2. 中国人民解放军东部战区总医院医疗保障中心实验动物室，南京 210002
2. Department of Laboratory Animal, Chinese PLA General Hospital of Eastern Theater Command, Nanjing 210002, China
溃疡性结肠炎是一种典型的结肠炎症性疾病，表现为血性腹泻、全身感染等症状，严重者可导致死亡，严重威胁着人和动物的身体健康[1]。肠道菌群失调、肠道屏障损伤和免疫反应异常被认为是溃疡性结肠炎的重要致病机制[2]。最近，肠血管屏障的存在被Spadoni等[3]证明，肠血管屏障损伤在溃疡性结肠炎中的作用也越来越受到重视。有研究提出，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGFA)的异常表达可能是溃疡性结肠炎血管屏障损伤的重要原因[4]。VEGFA不仅是最有效的促血管生成因子，而且可以促进质膜膜泡关联蛋白(plasmalemma vesicle associated protein, PLVAP)表达，诱导内皮细胞开口，以及诱导血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin protein, VE-cadheirn)内化，破坏黏附连接进而引起血管通透性升高[5-7]。多项研究已证实：血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)诱导同样促进了PLVAP的表达，并且能够靶向VE-cadherin而引起血管通透性升高[8-9]。另一项研究进一步指出血管紧张素Ⅱ受体-1(Ang Ⅱ receptor type 1, AT1R)拮抗剂可以抑制VEGFA诱导的血管通透性升高[10]。提示AngⅡ参与了血管屏障的调控。
肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system, RAS)由经典通路(classic renin angiotensin system, cRAS) 和调节通路(regulatory renin angiotensin system, rRAS)两条通路组成。cRAS通路包括血管紧张素转化酶(angiotensin-coverting enzyme, ACE)、Ang Ⅱ和AT1R。rRAS通路包括血管紧张素转化酶2(angiotensin-coverting enzyme, ACE2)、血管紧张素1-7(angiotensin1-7, Ang1-7)和Mas受体(Mas receptor, MasR)[11]。在生理状态下，ACE2/Ang1-7/MasR与ACE/Ang Ⅱ/AT1R通路相互拮抗，维持血压正常和电解质平衡，从而维护机体稳态[12]。而在病理状态下，经典通路中的关键酶ACE异常活化，水解血管紧张素Ⅰ(angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)产生大量Ang Ⅱ，进而与AT1R结合促进组织或细胞炎性损伤、细胞凋亡、纤维化和氧化应激等[13-14]。ACE2是调节通路的主要酶，可以水解Ang Ⅱ生成Ang1-7，后者与MasR结合发挥拮抗ACE/Ang Ⅱ/AT1R通路的作用[15]。ACE2通过水解Ang Ⅱ在多种炎性疾病中发挥保护作用，这已在非酒精性脂肪肝病、肾炎和类风湿性关节炎等多种组织或细胞损伤中得到证实[16-18]。鉴于ACE2在体内存在的广泛性，作为新的靶点，其抗炎、抗损伤作用一直是研究热点。
本试验拟用DSS构建小鼠结肠炎模型，明确小鼠结肠局部ACE2和ACE等RAS主要成分在结肠炎发生发展中的变化，及结肠炎期间血管损伤和与血管病变相关的重要因子VEGFA等的表达变化，并通过分析ACE2和ACE表达与血管屏障关键因子VEGFA的相关性，探讨肠道局部RAS在DSS致小鼠结肠炎及肠血管屏障损伤中的调控作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物4~6周龄雄性健康SPF级ICR小鼠，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，动物许可证号：SYXK(苏)2017-0027。动物饲养于南京农业大学实验动物中心SPF环境中。自由采食，小鼠常规饲料由该实验动物中心提供。所有动物试验符合南京农业大学动物福利与伦理委员会相关要求(GB/T 35892—2018)。
1.2 试剂葡聚糖硫酸钠盐(Dextran sulfate sodium, DSS, MW: 36~50 ku)、粪便隐血试剂盒均购自南京凯默尔生物科技中心；无水乙醚购自南京农业大学实验材料供应中心；4%多聚甲醛通用型组织固定液购自南京寿德试验器材有限公司等。
小鼠VEGFA ELISA试剂盒购自南京南京建成生物工程研究所；小鼠Ang Ⅱ和Ang1-7 ELISA试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司等。双色预染蛋白Marker购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、PVDF膜购自美国Millipore公司；ECL化学发光检测试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司等。
兔源ACE2抗体(anti-ACE2)、ACE抗体(anti-ACE)、β-微管蛋白抗体(anti-β-tubulin)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗[Goat anti-Rabbit IgG (H+L) HRP]均购自南京巴傲得生物科技有限公司；兔源质膜膜泡关联蛋白抗体(anti-PLVAP)购自江苏亲科生物研究中心有限公司等。
1.3 仪器SW-CJ-2FD超净工作台(苏州净化设备有限公司)；LWD200-37 T倒置显微镜(上海测维光电技术有限公司)；Tecan Spark多功能酶标仪(Tecan公司，瑞士)；POWER-PAC300电泳仪(Bio-Rad公司，美国)；POWER-PAC HC转印仪(Bio-Rad公司，美国)；Tanon-3900全自动化学发光图像分析系统(上海Tanon科技有限公司)等。
1.4 动物分组与处理1.4.1 适应性喂养和分组处理 将16只小鼠随机分为4笼，自由采食常规饲料，适应性喂养1周后，按体重相近原则分为正常对照组(Control组)和葡聚糖硫酸钠盐处理组(DSS组)。Control组小鼠从第1天开始每天灌胃0.1 mL生理盐水，持续至第8天，试验全程饮用无添加剂饮用水。DSS组小鼠从第1天开始每天灌胃0.1 mL生理盐水，持续至第8天，从第4天开始在饮用水中添加DSS(终浓度为4%)，每天更新DSS饮用水，持续至第12天，模型构建方法和判断标准参考顾思臻等[19]方法。处理流程如图 1所示。
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图 1 小鼠结肠炎模型构建流程图 Fig. 1 Flowchart of establishment of mouse colitis model |
1.4.2 临床症状观察和DAI评分 试验过程中，每天观察小鼠精神状况、被毛、饮食和肛门出血状况，并拍照记录肛门出血。试验第4天饮用DSS之前称量所有小鼠体重，记为第0天体重，之后每天更换DSS饮用水前称量小鼠体重，记为第m天体重(m=0~8)。
参照Alex等[20]方法从试验第4天饮用DSS之前计算小鼠疾病活跃指数(disease activity index, DAI)，记为第0天DAI，之后每天更换DSS饮用水前计算小鼠DAI。DAI计算公式：DAI=体重下降率评分+粪便性状评分+粪便隐血评分，DAI计算相关参数具体评分标准如表 1。
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表 1 DAI计算相关参数评分标准 Table 1 DAI calculation related parameters scoring standard |
1.5.1 血液样本采集 DSS处理8 d后，禁食12 h。吸入乙醚麻醉小鼠，用1 mL一次性注射于左胸心搏动最强处进针，缓慢回抽进行心采血。2 500 r·min-1 15 min。吸取血清至冻存管中，-80 ℃保存备用。
1.5.2 结肠样本采集 心采血结束后, 处死小鼠，打开小鼠腹腔，完整分离结肠，测量回盲口至肛门肠道长度并拍照记录。分离小鼠结肠，于距离肛门约1 cm截取部分无粪便结肠组织置4%多聚甲醛中固定，剩余组织-80 ℃保存备用。
1.6 结肠组织形态学观察固定组织送武汉赛维尔生物科技有限公司进行组织切片的制作及HE染色。显微镜下观察结肠形态学，包括结肠上皮完整性、炎性细胞浸润、黏膜下层水肿状况和肌层厚度等变化。
1.7 指标测定1.7.1 血液VEGFA含量的ELISA检测 按照VEGFA试剂盒说明书进行。以空白孔调零，450 nm波长下测量各孔样品吸光度，以标准孔浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线方程式计算血清中VEGFA含量(单位：ng·L-1)。
1.7.2 结肠组织中Ang Ⅱ和Ang1-7含量的ELISA检测 称取30 mg结肠组织，加入含有终浓度为1 mmol·L-1 PMSF的预冷PBS中充分匀浆。12 000 r·min-1离心15 min，取上清液备用。
根据Ang Ⅱ和Ang1-7检测试剂盒说明书进行。以空白孔调零，450 nm波长下测量各孔样品吸光度，以标准孔浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算各孔样品中Ang Ⅱ和Ang1-7含量。
1.8 结肠组织中ACE2、ACE和PLVAP蛋白表达的Western blot检测样品制备：分别称取约30 mg各小鼠结肠组织，加入PMSF的预冷RIPA裂解液中充分匀浆。冰浴超声5 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min，取上清液。BCA法测定蛋白浓度，统一稀释至4 μg·μL-1。加入蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴，使蛋白质彻底变性。
SDS-PAGE：浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为10%。每孔上样量为10 μL。以浓缩胶80 V 30 min，分离胶120 V 60 min的条件进行SDS-PAGE电泳。
转印和封闭：将电泳分离后的蛋白质湿法转印到PVDF膜上，转印条件为100V冰浴90 min。依据蛋白Marker，将PVDF膜按照目的蛋白分子量裁剪成不同条带。将条带放入装有5%封闭液的孵育盒中，置于摇床上室温封闭2 h。
抗体孵育：TBST洗涤蛋白条带3次，将anti-β-tubulin按1 ∶10 000，anti-ACE2按1 ∶3 000，anti-ACE和anti-PLVAP按1 ∶1 000比例用TBST稀释，与蛋白条带在4 ℃下孵育过夜。TBST洗涤，将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗按1 ∶10 000比例稀释，与蛋白条带室温孵育2 h。
蛋白显影与定量：TBST洗涤条带3次，与ECL发光液避光孵育1 min，使用凝胶成像系统进行曝光显影。用Image J软件检测目的蛋白条带灰度值，以β-tubulin灰度值为标准，ACE2、ACE和PLVAP灰度值与其相比得到相对表达量。
1.9 数据统计与分析所有数据以“平均数±标准误(x±sx)”表示。使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析和图表生成。两组间单因素数据比较使用双尾学生t检验，两组间双因素数据比较使用双因素方差分析。非参数数据(DAI评分)比较使用Mann-Whitney U检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 DSS诱导建立小鼠结肠炎模型2.1.1 小鼠临床表现和体重变化 临床表现：试验过程中，对照组小鼠正常饮食，精神状态良好，反应灵敏，被毛有光泽。DSS组小鼠食欲减弱，精神沉郁，对外界刺激反应不敏感，被毛杂乱。
体重变化结果由表 2看出，与对照组相比，DSS组小鼠平均体重变化率低于对照组，且随着处理时间的变化而持续下降，并在处理的第8天表现为显著下降(P＜0.05)。
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表 2 小鼠体重变化率(x±sx) Table 2 The change of body weight rate of mice (x±sx) |
2.1.2 疾病活跃指数和结肠长度变化 DAI结果见表 3。由表 3看出，DSS组小鼠DAI极显著升高(P＜0.01)。结肠长度测定结果见图 2所示，DSS组小鼠结肠长度极显著短于正常对照组(P＜0.01)。
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表 3 小鼠疾病活跃指数和结肠长度变化(x±sx) Table 3 The change of DAI and colonic length of mice (x±sx) |
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**. P < 0.01 图 2 小鼠结肠长度变化 Fig. 2 Colonic length change of mice |
2.1.3 小鼠结肠病理组织学结果 结果见图 3。HE染色显示对照组小鼠黏膜层(mu)、黏膜下层(sm)和肌层(m)排列正常，黏膜层顶端吸收柱状细胞排列整齐(arrow)，可见大量杯状细胞(g)，固有层较薄(LP)，含少量淋巴细胞。基底部隐窝丰富(circle)，排列整齐，含大量杯状细胞(g)，黏膜肌层正常(mm)。DSS处理组黏膜层顶端柱状上皮细胞排列混乱，杯状细胞稀少(g)，固有层炎性细胞浸润(IC)。隐窝减少(circle)，隐窝内杯状细胞减少，黏膜肌层肌纤维分离(mm)。
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A~C. 对照组小鼠结肠结构(A.内层排列正常；mu.黏膜；sm.黏膜下层；m.肌层；B黏膜层放大，箭头.柱状吸收细胞；g.杯状细胞；LP.固有层；C. 结肠黏膜底部放大，mm. 黏膜肌层；circle. 隐窝)；D~F. DSS组小鼠结肠结构(D. 内衬结构混乱，mu.黏膜；sm.黏膜下层；m.肌层；E. 结肠黏膜放大；g.杯状细胞；LP.固有层；F. 结肠黏膜底部增大；mm. 黏膜肌层；circle. 隐窝) A-C. Colonic structure of mice in Control group (A. Normal arrangement of the lining layers; mu. Mucosa; sm. Submucosa; m. Musculosa; B. Enlargement of colonic mucosa; arrow. Absorptive columnar cells; g. Goblet cells; LP. Lamina propria; C. Enlargement of the base of the colonic mucosa, mm. Muscularis mucosa; circle. Crypts); D-F. Colonic structure of mice in DSS group (D. Confusing structure of the lining layer; mu. Mucosa; sm. Submucosa; m. Musculosa; E. Enlargement of colonic mucosa; g. Goblet cells; LP. Lamina propria; F. Enlargement of the base of the colonic mucosa, mm. Muscularis mucosa; circle. Crypts) 图 3 小鼠结肠结构HE染色 Fig. 3 HE staining of colonic structure in mice |
结合以上小鼠一般状况、体重变化、DAI、结肠长度及病理组织学变化结果表明，本试验连续给小鼠饮用4% DSS 8 d后会诱发小鼠结肠炎，即试验模型成功建立。
2.2 结肠炎小鼠血管屏障的损伤结果如图 4所示，与对照组相比，DSS组小鼠伴有肠血管损伤，表现为肛门明显出血(图 4A)。ELISA检测显示，小鼠结肠组织中血管通透性重要致病因子VEGFA含量极显著升高(P＜0.01，图 4B)。Western blot检测显示血管内皮通透性升高标志蛋白PLVAP表达极显著升高(P＜0.01，图 4C)。提示：DSS致小鼠结肠炎时，肠血管屏障处于损伤状态。
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A. 小鼠便血图片；B. 血液中VEGFA的含量；C. PLVAP在小鼠结肠组织中的表达。**. P＜0.01 A. The pictures of hematochezia in mice; B. The content of VEGFA in blood; C. Expression of PLVAP in colonic tissue of mice. **. P < 0.01 图 4 小鼠肠道血管屏障的变化 Fig. 4 Changes of gut-vascular barrier in mice |
结果如表 4所示。与正常对照组相比，DSS组小鼠结肠组织中Ang1-7含量显著升高(P＜0.05)，Ang Ⅱ含量极显著升高(P＜0.01)，Ang Ⅱ含量的升高更加明显，是Ang1-7的2.8倍。即Ang Ⅱ处于更高水平状态。
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表 4 小鼠结肠组织中Ang1-7和Ang Ⅱ的含量(x±sx) Table 4 The content of Ang1-7 and Ang Ⅱ in colonic tissue of mice (x±sx) |
结果如图 5所示。与正常对照组相比，DSS组小鼠结肠组织中ACE2 (P＜0.01，图 5A)、ACE(P＜0.01，图 5B)的表达均极显著上调。ACE/ACE2比值极显著升高(P＜0.01，图 5C)。提示DSS诱导结肠炎后，ACE表达占优势。
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A. Western blot检测ACE与ACE2表达；B、C. ACE、ACE2表达的灰度值；D. ACE与ACE2表达比值。**. P＜0.01 A. Western blot detection of ACE and ACE2 expression; B, C. The grayscale values of ACE and ACE2 expression; D. Ratio of ACE to ACE2 expression. **. P < 0.01 图 5 小鼠结肠ACE2和ACE表达变化 Fig. 5 Effects of DSS treatment on the expression of ACE2 and ACE in mouse colon |
结果如图 6所示，DSS处理后，ACE2和ACE的表达变化和PLVAP表达变化呈正相关，相关系数分别是0.830和0.896；Ang1-7、Ang Ⅱ含量变化与VEGFA含量变化呈正相关，相关系数分别为0.926和0.941。相关性大小ACE/PLVAP和Ang Ⅱ/VEGFA大于ACE2/PLVAP和Ang1-7/VEGFA。
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热图方格中数字大小反应两蛋白表达变化的相关性大小，数字越大，说明相关性越大，反之越小 The size of the number in the heat map box reflects the correlation between the expression of the two proteins. The larger the number, the greater the correlation, and vice versa 图 6 小鼠结肠组织中ACE2、ACE和PLVAP表达变化及Ang1-7、Ang Ⅱ和VEGFA表达变化的相关性热图 Fig. 6 The relationship between the expression of ACE2, ACE and PLVAP and the expression of Ang1-7, Ang Ⅱ and VEGFA in the colon of mice |
溃疡性结肠炎是一种慢性复发性肠道炎症疾病，通常引起患者血性腹泻、体重减轻，严重者诱发全身感染，并造成死亡[21-22]。有研究发现在肠系膜淋巴结和与之联系的脾中存在肠道病原体，但在门静脉和与之联系的肝中鲜少发现[3]。提示存在一种特定的血管机制防止病原进入血液。结合溃疡性结肠炎过程中血管被描述不规则、渗漏，表明肠血管损伤可能是一种重要的致病机制。VEGFA是一种血管通透因子[23]。有研究发现在溃疡性结肠炎发生发展中，上皮屏障损伤及其介导的病原入侵激活结肠上皮细胞、内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等，进而引起VEGFA大量释放并促进PLVAP的表达。PLVAP是一种血管通透性的调节器，然而其在具有屏障作用的内皮细胞中的大量表达被认为是病理性的[6]。VEGFA对血管通透性的上调可能是造成结肠炎血管损伤的机制。本试验结果显示，DSS处理造成了小鼠体重减轻、疾病活跃指数升高、结肠缩短以及结肠组织学损伤，表明建立的小鼠结肠炎模型成立。同时发现小鼠肛门出血，结肠PLVAP表达升高，血管性结肠炎致病因子VEGFA释放也升高，表明小鼠肠道血管通透性升高。
前期研究发现，溃疡性结肠炎患者结肠组织ACE、ACE2的基因表达无变化，但在炎性区域ACE2活性显著下降，并且Ang1-7和MasR的染色强度显著低于对照组，同时，该研究还显示结肠的纤维化程度与ACE/Ang Ⅱ/AT1R经典通路呈正相关，而与ACE2活性呈负相关[24]。另有研究发现，在实验性结肠炎中，结肠黏膜ACE/Ang Ⅱ/AT1R和ACE2/Ang1-7/MasR的表达均上调[25-27]。而外源性输注Ang Ⅱ能够加重结肠炎症过程中的组织学损伤，使用ACE抑制剂、阻碍Ang Ⅱ信号转导或敲除AT1R均能下调黏附分子的表达，抑制炎性细胞趋化和促炎因子释放[28-30]。尽管对于结肠炎中研究结果存在差异，但一些趋势仍表明ACE/Ang Ⅱ/AT1R和ACE2/Ang1-7/MasR在结肠炎中存在相互拮抗，后者具有一定的抵抗或保护作用[13]。本研究结果发现，DSS处理引起结肠ACE2和ACE表达均上调，Ang1-7和Ang Ⅱ含量升高，即在小鼠结肠炎时，小鼠结肠黏膜ACE/Ang Ⅱ/AT1R和ACE2/Ang1-7/MasR的表达均上调。
Ang Ⅱ诱导能促进PLVAP的表达，并且能够靶向VE-cadherin而引起血管通透性升高。同时，AT1R拮抗剂可以抑制VEGFA诱导的血管通透性升高。这提示Ang Ⅱ参与了血管屏障的调控。作者通过相关性分析发现，结肠炎小鼠结肠组织中ACE2、ACE、Ang1-7、Ang Ⅱ表达上调与PLVAP和VEGFA的表达升高存在相关性，并且与ACE2/Ang1-7表达上调相比，ACE/AngⅡ表达上调与PLVAP以及VEGFA升高相关性更密切，提示结肠炎时Ang Ⅱ可能与PLVAP协同参与了肠-血屏障损伤的发生发展。鉴于在多种疾病中ACE2/Ang1-7/MasR通过抵抗ACE/Ang Ⅱ/AT1R而发挥抗炎症、抗损伤等保护作用[31]，推测：结肠炎过程中ACE/Ang Ⅱ的激活导致Ang Ⅱ的过量产生，ACE2的表达上调可能是用于降解过度产生的Ang Ⅱ，以抵抗高水平的Ang Ⅱ。但结肠炎过程中ACE产生Ang Ⅱ的作用大于ACE2的降解能力，高水平的Ang Ⅱ加剧了肠-血屏障的损伤。结果提示：通过激活ACE2或增强对Ang Ⅱ的降解，可能是治疗或缓解溃疡性结肠炎的新的思路。
4 结论本研究通过4% DSS建立小鼠溃疡性结肠炎模型，小鼠结肠表现出血管屏障受损，局部RAS处于激活状态，ACE/Ang Ⅱ通路的激活占优势，Ang Ⅱ参与了结肠炎小鼠肠-血屏障的损伤过程。研究结果提示通过激活ACE2或过表达ACE2，增强其对Ang Ⅱ的降解作用以缓解肠-血屏障的损伤，可能是治疗或缓解溃疡性结肠炎的一个新的思路或途径。
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(编辑 白永平)