, 王凯4, 赵真坚1,2,3, 陈栋1,2,3, 申琦1,2,3, 余杨1,2,3, 王俊戈1,2,3, 陈子旸1,2,3, 禹世欣1,2,3, 陈佳苗1,2,3, 王翔枫1,2,3, 唐国庆1,2,3
2. 四川农业大学动物科技学院，农业农村部畜禽生物组学重点实验室，成都 611130;
3. 四川农业大学“畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室”，成都 611130;
4. 新希望六和股份有限公司，成都 625014
, WANG Kai4, ZHAO Zhenjian1,2,3, CHEN Dong1,2,3, SHEN Qi1,2,3, YU Yang1,2,3, WANG Junge1,2,3, CHEN Ziyang1,2,3, YU Shixin1,2,3, CHEN Jiamiao1,2,3, WANG Xiangfeng1,2,3, TANG Guoqing1,2,3
2. Key Laboratory of Livestock and Poultry Multi-omics of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;
3. Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;
4. New Hope Liuhe CO. LTD., Chengdu 625014, China
猪肉是我国肉类食品中的重要组成部分，长期以来在国内肉类消费中占据主导位置。随着经济的繁荣和人民生活水平的提高，消费者对优质猪肉的需求日益增长。在当前的研究中，随着高通量测序技术的广泛应用和低成本SNP芯片的开发，全基因组关联分析(GWAS)已成为研究家畜重要经济性状的有力工具[1]。通过进行GWAS分析，可以识别与肉质性状相关的SNP位点，并挖掘重要的候选基因。这些发现为提高猪肉质量的育种工作提供了重要的理论基础。
现有的研究越来越多地表明，单核苷酸多态性(SNP)对基因组中大量DNA的甲基化具有显著影响。虽然全基因组表观遗传关联研究(EWAS)可以揭示DNA甲基化与复杂表型之间的关系，但尚不能明确其与表型变异的因果关系。有研究表明，表观遗传变异可能受到SNP[2-3]、转录因子结合[4]或环境因素[5]的影响。因此，EWAS识别的显著相关性可能与其他因素混淆。为了深入了解肉质性状的遗传基础，本研究基于基因型填充测序数据对大白猪群体进行GWAS分析。一方面，识别与肉质性状显著相关的SNP位点，并挖掘影响肉质性状的重要候选基因；另一方面，与之前的EWAS分析结果进行比较，从基因组水平上验证EWAS识别的关键区域和候选基因。
1 材料与方法 1.1 试验动物与表型测定在本研究选取了浙江天蓬猪场140头纯种大白猪(包括85头公猪和55头母猪)。所有试验猪都在相同的设施条件和环境下的圈舍中饲养，并执行相同的饲养标准。在屠宰时，这些猪的平均体重为(111.71±12.92) kg，并在屠宰前禁食了24 h。在屠宰过程中，从每头猪的左半边胴体第3~4肋处背最长肌收集样品，并对其pH、肉色、滴水损失、肌内脂肪和脂肪酸组成等肉质性状进行测定。
1.2 组织样本采集及DNA提取和SNP分型在对试验猪进行屠宰测定的同时采集肌肉样品于冻存管中，加入75% 的乙醇，于－20 ℃条件下保存备用。耳组织DNA的提取参照OMEGA组织DNA提取试剂盒说明书所述步骤进行。基于Illumina平台(Illumina，美国)标准流程使用Neogen GeneSeek Porcine50K芯片对140头大白猪进行基因分型，芯片包含50 697个SNPs。
1.3 基因型填充1.3.1 基因型填充参考模板 本研究采用了两种参考模板对芯片数据进行填充，并将两种参考模板填充的结果进行了合并。第一种参考模板的参考群体来自华南农业大学的张哲课题组[6](包括50头来自福建某猪场的杜洛克，以及来自华南地区21个地方猪品种的210头猪)，芯片数据填充过程由对方完成。第二种参考模板的参考群体则是本课题组搜集的40头大白猪的重测序数据。
1.3.2 基因型填充及质量控制 填充完成后利用Plink v1.09软件[7]对填充后的SNP数据进行质量控制，过滤标准为：1)去除实际等位基因与最可能等位基因相关性平方(R2)小于0.9的SNPs位点；2)去除MAF小于0.01的SNPs位点；3)去除HWE检验小于1×10-6的SNPs位点；4)去除性染色体上的SNPs位点。经过质量控制检验的SNPs位点被用于后续GWAS分析。
1.4 全基因组关联分析本研究使用GEMMA v0.98.5软件[8]中的线性混合模型对每个肉质性状进行GWAS分析。在GWAS分析前，先使用Box-Cox变换将表型数据校正至符合正态分布，然后以出生年、出生月、性别、批次作为固定因子对表型进行校正，得到的校正值被用于GWAS分析。GWAS所使用的线性混合模型如下：
| $ y=\boldsymbol{X} m+\boldsymbol{W} a+e $ |
模型中，y表示表型值向量；m表示SNP效应；a表示剩余多基因效应，服从(a~MVN(0, Aσe2))分布，A表示分子亲缘关系矩阵(genomic relatedness matrix，GRM)；e表示残差，服从(e~MVN(0, Iσe2))分布, I表示单位向量；X和W分别表示m和a的关联矩阵。GRM根据如下公式计算：
| $ \boldsymbol{G}=\frac{1}{p} \sum\limits_{i=1}^p\left(x_i-1_n \bar{x}_i\right)\left(x_i-1_n \bar{x}_i\right)^T $ |
式中，G表示个体间亲缘关系矩阵；n表示个体数量；p表示SNP的数量；i表示第i个SNP；xi表示第i个SNP的基因型；xi表示第i个SNP的平均值。
本研究使用Bonferroni校正法来设置全基因组显著阈值，即GWAS结果中当SNP的关联P值达到P＜0.05/N时，表示该SNP为显著SNP位点，其中N表示GWAS分析中使用的SNP数量；建议显著阈值设置为P＜1/N。然后使用R软件中的CMplot v4.0.0包绘制曼哈顿图。使用R软件中GenABEL包[9]中的estlambda函数计算基因组膨胀系数λ用于判断是否有假阳性信号。
1.5 候选基因注释和功能分析本研究中，以显著SNP位点上、下游20 kb范围的基因组区域作为QTL区域，根据Ensembl网站的BioMart模块检索范围内的候选基因，然后使用DAVID网站对候选基因进行GO和KEGG富集分析，并结合候选基因相关的已发表文献综合分析候选基因的生物学功能。
1.6 EWAS与GWAS的共定位分析本研究对140头大白猪群体肉质性状的GWAS鉴定的显著SNPs与EWAS(EWAS结果见文献[10])鉴定的显著CpG位点进行比较，从而鉴定GWAS与EWAS重叠的显著关联位点。如果GWAS的显著SNPs与EWAS显著CpG位点在2 Mb范围内，则被认为是二者重叠的显著关联位点[11]。
2 结果 2.1 表型统计本研究中140头大白猪(ZJYY)的表型统计见表 1。
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表 1 140头大白猪肉质性状汇总结果 Table 1 Summary of meat quality traits of 140 Yorkshire pigs |
本研究对140头试验大白猪进行了50K芯片基因分型，并获得了50 697个SNPs。经过填充、合并及质量控制后，成功获得了10 961 097个高质量的SNPs(图 1)，这些SNPs被用于后续的GWAS研究。
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图 1 SNPs密度图 Fig. 1 SNPs density plot |
本研究对140头大白猪的28个肉质性状进行GWAS分析。结果显示，在所有肉质性状的分析中，有4个性状共检测到516个全基因组水平显著的SNPs(图 2、图 3、图 4、图 5)。其中，b45 min性状的关联结果检测到最多的362个全基因组水平显著SNPs位点，其次是C22∶6n-3(150个)、DL(2个)以及C20∶3n-3(2个)。各性状间无共享SNPs，表明这几个肉质性状之间的SNP关联模式可能存在差异。本研究根据SNP位点的基因组位置，对516个全基因组水平显著的SNPs进行了注释，共注释了68个基因。其中包括34个蛋白质编码基因，详见表 2。
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A. pH45 min；B. pH24 h；C. L45 min；D. L24 h；E. a45 min；F. a24 h；G. b45 min；H. b24 h；I. DL；J. SF；K. IMF。横坐标表示染色体，纵坐标表示SNPs的-lg(P-value)，上方横线表示基因组水平显著阈值线(0.05/N)，下方横线表示建议显著水平阈值线(1/N)，N表示SNPs的数量 A. pH45 min; B. pH24 h; C. L45 min; D.L24 h; E. a45 min; F. a24 h; G. b45 min; H. b24 h; I. DL; J. SF; K. IMF. The x-axis represents the chromosome and the y-axis represents the significance of all SNPs, represented by-lg(P-value). The horizontal line above represents the genome level significance threshold based on 0.05/N, the horizontal line below represents the suggested level significance threshold based on 1/N, where N is the number of SNPs 图 2 肉质性状GWAS分析结果的曼哈顿图 Fig. 2 The Manhattan plots of meat quality traits in GWAS |
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A. pH45 min；B. pH24 h；C. L45 min；D. L24 h；E. a45 min；F. a24 h；G. b45 min；H. b24 h；I. DL；J. SF；K. IMF 图 3 肉质性状GWAS分析结果的Q-Q图 Fig. 3 The Q-Q plots of meat quality traits in GWAS |
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A. C10:0；B. C12:0；C. C14:0；D. C16:0；E. C16:1；F. C18:0；G. C18:1n-9；H. C18:2n-6；I. C18:3n-3；J. C18:3n-6；K. C20:0；L. C20:1n-9；M. C20:2；N. C20:3n-3；O. C20:3n-6；P. C20:4n-6；Q. C22:6n-3。横坐标表示染色体，纵坐标表示SNPs的-lg(P-value)，上方横线表示基因组水平显著阈值线(0.05/N)，下方横线表示建议显著水平阈值线(1/N)，N表示SNPs的数量 C10:0;B. C12:0;C. C14:0;D. C16:0;E. C16:1;F. C18:0;G. C18:1n-9;H. C18:2n-6;I. C18:3n-3;J. C18:3n-6;K. C20:0;L. C20:1n-9;M. C20:2;N. C20:3n-3;O. C20:3n-6;P. C20:4n-6;Q. C22:6n-3. The x-axis represents the chromosome and the y-axis represents the significance of all SNPs, represented by-lg(P-value). The horizontal line above represents the genome level significance threshold based on 0.05/N, the horizontal line below represents the suggested level significance threshold based on 1/N, where N is the number of SNPs 图 4 肉质性状GWAS分析中脂肪酸组成性状的曼哈顿图 Fig. 4 The Manhattan plots of fatty acid traits in meat quality traits in GWAS |
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A. C10:0;B. C12:0;C. C14:0;D. C16:0;E. C16:1;F. C18:0;G. C18:1n-9;H. C18:2n-6;I. C18:3n-3;J. C18:3n-6;K. C20:0;L. C20:1n-9;M. C20:2;N. C20:3n-3;O. C20:3n-6;P. C20:4n-6;Q. C22:6n-3 图 5 肉质性状GWAS分析中脂肪酸组成性状的Q-Q图 Fig. 5 The Q-Q plots of fatty acid traits in meat quality traits in GWAS |
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表 2 肉质性状GWAS分析中的候选基因 Table 2 Summary of candidate genes in GWAS analysis |
此外，所有肉质性状GWAS结果中检测到共4 134个达建议显著阈值的SNPs与9个性状显著相关。其中b45 min性状结果检测到最多的2 544个达建议显著阈值的SNPs位点，其次是C22∶6n-3(1 069个)、DL(441个)、C20∶1n-9(28个)、C18∶2n-6(25个)、C20∶0(12个)、C20∶3n-3(10个)、C10∶0(3个)以及C18∶0(2个)。本研究基于SNP位点的基因组位置，对这4 134个达建议显著阈值的SNPs进行了注释，共注释了338个基因，其中包括228个蛋白质编码基因。
2.3 候选基因注释及功能分析为了进一步探究肉质性状候选基因的生物学功能，本研究对GWAS注释的338个候选基因进行GO和KEGG分析。GO分析结果表明：这些基因主要富集在金属离子结合、细胞间黏附、内质网功能、脂肪酸代谢、胰岛素代谢、氧化还原酶活性以及辅酶活性等相关GO条目中(图 6A)。KEGG富集分析结果表明：这些候选基因主要参与叶酸生物合成、脂肪酸延长、花生四烯酸代谢、泛酸和辅酶A的生物合成以及细胞色素对外源物代谢等通路(图 6B)。这些结果表明，大部分候选基因可能通过调控离子结合、内质网功能以及脂肪酸代谢等相关生物学通路来影响肉质性状。
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A. GO分析主要结果；B.KEGG分析主要结果 A. GO analysis; B. KEGG analysis 图 6 基于所有建议显著水平SNPs注释的候选基因富集分析气泡图 Fig. 6 The bubble diagram of GO and KEGG analysis of candidate genes based on significant SNPs achieve suggestive threshold |
在本研究中，如果GWAS的显著SNP位点与EWAS显著CpG位点距离在2 Mb范围内，则被认为是GWAS与EWAS重叠的显著关联位点。基于此标准，在研究的28个肉质性状中，在3个性状(b45 min、DL和C22∶6n-3)上发现了GWAS与EWAS重叠的显著关联位点。结果如图 7和表 3所示。其中，在b45 min中发现了8个显著CpG位点和59个显著SNPs位点位置接近；在DL发现1个CpG位点和1个SNP位点位置接近；在C22∶6n-3中发现了3个CpG位点与146个SNPs位点位置接近。这些位点被确定为重叠的显著关联位点。
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A. b45 min性状；B. DL性状；C. C20:3n-3性状；D. C22:6n-3性状。三角形表示显著SNP位点，圆点表示显著CpG位点 A. b45 min; B. DL; C. C20:3n-3; D. C22:6n-3. The triangle represents significant SNPs, the circle represents significant CpG sites 图 7 在GWAS中的显著SNP位点和EWAS中的显著CpG位点在基因组的分布图 Fig. 7 The distribution of significant SNPs in GWAS and significant CpG sites in EWAS throughout the whole genome |
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表 3 GWAS和EWAS重叠的显著关联信号统计 Table 3 Summary of the overlapped significant associations between GWAS and EWAS |
本研究基于GWAS对大白猪的28个肉质性状进行了关联分析，在全基因组水平上检测到516个显著的SNPs位点，并鉴定了3个与肉质性状相关的QTL区域。在b45 min性状的关联结果中，SSC14:17.74~19.94 Mb区域包含290个显著的SNP。与猪QTL数据库的比较发现，该基因组区域附近的大多数QTL都与猪的生长性状有关。例如，Ma等[12]在白杜洛克×二花脸猪群体研究中报道了该区域附近与眼肌面积相关的QTL。此外，SSC18：49.28~50.01 Mb区域包含7个显著的SNPs。该基因组区域附近研究的大多数QTL都与胴体性状有关。例如，Liu等[13]在杜洛克×皮特兰群体的研究中鉴定了与DL性状相关的QTL。在C22∶6n-3的关联结果中，SSC4∶101.55~103.75 Mb区域包含150个显著的SNPs。Pérez-Enciso等[14]报道了SSC4上与脂肪酸代谢相关的QTL。Uemoto等[15]在纯种杜洛克群体的研究中也发现了与SSC4上的C18∶0显著相关的QTL。
3.2 重要的候选基因本研究通过GWAS对大白猪群体进行了肉质性状相关重要候选基因的鉴定与发掘，共鉴定了68个候选基因。通过功能富集分析以及查阅相关文献，确定了6个可能与肉质性状相关的重要候选基因，包括NDUFB6、GALNTL6、IGFBP1、ZFAT、CDH13以及MCUR1。
NDUFB6编码线粒体复合物Ⅰ亚基，该基因在线粒体呼吸中发挥重要作用[16-17]。研究表明，线粒体呼吸和肌红蛋白的相互作用对畜禽屠宰前后的肉质均有影响[18]。此外，研究还发现线粒体能调控低氧条件下肌红蛋白的表达，而且线粒体及其中间产物对肌肉中肌红蛋白的还原具有积极作用[19]。因此，NDUFB6基因可能通过影响线粒体功能来调节肌红蛋白的表达，进而对肉质性状产生影响。
GALNTL6主要编码多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶样6，并且在一项针对荷斯坦牛的GWAS分析中，发现该基因与牛胴体性状存在关联[20]。
IGFBP1属于胰岛素样生长因子家族，有研究表明，胰岛素样生长因子系统在猪骨骼肌生长中起着重要作用[21]。此外，胰岛素样生长因子信号通路在调节骨骼肌生长、分化和维持成人肌肉组织的稳态方面起着关键作用[22]。因此，IGFBP1可能通过参与骨骼肌生长分化而对肉质性状产生影响。
ZFAT编码一种锌指蛋白，Ishikura等[23]的研究发现ZFAT在脂肪细胞的维持和分化中具有至关重要的作用。脂肪沉积与肉品质密切相关，研究表明肌肉的IMF可以影响肉的风味、嫩度以及多汁性，而且脂肪沉积量也直接影响肉色、滴水损失以及大理石花纹[24]。
CDH13编码钙粘蛋白超家族的成员，即钙依赖性细胞粘附蛋白。基于大白猪基因型填充数据的一项一步法GWAS研究表明，CDH13与猪的体型性状存在关联[25]。
MCUR1在线粒体能量代谢中具有重要调节作用[26]。研究表明，MCUR1是线粒体Ca2+摄取和维持正常细胞生物能所需的线粒体单向转运通道复合体的关键组成部分[27]。鉴于线粒体功能对肉质的重要影响，MCUR基因可能通过参与线粒体功能而对肉质性状产生影响。
3.3 肉质性状的GWAS与EWAS共定位比较通过比较EWAS鉴定的显著DNA甲基化位点与GWAS鉴定的显著SNPs之间的关联模式，发现在EWAS分析中鉴定的显著关联在整个基因组更加分散，大多数显著关联局限于单个CpG位点，此外，许多CpG位点的DNA甲基化与多个肉质性状相关，而诸如b45 min、DL和C22∶6n-3等性状与位于不同染色体的多个CpG位点相关。相比之下，由于基因组上存在大量的连锁不平衡(LDs)以及SNP在基因组上密度更高，GWAS分析中鉴定的显著关联往往延伸几kb甚至几Mb。DNA甲基化的关联模式反映了不同染色体区域中DNA甲基化的调控特性，这是不同基因组区域中DNA甲基化对基因表达的调控不同所致。
在GWAS对肉质性状的分析中，鉴定的显著关联主要涉及b45 min、DL、C20∶3n-3和C22∶6n-3等性状。在EWAS分析中，也鉴定了这些性状的大量显著关联信号。此外，这些性状的显著SNP位点和显著CpG位点在基因组中的位置也有一些比较接近。许多研究表明，遗传变异可以对DNA甲基化组的大部分产生重要影响[28]。因此，EWAS的一些显著信号可能是由附近的SNP导致的，而SNP或其他影响因素的混淆可能是EWAS鉴定到大量与性状相关的显著DNA甲基化的主要驱动因素。
4 结论 4.1本研究对140头大白猪群体的肉质性状进行GWAS分析，鉴定了516个全基因组水平显著的SNP位点以及68个位置候选基因，根据候选基因的功能富集分析及相关文献报道筛选了6个重要候选基因，分别为NDUFB6、GALNTL6、IGFBP1、ZFAT、CDH13以及MCUR1。
4.2本研究通过比较GWAS和EWAS结果鉴定二者重叠的显著关联位点，在b45 min关联结果中发现了8个显著CpG位点与59个显著SNPs位点位置接近，在DL关联结果中发现1个CpG位点与1个SNP位置接近，在C22∶6n-3关联结果中发现3个CpG位点与146个显著SNPs位点位置接近。
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(编辑 郭云雁)