产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes，LM)，是已发现李氏杆菌属中对人致病性最强的种^[1]，食用经LM污染的食品可引起脑膜炎、败血症、流产等多种疾病，死亡率高达30%^[2]。对于李氏杆菌病的防治主要依靠抗生素，长久使用会导致细菌产生耐药性，因此，在治疗细菌性疾病时，迫切需要研发含有抑菌功能的新型制剂给予支持。以噬菌体为代表的新型生物抗菌制剂因其安全性、特异性、在体内不会造成菌群失调、副作用小、无化学残留等特点在降低致病菌污染风险、延长食品保质期，从而保障食品的质量与安全方面具有巨大的潜力，已经成为当下的研究热点。

1 噬菌体感染细菌的机制

依据侵染细菌机制的不同，可将噬菌体分为裂解性噬菌体(lytic phage)和溶源性噬菌体(lysogenic phage)。裂解性噬菌体首先吸附到细菌表面特异性受体上，将核酸注入宿主细胞，蛋白质外壳留在胞外；核酸随后在胞内转录表达，每个细胞中生成上百个新的噬菌体颗粒，噬菌体基因组编码的裂解酶裂解细胞壁，最终导致细菌细胞壁破裂和噬菌体子代释放。溶源性噬菌体侵染宿主细菌后，将其基因组DNA整合至宿主菌基因组上，并随宿主菌DNA复制而复制，在特定的条件下(如紫外线、丝裂霉素C等诱导)，噬菌体DNA与宿主菌DNA分离，随后进入裂解循环，噬菌体进行生物合成与装备并裂解宿主菌，子代噬菌体颗粒释放至宿主菌胞外(图 1)。

2 噬菌体-宿主李氏杆菌的相互作用

在自然界中，噬菌体已经进化获得了超越传统的溶源反应，在一些LM菌株中，存在“comK”的基因，其中含有原噬菌体，这会导致宿主菌失去活性。当LM感染巨噬细胞时，原噬菌体会转变为分子开关，促进“comK”基因的表达，从而促进LM在细胞内的生长。在这个过程中，原噬菌体不会产生感染性噬菌体或导致细菌溶解，这表明它已经适应了宿主的生活方式。研究将这种适应性噬菌体行为称为“活性溶源”，即噬菌体通过基因组切除来调控细菌的基因表达，而不触发溶源周期^[3]。为了更好地理解LM菌株10403S与其原噬菌体f10403S之间的相互作用，该研究分析了噬菌体对诱导裂解循环的条件的反应、噬菌体基因组以及在溶源性、裂解性和活性溶源性条件下的转录反应，同时还分析了调控基因和溶源性基因。研究结果发现，f10403S获得了一种非经典的转录反应，这一发现鉴定出新的噬菌体编码因子，并且发现这些因子促进了活性溶源行为，以及在细菌-噬菌体互作作用中发挥关键作用的转录调控因子，例如LlgA转录调控因子和DNA复制酶。

伊氏李氏杆菌(Listeria ivanovii，Liv)是李氏杆菌属中的致病菌种之一，主要感染反刍动物，但也偶尔引起人类肠道感染。最近的研究表明，LM细胞壁相关的糖基共聚物(WTA) 上的特异性糖基负责噬菌体吸附和保留主要毒力因子InlB。除了作为血清分型的主要抗原决定因素外，WTA还参与一些关键的生理功能，包括维持渗透压、抗生素耐药性、毒力以及与宿主细胞和噬菌体的相互作用^[4]。在LM血清型1/2a中的研究表明，InlB依赖于WTA上的鼠李糖残基来进行表面保留，这种修饰也可以作为噬菌体受体^[5]。由于这些修饰体既是噬菌体结合的受体，也是表面相关毒力因子InlB的配体，因此，李氏杆菌在维持毒力和产生噬菌体抗性之间面临着权衡^[4]。由于Liv基因组中也具有InlB的特征，因此确定InlB毒力因子是否也依赖于WTA修饰是有必要的。研究表明，对Liv WSLC 3009基因组的多顺反子WTA基因簇中编码一个假定的葡萄糖基转移酶的独特基因liv1070进行鉴定。超高效液相色谱-质谱分析结果显示，基因组内缺失liv1070导致WTA上葡萄糖替代缺失，由于噬菌体不能吸附在细菌表面，这一结合过程由受体结合蛋白介导，葡萄糖缺乏突变体对噬菌体感染产生了抗性。与LM类似，liv1070的缺失导致了细菌细胞壁上InlB保留的缺失。liv1070的遗传互补恢复了其特有的表型，包括葡萄糖修饰、噬菌体吸附和细胞侵袭。综上所述，噬菌体、细菌和宿主细胞之间的相互作用也存在于Liv中，这表明噬菌体耐药性和毒性衰减之间的权衡可能是李氏杆菌属的一个普遍特征^[6]。

随着非编码RNAs (ncRNAs)在LM毒力和环境胁迫中的不同作用越来越清楚，越来越受到人们的关注。ncRNA rliB是CRISPR家族的非典型成员，在一些LM基因组和其他李氏杆菌中被发现，并可能位于相似的基因组位点上。Tian等^[7]通过同源重组构建了rliB缺陷突变体(Lm3-22-ΔrliB)，研究发现Lm3-22-ΔrliB对李氏杆菌噬菌体vB-LmoM-SH3-3的敏感性显著提高，成斑效率提高了128倍。与野生型相比，Lm3-22-ΔrliB的黏附性和侵袭性显著降低(分别为9.3%和1.33%)。感染4 h后，Lm3-22-ΔrliB在小鼠巨噬细胞(RAW264.7) 中的增殖也明显下降。侵袭相关表面蛋白转录水平显示，Lm3-22-ΔrliB中内毒素基因lmo0610、lmo0514和肽聚糖结合蛋白基因lmo1799显著升高。此外，与噬菌体相互作用后，Lm3-22-ΔrliB细胞中inlA、lmo0610、lmo1799、lmo2085和lmo0514的转录水平显著上调，而与噬菌体处理的Lm3-22对照组相比，inlB的转录水平下调。因此，rliB缺失有效调节了李氏杆菌与噬菌体的相互作用，削弱了其侵袭能力，增强了其对噬菌体的敏感性，为噬菌体的生物防治提供了新的理论依据。

3 李氏杆菌噬菌体改造

经过工程化改造的人工噬菌体可以携带特定的功能模块，相较天然噬菌体具有增强杀菌效率、核酸水平的精准干预、转换或扩大宿主谱、降低免疫反应、利用宏基因组挖崛噬菌体资源、多组学揭示噬菌体与宿主互作机制^[8]、用于病原菌的检测以及改造LM噬菌体作为给药载体等一系列优点。

基于生物发光的报告噬菌体是一种基因工程病毒，可以特异性感染宿主细胞，并转导一种异源荧光素酶基因，其活性可以高灵敏度地检测到，可以指示活的靶细胞的存在^[9]。Meile等^[10]用合成生物学进行全基因组组装和激活，以及CRISPR-Cas-辅助噬菌体工程，构建了一套用于检测和鉴别李氏杆菌活细胞的报告噬菌体。在这项研究中基于单个噬菌体结构，比较了编码不同甲壳动物、刺胞动物和细菌荧光素酶的四种报告噬菌体的特性。从这组报告蛋白中，nluc被鉴定为一种理想的纳米荧光素酶^[11]，引入到广泛宿主噬菌体A511和血清型1/2a和血清型4b特异性李氏杆菌噬菌体A006和A500的基因组中。基于nluc的广谱噬菌体A511:: nluc_CPS在不到24 h的时间内，在25 g人工污染的牛奶、冷盘和生菜中检测出1 CFU的LM。此外，该报告噬菌体成功在可能被污染的食品样品中检测出，而且没有产生假阳性或假阴性结果。A006:: nluc和A500:: nluc能够进行血清特异性李氏杆菌诊断。此研究中提出的报告噬菌体不仅可以快速检测出LM，而且还能估计早期食品生产和加工场所分离的李氏杆菌潜在毒力。

噬菌体为诊断、修复和靶向微生物组操作提供了极好的工具，但分离具有广谱宿主特异性的噬菌体仍然具有挑战性。李天昊等^[12]从屠宰场污水中分离出一株可跨种裂解的LM噬菌体LP8，对其进行生物学特性分析后，联合青霉素G钠治疗可以在良好的治疗效果的前提下，减少抗微生物药物使用，为治疗李氏杆菌病提供了一个新的途径。噬菌体编码的受体结合蛋白(RBP)介导附着并赋予属、种甚至血清型水平的特异性^[13]。这些蛋白是特定噬菌体靶向分类多样性的关键决定因素，即噬菌体宿主范围^[14]。Dunne等^[15]将Gp15鉴定为噬菌体PSA的RBP，并构建了一个包含序列随机RBP的合成噬菌体文库，从中分离出突变体，随后将其整合到具有扩展宿主范围的合成多价噬菌体中。在1.7 Å分辨率下确定了Gp15受体结合羧基末端的晶体结构，并利用生物信息学方法鉴定了针对不同李氏杆菌血清型的RBP。结构导向设计使异种RBP头部、颈部或肩部结构域的交换能够产生具有可预测和扩展宿主范围的嵌合噬菌体。这一方法将促进基于具有可调宿主特异性的噬菌体生物制剂的开发。

完整注释的基因组序列对于治疗用噬菌体十分重要。尽管基因遗传图谱并不能决定噬菌体的宿主范围，但可由它分析一些关键信息。基因组测序可以帮助确定噬菌体DNA的可修饰性，该系统可以对噬菌体能否进行基因水平转移的可能性进行预测^[16]。其次，该方法可以有效预测噬菌体是否包含有毒基因。通过对李氏杆菌噬菌体基因组进行基因修饰，理论上可以拓宽噬菌体的裂解谱^[17]。

CRISPR-Cas系统为细菌提供适应性免疫，以抵抗入侵的DNA，包括噬菌体和质粒^[18]。Hupfeld等^[19]报道了李氏杆菌属的第一个功能性CRISPR-Cas系统，LivCRISPR-1是L. ivanovii亚种londoniensis基因组中的Ⅱ-A型系统，研究者将LivCRISPR-1 Cas9和反式激活crRNA转移到LM中，与crRNA编码质粒一起，这种可编辑干扰系统能够有效地切割细菌DNA和进入的噬菌体基因组。构建了一个基于LivCRISPR-1的可编辑特异性核酸酶系统，该系统也可用于李氏杆菌属的其他成员。LivCRISPR-1 Cas9蛋白对于李氏杆菌和噬菌体DNA的高效靶向切割，可用于编辑李氏杆菌噬菌体基因组。因此，该研究编辑了一种李氏杆菌噬菌体，可诱导受感染细胞产生和释放特异性细胞壁水解酶，从而允许在共培养中控制两种细菌的生长和相互作用。这种方法有助于调控复杂的细菌环境，从而有助于深入研究细菌之间的相互作用。

4 噬菌体在李氏杆菌检测中的应用

通过将噬菌体与纳米材料组装为纳米复合探针或者直接使用噬菌体作为探针可用于超敏检测。据此，国外NEMIS技术公司建立AquaSpark^TM技术用于快速监测食品接触表面中的LM，这种技术利用LM的特异性肌醇1-磷酸基团被AquaSpark^TM小分子化学发光探针标记，这个触发基团是由LM表达的毒力因子磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C (PI-PLC)的底物所组成的，加上含有噬菌体鸡尾酒的细菌特异性富集肉汤，提高其特异性和灵敏度。可以在24 h内检测到不锈钢表面低剂量的LM^[20]。

Sample6 DETECT^TMHT/L是一种基于噬菌体的检测系统，主要用于检测环境样品中的LM和其他李氏杆菌。使用Sample6专有的BioIllumination^TM技术，该方法通过特异性噬菌体与李氏杆菌结合，高通量DETECT HT/L试剂盒能在18 h内最多可同时检测96个环境样品或混合绿叶蔬菜基质中的李氏杆菌^[21]。

Lai等^[22]成功研发了一种将李氏杆菌噬菌体P100和银纳米颗粒结合到藻酸盐基质中的新型抗菌配方。该方法通过将噬菌体P100(10⁹ PFU ·mL^-1) 添加到藻酸盐-银包被中产生协同效应。在原纸上涂上不同重量的抗菌配方，然后进行红外干燥，制成生物活性纸。整合到海藻酸盐基质中的噬菌体即使经过高温红外干燥也能保持稳定的特性。当海藻酸盐浓度范围为1.0%~1.25%，对应的干燥纸涂层重量为1.8~2.3 g ·m^-2时，对LM的抗菌活性最有效，使LM数量减少了5 log CFU ·cm^-2。噬菌体展示技术是将多肽基因片段克隆到噬菌体衣壳蛋白结构基因的适当位置，融合表达外源肽和衣壳蛋白。融合蛋白通过子代噬菌体的重组显示在噬菌体表面，经过3~5轮吸附洗脱扩增后，从噬菌体肽库中筛选出特异性外源肽^[23]。该方法筛选的肽具有特异性好、稳定可靠、结构清晰、容易合成、成本低等优点^[24]。Li等^[25]利用噬菌体展示技术对大肠杆菌O157:H7、LM和马耳他布鲁氏菌这三种常见人畜共患病原体进行特异性肽筛选，得到了分别能识别这三种病原体的肽E2、L4和B4。合成了三个经生物素修饰的肽，并将其偶联到链霉亲和素磁珠(streptavidin magnetic beads，mb)上形成多肽mb，从而富集了上述三种病原体。将3种多克隆抗体偶联到不同的量子点荧光表面(QD540、QD580和QD630)，构建了3个量子点探针。建立了基于多肽-mb和量子点多色荧光标记的检测方法，可同时检测大肠杆菌O157:H7、LM和马耳他布鲁氏菌。检测耗时约100 min，检出限分别为10³、10²、10² CFU ·mL^-1。根据Meile等^[10]的研究，噬菌体的病原识别工具可以根据其作用方式分为两类：基于分子的检测方法和基于相互识别的检测方法。许多基于核酸的技术已被应用于LM的检测，包括常规PCR、多重PCR、实时/定量PCR (qPCR)、环介导等温扩增(LAMP)和全基因组测序分析等。这些分子技术虽非常敏感和特异，然而它们通常无法区分活的和灭活的微生物，因而会导致假阳性结果^[26]。因此，需要新型的、快速的、健全的检测方法对致病菌进行识别。在基于相互识别的检测方法中，噬菌体尾部及其受体结合蛋白(RBP_S)通过尾部附着位点与细菌表面分子之间的特异性相互作用，对宿主识别起到关键作用。研究者从一组李氏杆菌噬菌体中收集了六种蛋白质：三种RBP和三种内毒素衍生的细胞壁结构域(cell wall-binding domains CBD)，目的是开发一种快速、可靠和客观的血清分型方法。在该方案中，GFP(绿色荧光蛋白)标记的重组蛋白与LM一起在微孔板上孵育，并在1 h内测量结合探针的荧光，以提供血清特异性指纹图谱。为了验证这种新的方案的准确性，测试了60株已知血清型的菌株，其中58株被该方法准确分型。这种方法规避了基于PCR分型的一些局限性，可以区分活细菌和灭活细菌以及由点突变引起的不同血清型。为了进一步说明基于噬菌体蛋白检测和鉴别LM的有效性。研究者们开发了一种方法来区分最常见的致病血清型：1/2a和4b，通过连接GFP标记的重组蛋白到磁珠上，以便在荧光显微镜下选择性富集和检测这些血清型。结果显示虽然4b特异性磁珠的结合亲和力明显低于1/2a，但在混合培养中仍能有效地分离目标血清型细菌。以上结果表明，高稳定性、特异性和重组过表达的易用性使RBP成为抗体的优秀替代品和开发新诊断技术的理想工具。

5 李氏杆菌噬菌体在食品保鲜中的应用

李氏杆菌存在范围广泛，会污染食品加工环境，并在设备、器皿、地板和下水道的生物膜中存活，通过交叉污染进入食品，因此，消除食品和食品加工环境中的细菌病原体需要新的方法。在新兴技术中，利用噬菌体作为新型抗菌剂是有效解决方案之一。在Song等^[27]的研究中，HolGH15有可能作为一种新型的抗菌剂，通过喷洒或浸泡的方式在食品生产和储存过程中对抗李氏杆菌。Chibeu等^[28]的研究表明，单一噬菌体制剂能够减少火鸡片和烤牛肉表面的李氏杆菌。与单一噬菌体制剂相比，用多种噬菌体制备的鸡尾酒制剂效果更好，既有更广泛的裂解范围，又能降低细菌出现耐药性的风险(表 1)。

噬菌体固定化使得具有噬菌体活性的包装材料应用于食品。由于噬菌体外部结构具有电荷差异，噬菌体可以通过静电作用固定在包装表面。Anany等^[38]指出固定化的LM噬菌体可以应用于真空或有气体填充的包装肉类中，可在保质期内将LM控制在1×10⁵ CFU ·mL^-1以下。Radford等^[39]将噬菌体固定在聚乳酸(PLA)薄膜的黄原胶涂层上，与农产品作用30 min内，99.99%噬菌体获得释放。具有噬菌体涂层与不具备涂层的PLA相比，细菌的数量出现明显下降(表 2)。

6 问题与展望

近年来，对李氏杆菌噬菌体的应用研究进展成为当下研究热点之一，但是，目前对李氏杆菌噬菌体的研究主要集中在分离鉴定及生物学特性分析等初步研究^[12]，对李氏杆菌噬菌体与宿主互作机制以及作为生物制剂在临床应用方面研究较少。噬菌体的高度特异性确保了使用噬菌体的安全性；噬菌体种类繁多，基数大等，为噬菌体的使用提供了基础；噬菌体的生物活性可以确保在宿主体内的作用效果不会因为时间的推移或者微环境的改变导致治疗效果下降；同时利用噬菌体本身的一些特性，也可以开发出一系列的新技术，用于细菌性疾病的食品污染防控和公共卫生的改善。虽然，李氏杆菌噬菌体生物制剂作为生物防治手段仍有很长一段路要走。但通过开展李氏杆菌CRISPR-Cas防御系统与噬菌体互作等方面的研究，以进一步完善噬菌体生物学、基因组学、基因传递机制以及李氏杆菌属的致病机制，从而为噬菌体临床应用提供坚实基础，相信随着科学技术的进步和科研手段的提高，噬菌体将会成为一种绿色、安全、有效的防控细菌性感染的抗生素替代品。