2. 韶关学院英东生物与农业学院，韶关 512005
, YE Jiali1, QIU Wenyue1, ZHANG Xinting1, PANG Xiaoyue1, WANG Rongmei2, TANG Zhaoxin1, SU Rongsheng1
2. Henry Fok College of Biology and Agriculture, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China
细胞焦亡是指细胞促炎程序性死亡。当大量的炎性小体聚集时，细胞发生焦亡，此时Gasdermin D(GSDMD)被激活的Caspase家族蛋白裂解，并在细胞膜形成1~2 μm的孔洞，使成熟的IL-18、IL-1β以及Caspase-1等炎性因子释放至细胞外，放大炎性反应[1]。细胞死亡或过量分泌高迁移率蛋白1(HMGB1)会加剧机体的炎症反应，并且HMGB1易结合其他如IL-18和IL-1β等促炎因子产生协同作用[2]。
脂多糖(LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要组成成分，可诱导机体产生炎症反应。Toll样受体-4(TLR4)作为一种模式识别受体可以有效识别细胞外的LPS，激活NF-κB来诱导炎症和促炎因子的产生[3]。近年来，LPS作为一种诱导炎症模型药物，常用于诱导动物机体产生乳腺炎、急性肺损伤以及脓毒症[4-6]。LPS对肉鸡急性肾损伤中HMGB1/TLR4/NF-κB通路的作用机制仍有待进一步阐明。
积雪草酸(asiatic acid，AA)又称为亚细亚酸，是积雪草的提取物，其有效成分为三萜类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、护肝、神经保护等作用[7-10]，通过先前的研究得知，积雪草酸能通过Nrf2途径抑制氧化应激和铁死亡，从而减轻LPS诱导的肉鸡急性肾损伤[9]，但积雪草酸能否通过抑制典型细胞焦亡通路来减轻LPS诱导的肉鸡肾损伤目前尚未见报道。因此本研究通过建立LPS模型，探讨AA对LPS诱导肉鸡肾细胞焦亡的影响，以期为后续研究提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计将40只1日龄健康黄羽肉鸡(SCXK 2018-2019)适应性饲养7 d后，随机分成4组：空白对照组(CON)、LPS诱导模型组(LPS)、AA低剂量组(LPS+AA 15 mg·kg-1)和AA高剂量组(LPS+AA 30 mg·kg-1)。AA悬浮于羧甲基纤维素钠溶液，空白对照组肉鸡每日灌胃相同剂量的羧甲基纤维素钠悬浮液，AA处理组的肉鸡每日使用对应剂量的AA连续灌胃14 d，在16、18和20日龄时对LPS诱导模型组和AA处理组腹腔注射0.5 mg·kg-1的LPS构建急性肾损伤模型，在20日腹腔注射LPS 12 h后处死肉鸡并采集肾组织样品。本次动物试验经华南农业大学动物使用伦理委员会批准(2021b112)。
1.2 试剂与仪器脂多糖(E. coli 055:B5 L2880)、多聚甲醛固定液购自美国Sigma公司；积雪草酸(98%)购自上海阿拉丁有限公司；羧甲基纤维素钠购自北京索莱宝；组织包埋块购自武汉塞维尔有限公司；BCA蛋白检测试剂盒、PAGE凝胶快速制备试剂盒(12.5%)、RNA逆转录试剂盒(R312-01)和qPCR荧光染料Master Mix (Q711-02)购自南京诺唯赞有限公司；Trizol裂解液购自日本TaKaRa；Caspase-1、HMGB1、IL-1β、IL-18、NLRP3、P65、P-P65、TLR4、TNF-α、IκB、P-IκB、ASC和Cleaved caspase-1/Caspase-1抗体购自沈阳万类生物公司；GAPDH抗体购自南京巴傲得生物公司。
酶标仪(Elx808)购自美国Bioteck公司；基因扩增仪(MyCycler Thermal)购自美国Bio-Rad公司；荧光定量PCR仪(LightCycler480)购自美国Roche公司；光学显微镜(DM1000)、正置荧光显微镜(DMi8)、组织切片机(RM2235)购自德国Leica；低温高速离心机(D3024R)购自美国SCILOGEX公司；SDS-PAGE蛋白电泳仪(BG-power 600)购自上海天能公司。
1.3 病理组织学观察和记分肾组织包埋由武汉塞维尔公司提供服务，制备完成的蜡块经切片机中切成4 μm厚的切片，37 ℃晾干过夜。染色前55 ℃烤片1 h后经两次二甲苯透明，100%、90%、80%、70%、60%的酒精梯度复水，苏木精染核、1%盐酸酒精分色，自来水反蓝，60%、70%、80%、90%的酒精梯度脱水，伊红染细胞质，90%、95%的酒精分色，两次100%酒精脱水，两次二甲苯透明，用中性树脂封片，于光学显微镜下观察拍照。采用双盲的方式随机选取每组6张病理切片进行评分：按肾小管空泡样变性、肾小球萎缩等病变程度由低到高记为1~4分，正常组织记为0分[11]。
1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)称取肾组织20 mg，按照Trizol试剂盒的步骤提取总RNA；微量紫外分光光度计测定所提取RNA的浓度和纯度，将其稀释为500 ng·μL-1；按照反转录试剂盒的操作步骤将RNA反转录为cDNA，稀释10倍备用。从NCBI获取引物序列，引物序列由广州擎科生物公司合成；引物序列见表 1，GAPDH为管家基因。按照2 μL cDNA、上下游引物各0.8 μL、6.4 μL DEPC水和10 μL荧光染料Master Mix的体系进行实时荧光定量分析，采用2-ΔΔCt方法计算试验结果。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
称取20 mg肾组织样品，加入250 μL RIPA裂解液，于冰上匀浆后静置裂解10 min，随后在4 ℃ 12 500 g离心10 min，收集上清液，使用BCA蛋白检测试剂将其蛋白浓度定量至1.25 μg·mL-1，样品与loading buffer按4 ∶1的比例混合，煮沸10 min，待其冷却至室温时分装置于-80 ℃冰箱备用。蛋白样品于SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，用5%奶粉封闭1 h，与HMGB1、TLR4、P-P65、NLRP3、GSDMD、IL-1β和Cleaved caspase-1/Caspase-1抗体孵育16~18 h，二抗孵育1 h，使用ECL显影液显影曝光，Image J软件分析条带。
1.6 免疫组化技术检测P-IκB蛋白的表达与分布将肾组织制备成4 μm厚的石蜡切片，37 ℃晾干过夜。55 ℃烤片1 h，经3次二甲苯透明，每次5 min；100%、90%、80%、70%、50%酒精各5 min梯度复水；PBS清洗3次，每次10 min；将切片放入酸性抗原修复液中，让液体处于沸腾前的状态持续10 min，取出切片自然冷却至室温；蒸馏水清洗1次，放入85%甲醇配制的3%H2O2反应10 min；PBS清洗3次，放入由PBS配制的10%马血清于37 ℃封闭1 h；PBS清洗3次，用P-IκB抗体于4 ℃孵育16 h；PBS清洗3次，二抗室温孵育1 h；PBS清洗3次，滴加DAB显色液显色，PBS终止反应；苏木精染核8 min，蒸馏水清洗；1%盐酸酒精分色后, 自来水洗15 min；50%、70%、80%、90%、100%酒精各5 min梯度脱水，3次二甲苯透明，用中性树胶封片，于显微镜下观察拍照，Image J软件分析光密度。
1.7 免疫荧光技术检测HMGB1、NLRP3、ASC蛋白的表达与分布肾组织石蜡切片经脱蜡、抗原修复(操作同“1.6”)，放入1%的Triton溶液中反应30 min进行细胞膜穿孔，PBS清洗3次；放入由PBS配制的10%马血清于37 ℃封闭1 h，PBS清洗3次；用HMGB1、NLRP3、ASC抗体于4 ℃孵育16 h；在避光环境下使用Cy3和Fitc室温孵育二抗1 h，PBS清洗3次；DAPI染3 min，用抗荧光淬灭剂封片，于荧光显微镜下观察拍照，image J软件分析光密度。
1.8 数据处理使用Excel 2016处理数据，GraphPad Prism 9进行单因素方差分析(one-way ANOVA)与作图，多重比较为Tukey检验，结果以“平均值±标准差(x±s)”表示，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著；“*”表示与空白对照组相比的差异，“#”表示与LPS诱导模型组相比的差异。
2 结果 2.1 AA对鸡肾组织形态的影响如图 1A~D所示，空白对照组肾组织无明显病变，LPS诱导模型组出现肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管上皮细胞脱落以及肾小球发育不良等病理变化，而经过AA预处理后，有效地改善LPS诱导的肉鸡肾组织病理损伤，30 mg·kg-1剂量的AA较15 mg·kg-1的AA能更有效地降低肉鸡肾病理损伤。
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A~D. 各组肾病理组织学检查(200×)，红色箭头示肾小管上皮细胞空泡变性，黑色箭头示肾小球发育不良；黄色箭头示肾小管上皮细胞脱落；E. 肾病理损伤评分 A-D. Renal histopathological examination (200×) of different group, red arrows indicate glomerular vacuolar degeneration, blue arrows indicate glomerular dysplasia, yellow arrows indicate detachment of renal tubular epithelial cells; E. The pathology damage score in kidney 图 1 肾组织形态的变化 Fig. 1 The change of the kidney tissue morphology |
如图 1E所示，LPS诱导模型组的肾病理损伤评分与空白对照组相比显著升高(P＜0.01)，而经AA预处理后，肾病理损伤程度得到有效的抑制(P＜0.05或P＜0.01)，且呈剂量依赖性。
2.2 AA对鸡肾细胞焦亡相关基因和蛋白的影响如图 2A~E所示，与空白对照组相比，LPS诱导模型组会使肾组织中NLRP3、Cleaved caspase-1/Caspase-1、GSDMD的蛋白含量显著升高(P＜0.05)，使肾组织中IL-1β的蛋白水平升高，但差异不显著(P＞0.05)；与LPS诱导模型组相比，经过AA预处理后肾组织中的NLRP3、Cleaved caspase-1/Caspase-1和IL-1β的蛋白含量显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，如图 2F~J所示，与空白对照组相比，LPS会使肾组织中NLRP3、IκB、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA水平显著升高或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01)；与LPS诱导模型组相比，经过AA预处理后肾组织中的NLRP3、IκB、Caspase-1和IL-18的mRNA水平显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
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A. Western bolt检测细胞焦亡相关蛋白表达；B~E. 细胞焦亡相关蛋白的表达；F~J. 细胞焦亡相关基因的表达 A. Western blot detected relative protein of pyroptosis; B-E. Expression levels of related pyroptosis protein; F-J. Expression levels of related pyroptosis mRNA 图 2 细胞焦亡相关基因和蛋白的表达水平 Fig. 2 Expression levels of related pyroptosis genes |
如图 3A~D所示，与空白对照组相比，LPS诱导模型组中HMGB1和P-P65的蛋白水平显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，TLR4的蛋白水平有上升的趋势，但差异不显著(P＞0.05)；与LPS诱导模型组相比，经AA预处理的肾组织中TLR4和P-P65的蛋白水平显著或极显著下降(P＜0.05或P＜0.01)，HMGB1的蛋白水平有下降的趋势，但差异不显著(P＞0.05)。如图 3E~H所示，与空白对照组相比，LPS诱导模型组肾组织中HMGB1、TLR4、P65和TNF-α的mRNA水平显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01)；与LPS诱导模型组相比，经过AA预处理后肾组织中的HMGB1、TLR4、P65和TNF-α的mRNA水平显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
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A. Western bolt检测HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白；B~D. HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白的表达；E~H. HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关基因的表达 A. Western blot detected relative protein of HMGB1/TLR4/NF-κB pathway; B-H. Expression levels of related HMGB1/TLR4/NF-κB pathway protein; E-H. Expression levels of related HMGB1/TLR4/NF-κB pathway mRNA 图 3 HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白和基因的表达水平 Fig. 3 Expression levels of related HMGB1/TLR4/NF-κB pathway protein and mRNA |
如图 4所示，与空白对照组相比，LPS极显著增加了肉鸡肾组织中的P-IκB蛋白的表达(P＜0.01)；而与LPS诱导模型组相比，经AA预处理后表达呈剂量依赖性极显著下降(P＜0.01)。
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A.肾中的P-IκB；B. P-IκB的平均光密度 A. HMGB1 in the kidneys; B. Average optical density of P-IκB 图 4 P-IκB蛋白在肾组织中的表达 Fig. 4 The expression of P-IκB protein in renal tissue |
如图 5所示，与空白对照组相比，肉鸡经LPS造模后极显著地提高了肾组织中HMGB1的表达(P＜0.01)；与LPS诱导模型组相比，AA低剂量组中肉鸡肾的HMGB1表达显著降低(P＜0.05)而AA高剂量组则极显著地降低肉鸡肾组织中HMGB1的表达(P＜0.01)。如图 6所示，与空白对照组相比，肉鸡经LPS处理后极显著地提高了肾组织中NLRP3的表达(P＜0.01)；与LPS诱导模型组相比，AA低剂量组降低了肉鸡肾组织中NLRP3的表达，但差异不显著(P＞0.05)，而AA高剂量组显著降低了肉鸡肾组织中NLRP3的表达(P＜0.05)。如图 7所示，LPS诱导模型组与空白对照组相比，极显著地提高了肉鸡肾中ASC的表达(P＜0.01)；而经AA预处理后，肉鸡肾中ASC表达呈剂量依赖性极显著降低(P＜0.01)。
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A.肾中的HMGB1；B. HMGB1在肾组织中的表达 A. HMGB1 in the kidneys; B. Expression of HMGB1 in renal tissues 图 5 HMGB1蛋白在肾组织中的表达 Fig. 5 The expression of HMGB1 protein in renal tissue |
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A.肾中的NLRP3；B. NLRP3在肾组织中的表达 A. NLRP3 in the kidneys; B. Expression of NLRP3 in renal tissues 图 6 NLRP3蛋白在肾组织中的表达 Fig. 6 The expression of NLRP3 protein in renal tissue |
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A. 肾中的ASC；B. ASC在肾组织中的表达 A. ASC in the kidneys; B. Expression of ASC in renal tissues 图 7 ASC蛋白在肾组织中的表达 Fig. 7 The expression of ASC protein in renal tissue |
当前，细菌对抗生素的耐药性日益增强，减抗替抗已成为畜牧养殖的发展方向，寻找新的药物来替代抗生素成为当下的热门研究方向。LPS是革兰阴性菌细胞壁的有效成分，其作用机理是通过与TLR4受体结合，引起机体发生炎性反应。AA作为一种从植物积雪草中提取出的有效成分，在抗炎方面有着巨大的潜力[12-13]。本试验研究结果发现，通过AA预处理可以有效减轻由LPS诱导的肉鸡肾损伤，且效果呈剂量依赖性。
当机体受到外源性LPS的刺激时，机体中的先天性免疫系统被激活，进而释放出炎症小体。被释放的炎症小体是由NOD样小体、接头蛋白ASC和效应分子Pro-caspase-1组成的。当炎症小体被激活时，会促进Caspase-1的裂解和激活，进而介导促炎因子IL-18和IL-1β的裂解，同时还会促进GSDMD的分裂，产生细胞焦亡[14]。近年来，细胞焦亡被认为是抵御病原体感染的关键性防御手段，它通过清除被感染的免疫细胞来阻止病原体的扩散[15]。由多种炎症小体调节的细胞焦亡在多种肾疾病发展中都起重要的作用，如糖尿病肾病中，由于高糖刺激导致NLRP3、Caspase-1、TNF-α、IL-1β和IL-18的表达升高，从而介导了肾病的发生[16-17]，这与本试验的研究结果相同。朱丽华等[18]指出，经过AA的预处理可以有效减轻由LPS造模引起脓毒症对小鼠造成的急性肾损伤，AA预处理可以降低TNF-α、IL-1β等炎性因子的表达，这与本研究的结果相同。Wang等[19]发现由LPS诱导急性肾损伤会导致TNF-α、GSDMD等焦亡相关因子的表达升高。本研究中也发现了在LPS的作用下，肾组织中出现肾小管上皮细胞空泡样变性、肾小管上皮细胞脱落和肾小球发育不良的病理变化，同时NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD、ASC等细胞焦亡相关蛋白和基因表达显著升高，说明肾出现了不同程度的细胞焦亡。经过AA预处理后NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD、ASC细胞焦亡相关蛋白和基因表达显著升高，这与前人的研究结果相同[20-21]。
高迁移率蛋白(HMGB1)为哺乳动物细胞中的核DNA蛋白，从活化的巨噬细胞中释放，诱导促炎因子产生炎症反应[22]。TLR4是HMGB1依赖性激活巨噬细胞释放TNF的关键因子[23]，HMGB1激活TLR4受体后进而活化NF-κB，进一步加重炎症反应。Li等[24]研究指出AA可以通过TLR4/NF-κB通路减轻LPS所引起急性肺损伤；有研究指出，在降低HMGB1蛋白水平，抑制TLR4受体表达后可以抑制肾组织炎症反应[25]。Zhang等[26]发现通过抑制氧化应激和HMGB1/TLR4/NF-κB通路，可以减轻由LPS诱导引起的肝肾损伤[26]。在本试验中，采用AA低剂量和高剂量处理后，HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白和基因的表达呈现了不同程度的降低，说明AA可以通过HMGB1/TLR4/NF-κB途径有效减轻由LPS引起的肾损伤。本试验为AA的抗炎作用机制提供了新的方向。
4 结论积雪草酸预处理可以通过HMGB1/TLR4/NF-κB通路减轻由LPS引起的鸡肾细胞焦亡，从而改善肾损伤。
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(编辑 白永平)