2. 韶关学院英东生物与农业学院，韶关 512005
, QIU Wenyue1, PANG Xiaoyue1, SU Yiman1, YE Jiali1, HUANG Jianjia1, ZHOU Shuilian1, TANG Zhaoxin1, WANG Rongmei2, SU Rongsheng1
2. Yingdong College of Biology and Agriculture, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China
在家禽集约化养殖过程中，各种病原体的感染往往会导致各种疾病，进而损害家禽生长性能，对家禽业的发展危害巨大。以往，抗生素作为一种非常有效的预防疾病和保证生产性能的措施而被广泛使用。然而，随之而来的抗生素耐药性问题让人难以忽视。如今，我国已明令禁止在家禽日粮中使用抗生素。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌细胞壁外层的组成成分。LPS所诱导的内毒素血症可引起多动物器官炎性反应、休克甚至死亡[1]。其中，急性心肌损伤(acute myocardial injury，AMI)是LPS引起的不良后果之一，通常导致高死亡率和不良预后[2]。目前尚未发现更好的预防和治疗药物，因此，在我国当前饲料端禁用、养殖端限用抗生素的政策下，寻找安全的天然产物作为饲料添加剂来预防LPS诱导的肉鸡心肌损伤显得更为迫切和有意义。
研究表明，氧化应激是心肌细胞损伤的重要机制之一[3]。氧化应激与许多疾病有关，如阿尔茨海默病和动脉粥样硬化等，也参与了氧化剂诱导细胞损伤的各种机制。MDA是理想的氧化应激生物标志物，其浓度测定是目前应用最广泛的可指示脂质过氧化程度的试验[4]。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px) 可以清除活细胞内的过氧化物从而保护细胞免于氧化损伤[5]。此外，核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid2-related factor2，Nrf2)的激活也是与抑制氧化应激和铁死亡密切相关的关键机制[6]。当Nrf2被激活后，下游抗氧化酶随之被激活，从而抑制氧化应激和铁死亡的发生发展[7]。研究证实，Nrf2上调后可促进下游多种抗氧化通路蛋白的转录，包括NAD(P)H：醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素加氧酶-1(HO-1)等，而其下调则可诱发氧化应激[8]。HO-1是一种Ⅱ相抗氧化酶，具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗凋亡等作用[9]。NQO1是重要的醌还原酶之一，在抗氧化和抗肿瘤反应中发挥重要作用[10]。GCL是谷胱甘肽合成的限速酶，包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)[11]。
已有研究证明，铁死亡也参与了LPS诱导的机体损伤[12-13]。然而，目前没有足够的证据表明铁死亡参与了LPS诱导的AMI。铁死亡是一种新型的细胞死亡方式，其特征是脂质过氧化、线粒体膜密度增加和细胞内的铁离子积累[14]。Nrf2除了众所周知的抗氧化和抗炎作用外，还可以修饰细胞内的亚铁离子，从而抑制铁死亡[6]。前期研究发现，铁死亡与氧化应激具有非常相似的特征，即铁死亡是氧化应激损伤的重要组成部分[15]。谷胱甘肽过氧化物酶4 (glutathione peroxidase 4，GPX4)可以将有毒的脂质过氧化物转化为H2O[16]，目前，已有研究证实GPX4可缓解铁死亡所带来的不良影响[17]。研究也已证实铁蛋白重链(ferritin heavy chain，FTH1)在介导心脏铁稳态和心脏疾病中发挥重要作用[18]。此外，SLC7A11也是一个重要的角色，因为它可以将谷胱甘肽(glutathione，GSH)的前体胱氨酸转运到细胞质中，而GSH的产生是抑制铁死亡的另一个关键机制[19]。最新研究表明，高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)除具有核功能外，也参与了铁死亡的调控过程[20]。前列腺素过氧化物合成酶2 (PTGS2)是公认的铁死亡标志物[21，研究表明，在LPS诱导的小鼠心肌损伤中，PTGS2表达明显增加[22]。
有研究证实，积雪草提取物积雪草酸(asiatic acid，AA)可以缓解自发性高血压(spontaneous hypertension，SHR)引起的大鼠心肌纤维化，从而改善心功能[23]。此外，本实验室前期研究表明，AA可通过抑制氧化应激和铁死亡减轻LPS诱导的肉鸡急性肾损伤[24-25]。然而，AA能否缓解LPS诱导的肉鸡AMI及其作用机制尚不明确。因此，本研究旨在阐明AA的潜在作用机制，为今后研究使用天然产物治疗LPS诱导的肉鸡AMI提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验设计动物试验经华南农业大学动物使用伦理委员会批准(2021b112)。50只1日龄雄性肉鸡购自大华农公司(SCXK 2018-0019)，提供充足的日粮，适应性饲养1周后，将50只肉鸡随机平均分为5组，即对照组(Control)、LPS组(LPS)、低剂量AA组(LPS+AA 15 mg·kg-1)、中剂量AA组(LPS+AA 30 mg·kg-1)和高剂量AA组(LPS+AA 60 mg·kg-1)。在7日龄时，所有AA组用相应剂量的AA预处理(灌胃)14 d，对照组和LPS组用相应剂量的羧甲基纤维素钠预处理14 d。在16、18和20日龄时，LPS组和所有LPS+AA组腹腔注射0.5 mg·kg-1 LPS。在21日龄时，处死肉鸡并采集心肌组织样品，部分用PBS清洗后保存于-80 ℃，剩下心组织样品置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定48 h，用于后续试验。
1.2 试验试剂与仪器脂多糖(E.coli 055:B5 L2880)购自美国Sigma公司；积雪草酸(98%)购自上海阿拉丁有限公司；GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒、RIPA裂解液购自上海碧云天公司。化学发光(ECL)试剂盒、BCA检测试剂盒、RNA逆转录试剂盒(R312-01)购自南京Vazyme公司；TRIzol购自日本TaKaRa公司；SLC7A11、Nrf2、HMGB1和Keap1一抗购自北京Bioss公司；HO-1、NQO1购自沈阳万类生物公司；GPX4和β-actin购自南京Bioword公司；FTH1购自上海Abmart公司。
酶标仪(Elx808)购自美国Bioteck公司；SDS-PAGE蛋白电泳仪(BG-power 600)购自上海天能公司；基因扩增仪(MyCycler Thermal)购自美国Bio-Rad公司；荧光定量PCR仪(LightCycler480)购自美国Roche公司；组织切片机(RM2235)、正置荧光显微镜(DMi8)、光学显微镜(DM1000)均购自德国Leica。
1.3 组织病理学检查将心肌组织置于4%多聚甲醛中浸泡48 h后，切成合适大小并移入包埋盒，用流水冲洗过夜。随后用石蜡将组织包埋，通过切片机将组织包埋块切成4 μm薄片，黏附于病理级载玻片上，37 ℃烘烤过夜，用于后续试验。通过苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin, HE)染色，在光学显微镜下观察组织形态学变化。
1.4 抗氧化指标测定称取适量心肌组织，用PBS按1 ∶9的比例稀释匀浆，4 ℃，10 000×g条件下离心10 min后取上清液，严格按照上海碧云天氧化应激试剂盒说明书操作测定MDA含量和GSH-Px活性。
1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)使用TRIzol裂解液从保存的心肌组织中提取总RNA，并通过微量核酸分析仪测定RNA的总浓度和纯度。然后严格按照RNA逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录获得cDNA。使用美国Primer Express 5.0软件设计相关引物，并送至北京擎科新业生物技术有限公司合成。最后将反转录后的cDNA通过实时荧光定量PCR仪检测各基因表达水平，通过2-ΔΔCT法计算mRNA的相对差异。相关引物序列见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
使用RIPA裂解液提取总蛋白，并严格按照BCA试剂盒的说明书将蛋白定量至1.25 μg·μL-1，随后将样品与Lodding buffer按体积比4 ∶1进行混合后在100 ℃下沸腾10 min，结束后分装储存。通过12.5%的SDS-PAGE凝胶分离蛋白，并转移到PVDF膜上。用TBST洗涤条带3次，然后将条带置于适量的脱脂奶粉中于室温下封闭1 h。洗涤3次后，分别倒入SLC7A11、Nrf2、HMGB1、Keap1、HO-1、NQO1、GPX4、FTH1和β-actin等抗体并置于4 ℃冰箱孵育16~18 h。洗涤条带3次后，加入HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗孵育1 h。随后，使用增强化学发光(ECL)试剂盒在全自动化学发光系统检测蛋白条带的表达。
1.7 免疫组织化学技术检测SLC7A11和Nrf2蛋白的表达与分布将心肌组织切成4 μm的切片，55 ℃烤片40 min。在加热至即将沸腾的10 mmol·L-1的柠檬酸钠溶液(pH=6.0)中反应10 min进行抗原修复。随后经PBS洗涤3次，用10%马血清在37 ℃条件下封闭1 h，然后分别将切片与SLC7A11和Nrf2抗体在4 ℃湿润环境中孵育16~18 h。第2天，使用辣根过氧化物酶标记二抗在室温条件下孵育1 h，并通过DAB显示液进行显色。随后用苏木精染核8 min，梯度酒精脱水，光学显微镜观察心肌组织中SLC7A11和Nrf2蛋白表达与分布并采集相片，通过ImageJ软件进行分析。
1.8 免疫荧光技术检测GPX4蛋白的表达与分布将4 μm心肌切片经二甲苯和分级酒精处理后，在加热至即将沸腾的10 mmol·L-1的柠檬酸钠溶液(pH=6.0)中反应10 min进行抗原修复。随后，用0.5% Triton X-100进行细胞膜穿孔30 min，然后用10%马血清在37 ℃条件下封闭30 min。使用PBS清洗3次后将切片与GPX4抗体在4 ℃孵育过夜(16~18 h)，第2天，切片用PBS清洗3次后与FITC标记二抗孵育1 h。用DAPI染细胞核进行定位，再用抗荧光淬灭剂滴加在组织上后即可封片，并在正置荧光显微镜下观察并采集照片。
1.9 数据处理采用Graph Pad Prism 8(USA)对数据进行统计学分析并生成图像，所有混合数据均以3个或3个以上独立试验的“平均值±标准差(mean±SD)”表示，根据每组数据的平均值选择最具代表性的图像。组间数据采用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05表示差异有统计学意义。“#”表示LPS组与对照组比较，“*”表示AA处理组与LPS组比较。
2 结果 2.1 AA对LPS诱导的肉鸡AMI组织形态学上的影响如图 1所示，细胞质和细胞核分别经酸性伊红和碱性苏木精染色，其中，对照组心肌组织形态正常，而LPS组心肌纤维断裂并呈波浪状排列，心肌纤维间间隙增宽，而AA预处理各个剂量组都减轻了上述损伤。
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黄色箭头指示心肌细胞模糊不清，呈波浪状排列；黑色箭头指示心肌纤维断裂，间隙明显增宽 Yellow arrow points to the myocardial cells are blurred and arranged in waves. Black arrow points to myocardial fiber rupture, the gap is significantly widened 图 1 AA对LPS诱导肉鸡AMI的保护作用(400×) Fig. 1 Protective effect of AA on LPS-induced AMI in broilers(400×) |
为评估LPS和AA对肉鸡心肌组织氧化应激的影响，本研究检测了GSH-Px活性和MDA水平。如表 2所示，LPS组的MDA水平显著升高(P＜0.01)，而GSH-Px活性降低；相反，用AA预处理后，LPS引起的MDA升高被显著抑制，而GSH-Px活性呈剂量依赖性升高(P＜0.05)。
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表 2 氧化应激相关指标 Table 2 Relevant indicators of oxidative stress |
如图 2所示，与对照组相比，LPS显著降低了GCLC(P＜0.001)、GCLM(P＜0.01)、HO-1(P＜0.001)、NQO1(P＜0.001)和Nrf2(P＜0.01)的mRNA表达水平，显著增加了Keap1的mRNA表达水平(P＜0.01)。AA预处理则显著增加了GCLC(P＜0.001)、GCLM(P＜0.05)、HO-1(P＜0.01)、NQO1(P＜0.001)和Nrf2(P＜0.05)的mRNA表达水平，显著降低了Keap1的mRNA表达水平(P＜0.05)。Western blot结果显示，LPS诱导下肉鸡心肌Nrf2(P＞0.05)、NQO1(P＞0.05)和HO-1(P＜0.001)的蛋白表达水平降低，Keap1的蛋白表达显著升高(P＜0.001)。然而，与LPS组相比，AA预处理后，Nrf2(P＜0.01)、HO-1(P＜0.01)和NQO1(P＜0.01)的蛋白表达均有不同程度的升高，Keap1的蛋白表达极显著降低(P＜0.01)。
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数据均以“mean±SD”(n=4)表示。A. 氧化应激相关基因表达水平的热图。B~G. 氧化应激相关的mRNA表达水平。H. Western blot检测心肌氧化应激相关蛋白表达；I~L. 氧化应激相关蛋白的表达水平。“#”表示LPS组与对照组比较差异显著(P＜0.05)，“##”、“###”、“####”表示LPS组与对照组比较差异极显著(P＜0.01)；“*”表示AA处理组与LPS组比较差异显著(P＜0.05)，“ **”、“ ***”、“ ****”表示AA处理组与LPS组比较差异极显著(P＜0.01)。下同 Data are performed as "mean±SD"(n=4); A. Heat map of expression levels of oxidative stress-related genes. B-G. Oxidative stress-related mRNA expression levels. H. Western blot detects relative protein expressions of oxidative stress; I-L. Expression of oxidative stress-related proteins. "#" indicates that the LPS group is significantly different from the control group (P < 0.05), "##", "###" and "####" indicates that the LPS group is strongly significantly different from the control group (P < 0.01), "*" indicates that the AA treatment group is significantly different from the LPS group(P < 0.05), " **", " ***" and " ****" indicates that the AA treatment group is strongly significantly different from the LPS group (P < 0.01). The same as below 图 2 AA对LPS诱导的肉鸡AMI中氧化应激相关基因和蛋白表达水平的影响 Fig. 2 The effects of AA on oxidative stress-related genes and proteins in LPS-induced AMI |
如图 3所示，qRT-PCR结果显示，与对照组相比，LPS显著降低了SLC7A11(P＜0.05)和FTH1(P＜0.001)的mRNA表达，也降低了GPX4的mRNA表达，但差异不显著(P＞0.05)。同时显著增加了PTGS2(P＜0.01)和HMGB1(P＜0.001)的mRNA表达水平。AA预处理则显著增加了SLC7A11(P＜0.05)、FTH1(P＜0.01)和GPX4(P＜0.05)的mRNA表达水平，同时极显著降低了PTGS2和HMGB1的mRNA表达水平(P＜0.001)。Western blot结果显示，LPS诱导下肉鸡心肌SLC7A11、FTH1和GPX4的蛋白表达水平有所降低，但差异不显著(P＞0.05)，HMGB1的蛋白表达水平则表现升高(P＞0.05)。然而，与LPS组相比，AA预处理后，SLC7A11(P＜0.001)、FTH1(P＜0.05)和GPX4(P＜0.01)的蛋白表达水平均有不同程度的上调，HMGB1的蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)。
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A. 铁死亡相关基因表达水平的热图。B~F. 铁死亡相关的mRNA表达水平。G. Western bolt检测心肌铁死亡相关蛋白表达；H~K.铁死亡相关蛋白的表达 A. Heat map of expression levels of ferroptosis-related genes. B-F. Ferroptosis-related mRNA expression levels; G. Western blot detects relative protein expressions of ferroptosis; H-K: Expression of ferroptosis-related proteins 图 3 AA对LPS诱导的肉鸡AMI中铁死亡相关基因和蛋白表达水平的影响 Fig. 3 The effect of AA on ferroptosis-related genes and proteins in LPS-induced AMI |
通过免疫组织化学法检测心肌细胞中SLC7A11和Nrf2的表达，结果如图 4所示。阳性表达使细胞呈棕黄色。结果显示，与LPS组相比，各AA预处理组心肌细胞中SLC7A11和Nrf2的阳性表达均极显著增加(P＜0.001)，其中以LPS+AA 30 mg·kg-1组最为明显。
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A、B. 免疫组织化学检测Nrf2蛋白的表达；C、D. 免疫组织化学检测SLC7A11蛋白的表达 A, B. Immunohistochemistry detect the protein expression of Nrf2; C, D. Immunohistochemistry detect the protein expression of SLC7A11 图 4 Nrf2和SLC7A11免疫组织化学分析(400×) Fig. 4 The immunohistochemical analysis of Nrf2 and SLC7A11(400×) |
结果如图 5所示，通过免疫荧光检测AMI肉鸡心肌细胞中GPX4的表达。其中细胞核经DAPI标记呈蓝色，而胞浆中的GPX4蛋白经FITC标记呈现绿色。LPS诱导下LPS组心肌细胞中GPX4表达下降(P＞0.05)，而AA预处理各组中GPX4表达显著升高(P＜0.001)，且呈剂量依赖性。
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A、B. 免疫荧光检测GPX4蛋白的表达 A, B. Immunofluorescence detects the GPX4 protein expression 图 5 AA对LPS诱导肉鸡AMI中GPX4蛋白表达的影响(400×) Fig. 5 The effect of AA on the GPX4 protein expression in LPS induced AMI in broilers (400×) |
病原体感染一直是养禽业乃至整个畜牧业都难以彻底解决的问题。细菌感染后引发的LPS刺激严重影响着肉鸡健康，并可导致肉鸡生产性能下降，甚至大量死亡[26]。以往的应对方案选择广泛使用抗生素，但遗憾的是抗生素的长期应用会导致细菌产生耐药性等严重后果[27]。因此，探索安全、有效的饲料添加剂来替代抗生素就显得非常关键，这也是本研究的意义所在。已有许多研究证实，LPS诱导的内毒素血症可通过多种发病机制引起心功能不全，氧化应激就是其中之一[28-29]。同时，越来越多的证据表明，AA具有包括抗氧化[30]、抗纤维化[31]、抗炎等[32]在内的多种有益作用。前期研究表明，AA可用于预防小鼠压力超负荷引起的心肌肥大[33]。也有研究报道，灌胃给予AA可减轻LPS刺激引起的小鼠心动过速[34]。然而，目前关于AA在LPS诱导的肉鸡AMI中的作用研究较少。本研究首次证明了AA可通过Nrf2通路减轻LPS诱导的肉鸡AMI中的氧化应激和铁死亡。
研究表明，LPS可诱导小鼠出现明显的心肌结构损伤，如间质水肿、肌纤维排列紊乱等[35-36]。本课题组前期研究已经证明，饲喂剂量为60 mg·kg-1的AA未见明显肝毒性[37]。本研究HE染色显示，LPS组心肌纤维断裂呈波浪状排列，心肌纤维间隙增宽；而AA预处理则减轻了上述损伤。此外，MDA可间接反映细胞损伤程度，因此常作为评价氧化应激水平的指标[4]。GSH则在抵抗氧化损伤中起着重要的作用，这种作用主要依赖于GSH-Px的催化反应。因此，检测GSH-Px的活性也有助于评估细胞损伤的程度[5]。本试验中，LPS组中MDA水平明显升高，而GSH-Px活性明显下降。这也与其他研究结果一致[38-39]。AA预处理后MDA水平显著降低，GSH-Px活性则显著增强，并表现出剂量依赖的趋势。这些都表明AA对LPS诱导的心肌结构损伤和氧化应激具有预防作用。
Nrf2是抗氧化系统调节非常重要的关键因子，参与了药物代谢、抗氧化和解毒等过程的调节。正常情况下，Nrf2通过与Keap1结合而不断降解，而下调Keap1可促进Nrf2的表达，从而提高下游抗氧化蛋白的水平。体内外各种因素刺激引起的氧化应激一直是Nrf2表达的主要触发因素[40]。已有许多证据表明，当Nrf2被激活后，它启动了一个涉及多个步骤的激活途径，包括核转位和与抗氧化反应元件结合，从而将氧化损伤降低到对细胞存活无害的水平[41]。此外，GCLC和GCLM也受到Nrf2的调控，并可相互作用，共同催化GSH的合成[42]。有研究表明，GCLM基因缺失的小鼠体内GSH的表达量仅为正常水平的10%[43]。本研究中发现，LPS诱导下Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和GCLM的mRNA表达明显下降，而Keap1的mRNA的表达则显著上升；LPS还抑制了Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达并增加了Keap1的蛋白表达。有趣的是，AA预处理下显著缓解了LPS所带来的这些影响。本研究表明，AA预处理上调了Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和GCLM的mRNA表达并抑制了Keap1的mRNA表达，Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达也显著上调，Keap1则显著下降。此外，通过免疫组织化学法检测各组心肌细胞中Nrf2的表达，结果也显示了同样的趋势。这些结果都首次表明了，AA预处理可以通过调控氧化应激相关的基因和蛋白表达来减轻LPS诱导的肉鸡AMI。
铁死亡是2012年发现的一种程序性铁依赖的细胞死亡方式，是一种不同于自噬、坏死和凋亡的独特的细胞死亡方式[14]。最近，有新的证据确立了铁死亡在心肌病发病机制中的重要性。例如，在阿霉素(Doxorubicin，DOX)和心肌缺血再灌注(I/R)共同诱导的小鼠心肌损伤模型中，铁死亡是一个重要的机制[44]。使用铁螯合剂或药物抑制铁死亡可明显缓解心肌病变。有研究证明，铁死亡可通过调节内质网应激参与糖尿病心肌I/R损伤，而抑制内质网应激或铁死亡可最大程度减轻损伤程度[45]。PTGS2是公认的铁死亡标志物，通常是铁死亡细胞中上调最明显的基因[14]。此外，GPX4活性的降低也是铁死亡发生的一个重要指标。研究表明，GPX4可以将脂质氢过氧化物转化为无毒的羟基衍生物，从而阻止铁死亡[46]。最近的研究发现，HMGB1也与铁死亡密切相关。比如，研究表明在急性肝衰竭(acute hepatic failure，AHF)小鼠模型中，阻断HMGB1可明显抑制铁死亡[47]。此外，SLC7A11和FTH1的表达也是由Nrf2介导的，当半胱氨酸/谷氨酸转运体(SLC3A2/SLC7A11复合物)对半胱氨酸的摄取受到干扰时，细胞抗氧化防御屏障被破坏，导致GSH耗竭，最终引发铁依赖性的细胞死亡[48]。FTH有铁氧化酶活性，可以将细胞中的Fe2+催化为Fe3+并储存[49]。本研究中发现，LPS降低了SLC7A11、FTH1和GPX4的mRNA和蛋白表达并增加了HMGB1的mRNA和蛋白表达，同时PTGS2的mRNA表达也显著升高。而AA预处理下明显增加了SLC7A11、FTH1和GPX4的mRNA和蛋白表达，HMGB1的mRNA和蛋白表达则显著下降。此外，通过免疫组织化学法和免疫荧光法分别检测SLC7A11和GPX4在心肌细胞中的表达和分布，结果也表现出同样的趋势。以上这些结果均指示AA可以通过抑制铁死亡来减轻LPS所诱导的肉鸡AMI。这与其他研究表明AA能有效抑制铁死亡的结果一致[14, 24]。值得一提的是，上述各AA预处理组的结果均表现出剂量依赖的趋势。
4 结论本研究探讨了AA对LPS诱导的肉鸡AMI中氧化应激和铁死亡的作用。结果表明，LPS可引起肉鸡AMI，且本研究首次证明了AA预处理可通过抑制氧化应激和铁死亡减轻LPS诱导的AMI。本研究为LPS诱导的肉鸡AMI提供了一种有前景的预防和治疗策略。此外，LPS诱导的肉鸡AMI过程是否涉及其他信号通路的表达，而这些信号通路与氧化应激和铁死亡是否存在关联，这些疑问未来都需要研究人员去作进一步探索和验证。
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(编辑 范子娟)