TNF-α genes in Tibetan pig peripheral blood lymphocytes |
2.4.2 不同浓度LPS对藏猪外周血淋巴IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA表达量的影响 结果如图 2、图 3所示，在未添加LPS的情况下，IL-1β基因mRNA的表达量在24 h时达到最高点，然后逐渐下降，每个时间段都呈现极显著的变化(P＜0.01)。IL-6和TNF-α基因mRNA的表达量在24~48 h内逐渐上升，并在48 h达到峰值，然后逐渐减少。1 μg·mL-1对比0 μg·mL-1浓度LPS刺激下，浓度的LPS刺激下，IL-1β基因mRNA的表达量总体上呈上升趋势，而IL-6和TNF-α基因mRNA的表达量则在一定程度上减少。在10 μg·mL-1浓度的LPS刺激下，IL-1β基因mRNA的表达量总体上也呈上升趋势，与1 μg·mL-1L浓度LPS刺激时的表达量没有明显差异。然而，随着时间的推移，这些基因的表达量逐渐下降，在48~72 h阶段出现急剧下降的情况。在100 μg·mL-1L浓度的LPS刺激下，IL-1β、IL-6和TNF-α基因mRNA的表达量在24 h时达到最高点，显著或极显著高于其他时间点(P＜0.05或P＜0.01)。
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图 3 不同浓度LPS对藏猪外周血淋巴IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA表达量的影响趋势 Fig. 3 Trends in the impact of different LPS concentrations on the mRNA expression of IL-1β, IL-6, and TNF-α genes in Tibetan pig peripheral blood lymphocytes |
血液生理指标能够在一定程度上反映动物机体应对外界恶劣环境的能力[12]，其中WBC和PCT通常被视为常规炎症标志物[18-19]，Minasyan[20]在研究中也强调了血液中的红细胞在机体细胞免疫中的重要作用。Poscablo和Forsberg[21]的研究结果表明，血小板含量高有助于释放更多的炎症介质，进一步招募白细胞。本研究对比了藏猪和约克夏猪两个品种，发现藏猪的WBC、RBC、HGB、HCT和PLT水平极显著高于约克夏猪(P＜0.01)，同时，平均MCV和PCT也在藏猪中显著高于约克夏猪(P＜0.05)。这些生理指标结果为藏猪表现出更强的抗病能力提供了重要的表型依据。由于血液中存在大量的免疫细胞和免疫因子，并通过血液迅速响应外部病原体，与机体免疫稳态密切相关[22]。另外，有研究表明红细胞和血小板的表达以及凝血潜能都受到促炎因子IL-6和IL-1β的调控[23]。因此本研究进一步关注了血液和免疫器官中的促炎因子。RT-qPCR结果表明，IL-1β、IL-6和TNF-α基因在藏猪血液中的相对表达量最高，且均极显著高于约克夏猪(P＜0.01)。这与张敬梅等[11]的研究中提到的抗病力强的地方猪种的关键细胞因子表达量更高的结论相符。其表明藏猪的免疫器官不仅在细胞免疫方面还是在体液免疫方面都具有更强的优势。总的来说，在同一环境中，藏猪表现出更强的炎症控制反应，这可能是其更强抗病能力的原因之一。
有研究结果显示[24-25]，基因多态性差异在个体和品种间导致多样性、基因组进化、药物反应、抗病能力等重要变化。因此，筛选藏猪和约克夏猪IL-1β、IL-6、TNF-α基因的SNPs位点发现，在IL-1β基因3′侧翼区存在5个显著差异突变位点(P＜0.05)；在IL-6基因3′侧翼区的C265T位点(P＜0.05)和5′侧翼区的A-72 G位点(P＜0.01)也表现出显著差异。IL-6基因A-72 G位点突变新增了ETS1转录因子结合位点，并导致了转录因子RUNX1和NR2F1的缺失。ETS1通常与免疫细胞功能有关[26-28]，RUNX1与白血病和肿瘤相关[29-30]，NR2F1则参与肿瘤特异性[31]。这表明IL-6基因的A-72 G位点可能与免疫性和抗病能力密切相关，具有重要的应用潜力。因此，探究藏猪IL-1β、IL-6、TNF-α基因的SNP位点变异为解释其卓越的抗病能力提供了分子基础。
在养猪业实践中，LPS是一种普遍存在于空气、饲料和水中的生物分子，具有炎症性质[32-33]。当单核细胞和巨噬细胞受到LPS刺激后，会刺激淋巴细胞的增殖[34-35]，并释放一系列促炎因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α等，这些因子在机体的先天免疫反应中扮演着关键角色[5, 36-37]。因此本研究在细胞水平，通过不同浓度的LPS刺激，考察了这些基因在藏猪外周血淋巴细胞中的表达情况。研究发现，当LPS浓度为10 μg·mL-1时，对藏猪外周血淋巴细胞的增殖效应最为显著。当LPS浓度为1、10 μg·mL-1时，IL-1β基因作出较明显的应答，而当LPS浓度为100 μg·mL-1时IL-6基因表现出更为强烈的应答。有研究表明[27, 38-40]，在免疫细胞功能中，IL-1β扮演者关键角色，作为促炎反应的核心中介者，它引发了后续的炎症介质如IL-6和TNF-α的激活。因此，在受到LPS刺激后，IL-1β基因的表达量显著高于IL-6、TNF-α。总之，研究结果强调了IL-1β、IL-6在应对LPS干扰方面的显著作用，为进一步探究藏猪的免疫特性提供了重要的理论基础，但还需要进一步研究来阐明具体的影响机制。
4 结论综上所述，血液生理指标结果为藏猪具有更强的抗病能力提供了强有力的表型依据。免疫组织器官中促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的表达情况强调了藏猪在免疫调节方面的优势。此外，在基因多态性的研究结果中，尤其是IL-6基因的A-72 G位点，其突变可能与免疫性和抗病能力密切相关。最后，在藏猪外周血原代淋巴细胞培养试验中，发现IL-1β和IL-6在应对LPS干扰时表现出显著的应答，突出了它们在免疫调控中的关键作用。这一系列研究结果共同揭示了藏猪在免疫特性和抗病能力方面的卓越表现，为深入研究提供了有力的理论支持。
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(编辑 郭云雁)