2. 甘肃农业大学，兰州 730070;
3. 塔里木大学，阿拉尔 843300;
4. 青海省科学技术信息研究所，西宁 810003
, REN Shanhui1
, YANG Xue1, LIN Yugang3, LI Jiyun4, WANG Xiangwei1, YIN Xiangping1, SUN Yuefeng1, WAN Xuerui2, CHEN Haotai1
2. Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
3. Tarim University, Alar 843300, China;
4. Qinghai Academy of Science and Technology, Xining 810003, China
牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，LSD)是由痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)中的成员牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)引起的一种牛的急性、亚急性传染病[1]。LSDV主要的传播途径是通过蚊虫叮咬和机械性接触，主要会引起牛的头、颈、肩和乳房等处发生炎症反应，并引起牛发热、丘疹或皮肤结节，严重时形成脓疱状损伤，以及组织会发生坏死结痂。
牛结节性皮肤病(LSD)传染性较强，不同品种的牛中均可见发病，发病率一般在2%~45%，发病牛会出现发烧，皮肤、黏膜和内脏会出现结节等临床症状，严重时会出现死亡病症，死亡率高达10%[2]。在该病流行的国家和地区，其易感动物及动物源性产品出口会受到世界各贸易国的严格限制，对当地畜牧业经济的发展影响巨大[3]。目前，针对LSD主要采用疫苗预防控制，动物感染后尚无特异性药物可治疗[4]，因此尽早检出病毒，对传染源进行隔离扑杀，是防制LSD的有效方法。
由于LSDV与绵羊痘病毒和山羊痘病毒的基因组序列相似性极高，所以在检测过程中很难区分[5]，虽然两者宿主范围不同，但动物感染后会出现发热、皮肤结节等类似症状，以上因素影响了对LSDV的准确诊断[6]。目前，LSDV一般用常规的检测方法，例如病毒中和试验、病毒分离与鉴定技术、血清学检测技术等[7]，但是常规的检测方法检出速度慢、准确性低以及对样本要求高，尤其对早期发病动物不能做到有效的诊断，易于造成疫病的扩散与传播[8-9]。赵钟毅等[10]建立的LSDV双重荧光定量PCR方法，最低检出限为15拷贝·μL-1；聂福平等[11]建立了基于TaqMan MGB荧光定量PCR技术的羊痘病毒属多重荧光定量PCR方法，对LSDV的最低检测限为14.8拷贝·μL-1；Agianniotaki等[12]基于GPCR基因建立了LSDV的双探针qPCR方法，最低检测限均为8拷贝·μL-1；Das等[13]建立的两种羊痘病毒属通用型qPCR检测方法，最低检测限为10拷贝·μL-1；南文龙等[14]建立了一种区别LSDV、山羊痘病毒(goatpox virus, GTPV)和绵羊痘病毒(sheeppox virus, SPPV)的三重实时荧光定量PCR方法，主要应用于三种病毒的核酸区分。为了能够更加快速、准确、高效地检测出LSDV，预防LSD的发生以及避免疫病传播造成经济损失，建立一种更灵敏、更高效的检测方法对LSD防控具有重要的临床应用意义[15-16]。
本研究中，基于国内流行的LSDV/FJ/CHA/2021毒株全基因组序列分析，参考qPCR引物设计的基本原则，作者最终设计了靶向于LSDV ORF61基因的3对qPCR引物。通过优化PCR反应条件及验证引物特异性、敏感性和重复性，最终筛选到靶向于ORF61基因的LSDV1 qPCR引物，建立了更为灵敏的LSDV的qPCR检测方法，为LSD预防和控制提供了一种有效的检测手段。
1 材料与方法 1.1 主要病毒和试剂LSDV毒株(LSDV/FJ/CHA/2021毒株)、羊口疮病毒、口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒由兰州兽医研究所草食动物病毒病创新团队分离与保存。上述所有病毒经过支原体检测，结果呈现阴性。
胎牛血清(FBS)，诺莱和上海逍鹏生物有限公司(货号：CF602/C04001-500)产品；DMEM培养基，健硕生物科技有限公司(货号：66001-20012)产品；无钙镁PBS缓冲液购自上海逍鹏生物科技有限公司(Viva cell)(货号：C3593)；支原体检测试剂盒购自上海翊圣生物有限公司(货号：40601ES20)；Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) qPCR购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司(货号：11201ES03)；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技有限公司(货号：P505d1)；快速克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(货号：C112)；TIANamp Virus DNA/RNA Kit病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天跟生化科技有限公司(货号：DP315)；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自OMEGA(货号：D2500-02)。
1.2 引物和探针的设计与合成根据LSDV/FJ/CHA/2021毒株核苷酸全基因序列(GenBank登录号：OP752701)，利用INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES(IDT)(https://sg.idtdna.com/pages/tools/primerquest?returnurl=%2FPrimerQuest%2F)在线网站，优化设计了3对带有MGB探针的荧光定量PCR引物(LSDV1、LSDV2和LSDV3)，该三对引物均特异性靶向ORF61基因(表 1)。根据引物的特异性和灵敏性特点，作者选择了其中特性最优的LSDV1荧光定量PCR引物进行后续试验，如图 1所示，LSDV1 qPCR引物在LSDV ORF61基因中的位置。同时，作者设计了一对普通PCR引物LSDV4(表 1)，用于扩增LSDV ORF61基因，用于后续构建标准的阳性质粒。
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表 1 引物信息 Table 1 The primer sequence used in this study |
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图 1 LSDV 1荧光定量PCR引物靶向ORF61基因位置示意图 Fig. 1 The diagram of the LSDV 1 qPCR primer targeted ORF61 gene |
采用TIANamp Virus DNA/RNA Kit病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取LSDV样品的总DNA，30 μL洗脱缓冲液洗脱DNA，测量浓度后-20 ℃保存。以LSDV DNA为模板进行普通PCR扩增，反应体系：cDNA 1 μL，上、下游引物各2 μL，2×phanta Max Buffer 25 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，dNTP Mix 1 μL，ddH2O 18 μL，总反应体积50 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用胶回收试剂盒(Omega Gel Extration Kit)回收符合预期大小的目的片段，产物置于-20 ℃保存备用。
将pCAGGS空载用EcoRⅠ和KpnⅠ酶进行双酶切，双酶切体系：10×rCutsmart Buffer 5 μL，pCAGGS 2 μg，EcoRⅠ1 μL，Kpn Ⅰ 1 μL，ddH2O 41 μL，总体积50 μL，37 ℃水浴锅3 h，1%琼脂糖凝胶电泳跑胶鉴定并胶回收；酶切的空载pCAGGS与目的片段连接，采用同源重组的方法，用连接酶按照空载Vector ∶目的片段=1 ∶3连接，10 μL反应体系：5×CE Multis Buffer 2 μL，Exnase Multis 1 μL，空载1 μL，目的片段3 μL，dd H2O 3 μL。见表5，根据ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit试剂盒，置于37 ℃ PCR仪器中，连接1 h得到连接产物。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有氨苄抗性的琼脂平板培养基上均匀涂布培养，12~18 h后挑取单个阳性菌，用含有氨苄抗性的培养基37 ℃过夜培养。经菌液PCR鉴定后用质粒小提试剂盒说明书提取质粒，测量其重组质粒D260/D280值及浓度的大小并将符合要求的样品送测，将测序正确的重组质粒命名为pCAGGS-LSDV-ORF61。获得检测方法的标准品，根据计算公式：质粒拷贝数(拷贝·μL-1)=(质粒浓度×10-9×稀释倍数×6.02×1023)/(660道尔顿/碱基×碱基数)，将标准质粒浓度换算成拷贝数。
1.4 荧光定量PCR方法的建立及条件的优化采用Premix ExTaq(Probe qPCR)试剂盒进行试验。采用20 μL反应体系，根据控制变量法优化体系中的模板量(0.5~2.0 μL，以0.5 μL为1个梯度)，引物和探针的使用量(0.4、0.6、0.8和1.0 μL)依次进行优化处理，筛选出最佳的模板、引物和探针组合(20 μL反应体系：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μL，MGB探针0.8 μL，Free Water 6.6 μL)，并对退火温度(54、56、58、60和62 ℃)进行优化，确定荧光定量最佳反应条件，在60 ℃的条件下进行qPCR检测(表 2)。
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表 2 qPCR反应条件 Table 2 The reaction conditions of a qRT-PCR |
将构建的重组质粒10倍倍比稀释，选取6.71×101~6.71×1010拷贝·μL-1为模板，利用已优化的反应体系及条件扩增，每个梯度设3个重复，ddH2O为阴性对照，取3个重复梯度的平均Ct值，以重组质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的平均Ct值为纵坐标，绘制标准曲线并计算相关系数。
1.6 荧光定量PCR特异性试验提取羊口疮病毒、口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取病毒基因组DNA，将已经稀释的阳性标准品以1×107拷贝·μL-1标准阳性质粒为阳性对照，分别以阳性质粒、羊口疮病毒、口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒DNA为模板，以ddH2O作为试验的阴性对照，按照最佳的反应体系及条件，验证该方法的特异性的扩增能力。
1.7 荧光定量PCR敏感性试验将构建的LSDV标准品阳性质粒10倍倍比稀释，取浓度为6.71×100~6.71×108拷贝·μL-1作为模板，共取9梯度，每个浓度3个重复，ddH2O为阴性对照，以优化反应体系和条件进行荧光定量PCR敏感性试验的检测。
1.8 荧光定量PCR重复性试验对不同浓度的阳性重组质粒进行组内和组间荧光定量PCR检测。同一批次的以6.71×107、6.71×106和6.71×105拷贝·μL-1作为模板，每个浓度设3次组内重复。以6.71×107、6.71×106和6.71×105拷贝·μL-1在不同批次稀释的样品进行组间检测，每个浓度设3次组间重复。以此来评估不同浓度重组质粒组内与组间发生的变异情况，通过其变异系数(CV)来反映方法的稳定性与可重复性。
1.9 临床样品的检测随机选取30份由中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物病毒病创新团队实验室采集保存的疑似LSDV阳性样品，其中，皮肤组织样品15份，鼻咽拭子样品10份，抗凝血清样品5份，利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取基因组DNA并测量其浓度大小，利用建立的方法开展LSDV样品检测，同时采用《牛结节性皮肤病诊断技术》(GB/T 39602—2020)推荐通用LSDV荧光定量PCR检测方法作为对照来评估建立的检测方法[17]。
1.10 生物安全声明LSDV相关试验均在中国农业科学院兰州兽医研究所完成，整个试验过程，严格按照中国农业科学院兰州兽医研究所的3级生物安全实验室的操作指南进行。
2 结果 2.1 目的基因的扩增使用本研究设计的PCR引物对靶向ORF61的LSDV的普通PCR扩增结果显示，目的基因扩增产物大小为783 bp，与预期大小一致(图 2)。将扩增产物胶回收，利用同源重组的方法，克隆于pCAGGS空载，构建出重组质粒标准品pCAGGS-LSDV-ORF61，利用紫外分光光度计测定其浓度为575.5 ng·μL-1，计算拷贝数6.71×1011拷贝·μL-1，成功构建出重组质粒标准品。
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图 2 LSDV ORF61基因的PCR扩增 Fig. 2 PCR amplification result of LSDV ORF61 gene |
以浓度为6.71×1010~6.71×101拷贝·μL-1的重组质粒标准品作为模板，按照已经优化的反应体系和条件，使用筛选出的LSDV1 qPCR引物，进行荧光定量PCR。如图 3A，LSDV1 qPCR引物靶向于不同LSDV毒株，具有较高的结合特性。如图 3B，LSDV1 qPCR引物扩增曲线的结果表明该引物具有较高的灵敏性。同时，以重组质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的平均Ct值为纵坐标绘制标准曲线(图 3C)。荧光定量PCR标准曲线结果显示，在浓度6.71×1010~6.71×102拷贝·μL-1标准品与平均Ct值呈现出良好的线性关系，线性相关系数R2=0.998 6，标准曲线y=-3.287 5x+47.87，而且从熔解曲线峰单一，平均温度为77.5 ℃，证明引物具有良好的特异性，根据公式E=10-1/斜率-1计算，扩增效率为101%。
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A. LSDV1 qPCR引物序列比对；B. pCAGGS-LSDV-ORF61的扩增曲线；C. pCAGGS-LSDV-ORF61的标准曲线 A. The sequence alignment of LSDV1 qPCR primer; B. Amplification curve of pCAGGS-LSDV-ORF61; C. Standard curve of pCAGGS-LSDV-ORF61 图 3 靶向LSDV ORF61基因LSDV1 qPCR引物标准曲线的建立 Fig. 3 The construction of the standard curve of LSDV1 qPCR primer targeted the LSDV ORF61 gene |
采用优化后的荧光定量PCR方法对LSDV阳性标准品及羊口疮病毒、口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒基因组DNA为模板进行扩增，ddH2O为阴性对照，结果显示，该方法能扩增LSDV标准品基因组DNA，有特异性的扩增曲线，而对于羊口疮病毒、口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒基因组和阴性对照无扩增信号(图 4)，上述结果表明本研究建立的检测方法特异性良好。
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A. 病毒基因组DNA扩增曲线；B. 病毒基因组DNA熔解曲线；1. pCAGGS-LSDV ORF61 1×107 拷贝·μL-1；2. 其他病毒基因组DNA及阴性对照 A. Viral genome DNA amplification curve; B. Viral genomic DNA dissolution curve; 1. pCAGGS-LSDV ORF61 1×107 copies·μL-1; 2. Other viral genomic DNA and negative control 图 4 荧光定量PCR特异性试验 Fig. 4 The specificity of fluorescence quantitative PCR |
将重组质粒标准品10倍倍比稀释后以质粒浓度6.71×108~6.71×100拷贝·μL-1作为模板荧光定量PCR扩增如图 5所示，结果显示，重组质粒标准品均能扩增出有效的扩增曲线，所有梯度均可检测到荧光信号，并且最低有效检测量为6.71×100拷贝·μL-1，表明建立的方法敏感性较高。
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1. pCAGGS-LSDV ORF61拷贝数为6.71×108~6.71×100拷贝·μL-1；2. 阴性对照 1. pCAGGS-LSDV ORF61 copies ranged from 6.71×108 to 6.71×100 copies·μL-1; 2. Negative control 图 5 荧光定量PCR引物敏感性试验 Fig. 5 The sensitivity test of fluorescence quantitative PCR primer |
利用荧光定量PCR的方法对不同批次和不同浓度的进行组内和组间检测，以6.71×107、6.71×106、6.71×105拷贝·μL-1在不同批次稀释的样品进行3次检测，结果如表 3所示，批次内与批次间重复性试验结果的变异系数小于2%。
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表 3 荧光定量PCR引物重复性分析 Table 3 the repeatability analysis of fluorescence quantitative PCR primer |
通过对疑似LSDV阳性临床样品进行检测，作者建立的荧光定量PCR检测出阳性样品总数19份，阴性样品11份。相比下，推荐通用方法检测阳性样品17份，阴性样品13份，与对照检测方法相比其中鼻咽拭子与抗凝血清中检测结果一致，结果不一致样品有2份，经测序鉴定为LSDV阳性样品，检测样品平均Ct值结果如表 4所示。以上结果表明研究建立的检测方法特异性强、敏感性高，适用于LSDV的临床样品鉴别检测。
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表 4 荧光定量PCR方法与平行方法检测的样品平均Ct值 Table 4 The average Ct values of samples detected by qPCR and parallel method |
荧光定量PCR检测方法相比传统的检测方法具有灵敏度高、反应快速、重复性好、特异性强等优点，利用荧光定量PCR方法解决常规检测中出现的不足，也对流行病调查与检测具有重要的意义[12]。本研究中，基于LSDV/FJ/CHA/2021毒株全基因组序列，参照qPCR引物设计原则，利用IDT在线qPCR引物设计网站，设计出3对靶向LSDV ORF61基因的qPCR引物序列，经后续引物特异性、灵敏性和反应性分析，成功筛选到靶向ORF61基因的LSDV1 qPCR引物，建立了更为灵敏的LSDV的qPCR检测方法。
LSDV基因组约151 kb编码156个蛋白，有156个ORFs，研究发现SPPV和GTPV基因组在LSDV中均能找到，但LSDV中有额外基因，该基因在SPPV和GTPV中是非功能性的[18]，可能与LSDV的宿主特异性有关[19]。由于LSDV与GTPV、SPPV、VACV、传染性脓疱性皮炎病毒等均会呈现不同程度的交叉反应[20]，采用荧光定量PCR方法对LSDV检测比传统的PCR方法更为灵敏，可以对LSDV进行快速和高通量的测定，进而来区分GTPV、SPPV与LSDV[21]。本研究选择LSDV靶向ORF61高度保守区域设计并筛选出引物和探针的最佳组合(LSDV1 qPCR引物)，建立了特异性针对LSDV的Taq Man MGB荧光定量PCR方法，灵敏度较高，反应特性良好。本研究中，敏感性试验结果显示, 该qPCR引物最低检测限为6.71拷贝·μL-1。该引物能够有效地扩增LSDV病毒基因组，不能扩增出羊口疮病毒、口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒基因组，引物特异性良好。同时，临床样品重复性试验中批次内与批次间重复性结果的变异系数均小于2%。检测随机抽取30份临床样品，利用qPCR引物检出LSDV核酸阳性样品19份，相比于推荐通用检测方法检出率高7%，表明所建立的荧光定量检测方法敏感性高、重复性好。
该荧光定量PCR方法的建立不仅为LSDV区别于其他病毒的检测提供新的检测方法与手段，而且也弥补了LSDV实验室检测技术中出现的不足，对LSDV的流行病学调查分析、疫病防控及感染LSDV后的诊断提供了技术支持。
4 结论本研究筛选出一对靶向LSDV ORF61基因的带有MGB探针的荧光定量PCR引物，成功建立了针对LSDV敏感性高、重复性好、特异性强的特定荧光定量PCR检测方法，为LSDV的精准防控提供了快速有效的技术手段。
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(编辑 白永平)