2. 江苏动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009;
3. 江苏省人兽共患病学重点实验室，扬州 225009;
4. 宿迁学院，宿迁 223800
, WANG Liyue1,2, CAI Weimin1,2, KANG Xilong2,3, FENG Qianqian1,2, ZHANG Zhizhi1,2, FAN Xuelian1,2, ZHU Yu1,2, LIU Dandan1,2, XU Jinjun1,2, PAN Zhiming2,3,4, TAO Jianping1,2
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China;
3. Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Yangzhou 225009, China;
4. Suqian University, Suqian 223800, China
鸡球虫病是危害集约化养鸡场的重大疾病之一，由一种或数种艾美耳球虫(Eimeria spp.)感染引起，其病原有7种，其中柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)是致病性最强的两种，分别引起鸡的急性盲肠球虫病和急性小肠球虫病[1]。目前，对鸡球虫病的防治主要依赖抗球虫药物，但长期使用药物产生了诸多问题，如因耐药虫株引起药效下降、药物残留导致的食品安全、污染环境等。因此，近年来鸡球虫病的防控方法逐渐从药物防治转向免疫预防。目前，临床上主要是用鸡球虫活虫苗来免疫预防鸡球虫病。活虫苗能产生较好的免疫保护力，但使用不当会引起球虫病发生[2]。而亚单位疫苗与活虫苗相比无此风险，因而更加安全[3]。迄今，已商品化的鸡球虫病亚单位疫苗仅有CoxAbicⓇ一种，该疫苗由3种巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)配子体蛋白抗原组成，能较为有效地抵抗巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫以及堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)的感染[4]。但由于生产该疫苗需要用巨型艾美耳球虫孢子化卵囊感染无球虫鸡，然后再从鸡肠道黏膜上皮细胞中分离纯化配子体，最后用亲和层析法从配子体中分离纯化配子体蛋白抗原，故生产费时费力、成本高，不能大批量生产来满足市场需求[5]。
ApiAP2蛋白作为调控顶复门原虫虫体发育的转录因子，其研究主要见于疟原虫(Plasmodium spp.)和弓形虫(Toxoplasma gondii)[6-7]，但其免疫功能尚未见有报道。本研究室前期已克隆、表达了毒害艾美耳球虫ApiAP2蛋白，重组蛋白rEnApiAP2能诱导小鼠产生高效价的多抗，并能被感染毒害艾美耳球虫后的鸡康复血清所识别，显示具有良好的免疫原性和反应原性[8]，但该重组蛋白对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫保护作用尚未报道。柔嫩艾美耳球虫重组配子体蛋白rEtGAM22、rEtGAM56和rEtGAM59对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果在本实验室已进行了研究[9]，但该重组蛋白与rEnApiAP2联合免疫的免疫保护作用尚未开展。为此，本文通过动物试验，首先评价重组蛋白rEnApiAP2对毒害艾美耳球虫的免疫保护效果和最佳免疫剂量，随后将rEnApiAP2与rEtGAM56或rEtGAM59联合免疫雏鸡，同时设置三种重组蛋白的单独免疫组，评价rEnApiAP2单免、及其与rEtGAM56或rEtGAM59联免对毒害艾美耳球虫或柔嫩艾美耳球虫的免疫保护效果，为鸡球虫多价亚单位疫苗的研发提供试验数据。
1 材料与方法 1.1 虫株、质粒和菌株柔嫩艾美耳球虫扬州株和毒害艾美耳球虫扬州株是由扬州大学兽医学院寄生虫学教研室建种保存并定期传代保种。试验之前卵囊经鸡体传代复壮。重组表达质粒pET28a(+)-EnApiAP2、pET28a(+)-EtGAM56和pET28a(+)-EtGAM59，均由本实验室构建并保存[10-11]。大肠杆菌BL21(DE3)菌株，由本实验室保存。
1.2 试验动物黄脚麻鸡(用于rEnApiAP2不同剂量免疫试验)，购自江苏立华牧业股份有限公司；如东草鸡(用于rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验)，购自中国农业科学院家禽研究所。刚出壳后立即运回实验室，饲养在经严格消毒、无球虫污染的笼具中，自由采食和饮水，全价饲料不添加任何抗球虫药物。本项研究中所有试验方案符合扬州大学动物伦理、福利等相关条例规定，符合江苏省科技厅动物福利保护条例，许可证编号：SCXK(苏)2021-0013。
1.3 免疫抗原的制备重组蛋白的制备：将3种蛋白的重组表达质粒(pET28a(+)-EnApiAP2、pET28a(+)-EtGAM56和pET28a(+)-EtGAM59)用热激法分别转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中并诱导表达[8, 10-11]。按照Ni-NTA亲和层析介质(购自金斯瑞公司)说明书方法纯化复性重组蛋白rEnApiAP2、rEtGAM56和rEtGAM59，A280紫外光吸收法测定重组蛋白浓度。
免疫抗原的制备：用无菌PBS稀释重组蛋白至各免疫组所需浓度(0.5、1和2 mg ·mL-1)，分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司)按照体积比1 ∶1混匀，超声乳化(滴于水面5 min内不扩散为标准)。
1.4 试验分组和免疫程序rEnApiAP2不同剂量免疫试验：共设5个组，每组10只鸡。各组的免疫剂量和程序见表 1。免疫两次，两次免疫抗原剂量相同。在21日龄时除未免疫未攻虫组外，其余各组每只鸡经嗉囊灌服感染1×104个毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。在29日龄时结束试验。免疫途径为胸部皮下注射。
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表 1 rEnApiAP2不同剂量免疫试验设计和免疫程序(n=10) Table 1 Experimental design and immune program of rEnApiAP2 at different dosages (n=10) |
rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验：共设13个组，每组10只鸡。各组的免疫剂量和程序见表 2。免疫两次，两次免疫抗原剂量相同。rEtGAM单免组免疫剂量为文献的最佳免疫剂量[10-11]，联免组的免疫剂量为50 μg rEnApiAP2与半个rEtGAM单免剂量之和。在21日龄时除未免疫未攻虫组外，每只鸡经嗉囊灌服感染2×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊或1×104个毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。免疫途径为胸部皮下注射。
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表 2 rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验设计和免疫程序 Table 2 Experimental design and immune program of rEnApiAP2 combination with rEtGAM |
每天观察鸡的精神状态、食欲、粪便、发病和死亡情况。攻虫后若出现血便，则每隔12 h计算每组的血便堆数。若鸡发生死亡，则对死亡鸡进行称重，并且剖检观察病变情况，以确定是否死于球虫病。
1.6 卵囊计数与肠道病变记分攻虫后第5天开始用饱和盐水漂浮法粪检卵囊，查见卵囊后每隔12 h收集每组鸡的全部粪便，用MacMaster法[12]计算粪便中的卵囊数，直至攻虫后第8天。试验结束时(攻虫后第8天)各试验组鸡逐只称重并进行剖杀剖检，取盲肠或小肠进行病变记分，并对盲肠中卵囊进行计数。最后计算各组鸡的卵囊排出总量。
1.7 免疫保护效果评价指标(1) 成活率(%)=(存活鸡数量÷试验鸡数量)×100%。
(2) 平均增重ΔW免疫阶段=W21 d-W7 d；ΔW攻虫阶段=W29 d-W21 d；相对增重率RWGR=ΔW试验组/ΔW未免疫未攻虫组×100%，其中RWGR1=ΔW免疫组免疫阶段/ΔW未免疫未攻虫组×100%，RWGR2=ΔW免疫组攻虫阶段/ΔW未免疫未攻虫组×100%。
(3) 卵囊值与卵囊减少率：各试验组雏鸡攻虫后镜检检测粪便中卵囊的排出情况，发现未免疫攻虫组开始排出卵囊后，每24 h收集1次粪便样本，用MacMaster法对粪便中的卵囊进行计数，直至攻虫后第8天。卵囊值参照索勋[1]的方法计算，当免疫组排出的总卵囊量与未免疫攻虫组之比为0~1%时，卵囊值记为0；1%~25%时，卵囊值记为5；26%~50%时，卵囊值记为10；51%~75%时，卵囊值记为20；76%~100%时，卵囊值记为40。卵囊减少率=[(未免疫攻虫组卵囊数-免疫攻虫组卵囊数)/未免疫攻虫组卵囊数]×100%。
(4) 柔嫩艾美耳球虫的病变记分标准[13]：无肉眼可见病变，记0分；盲肠壁有极少量散在点状出血斑，肠壁不增厚，内容物正常，记1分；病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，记2分；盲肠内出血量多或有盲肠核(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，盲肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少，记3分；盲肠内充满大量血液或肠芯并肿大，肠芯中含有粪渣，记4分；鸡死于球虫病记4分。
(5) 毒害艾美耳球虫病变记分标准[13]：无肉眼可见病变，记0分；小肠中部有散在针点状出血点或白色斑点，黏膜损伤不明显，记1分；小肠中段有多量的出血点，可见中部肠管稍充气，记2分；小肠腔有大量出血，浆膜面见有红色或白色斑点，黏膜面粗糙增厚，肠内容物减少，肠壁增厚但长度明显缩小，记3分；小肠因严重出血呈暗红色、褐色，大部分肠管气胀明显，黏膜增厚加剧，肠腔内充满血液和黏膜组织碎片，浆膜面有白色或红色病灶，记4分；鸡死于球虫病记4分。
(6) 抗球虫指数(ACI)：按文献[14]方法计算，即：ACI=(存活率+RWGR2)-(病变值+卵囊值)，其中病变值为每组的平均病变记分×10。ACI值在120~160之间为抗球虫低效，在160~180为中效，大于180为高效。
1.8 体液免疫水平检测分别在14日龄和21日龄，每组随机选取5只鸡翅下采血1 mL并分离血清，参照文献[11]进行间接ELISA方法检测抗体水平。
1.8.1 rEnApiAP2不同剂量免疫试验 纯化复性的重组蛋白rEnApiAP2用碳酸盐缓冲液稀释，包被于96孔板中，每孔1 μg/100 μL，4 ℃过夜。包被后按“1.8.3”进行检测。
1.8.2 rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验 纯化复性后的重组蛋白rEnApiAP2、rEtGAM56和rEtGAM59按质量比1 ∶1 ∶1混合后用碳酸盐缓冲液稀释，包被于96孔板中，每孔1 μg/100 μL，4 ℃过夜。包被后按“1.8.3”进行检测。
1.8.3 抗体检测 PBST洗涤3次，每孔用200 μL 10 g ·L-1的BSA溶液37 ℃封闭1 h；PBST洗涤3次，每孔加100 μL按1 ∶200倍稀释待检血清，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次，每孔加100 μL按1 ∶10 000倍稀释的HRP标记的山羊抗鸡IgG，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次，每孔加100 μL的TMB底物显色液，37 ℃孵育10 min；显色后立即加入50 μL 2 mol ·L-1 H2SO4溶液终止反应，酶标仪测定OD450 nm值。每个样品设3个重复。
1.9 数据统计分析用IBM SPSS Statistics 23软件对试验数据进行一维方差描述性统计分析，并用邓肯(Duncan)氏新复极差法[15]对组间平均值进行多重比较(P < 0.05)。
2 结果 2.1 重组蛋白的诱导表达和鉴定将重组表达质粒pET28a(+)-EnApiAP2、pET28a(+)-EtGAM56和pET28a(+)-EtGAM59分别转化BL21(DE3)进行表达，纯化后经SDS-PAGE分析，重组蛋白大小分别约为74、56、61.2 ku，与预期相符(见图 1A、B)。Western blot检测结果显示，三种重组蛋白均能被6×His标签单克隆抗体识别(见图 1C~E)。
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M.蛋白质分子质量标准；1~3. 纯化复性的rEnApiAP2、rEnGAM59和rEnGAM56; 4~6.Western blot鉴定rEnApiAP2、rEnGAM56和rEnGAM59 M. Protein marker; 1-3.The purification and renaturation of rEnApiAP2, rEnGAM59, and rEnGAM56; 4-6. Western blot analysis of rEnApiAP2, rEnGAM56, and rEnGAM59 图 1 重组蛋白的SDS-PAGE分析(A、B)和Western blot鉴定(C~E) Fig. 1 The SDS-PAGE (A, B) and Western blot (C-E) analysis of rEnApiAP2, rEnGAM56 and rEnGAM59 |
rEnApiAP2不同剂量免疫试验：攻虫后第132小时观察，除未免疫未攻虫组外，其余各组鸡均排出血便，并出现食欲减退、饮水减少、缩头呆立等症状。攻虫后第168小时，鸡群精神状态和食欲逐渐恢复，血便数下降，直至攻虫后192 h，各组鸡群已无血便排出。与未免疫攻虫组相比，各免疫组鸡的症状均较轻。各组排出的血便总数分别为：重组蛋白高剂量组39堆，重组蛋白中剂量组26堆，重组蛋白低剂量组18堆，未免疫攻虫组48堆。未免疫未攻虫组无血便出现。各试验组鸡均未发生死亡，成活率均为100%。
rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验：各试验组均无病死的鸡，成活率均为100%，未免疫未攻虫组无血便出现；用柔嫩艾美耳球虫攻虫后第96小时左右，各组鸡陆续排出血便，并出现食欲减退、饮水减少、缩头呆立等症状。攻虫后第180小时各组鸡的精神状态和食欲逐渐恢复，血便数下降，与未免疫攻虫组相比各免疫组症状均轻。各组排出的血便总数分别为：rEnApiAP2组99堆，rEtGAM56组92堆，rEtGAM59组59堆，rEnApiAP2+rEtGAM 56组89堆，rEnApiAP2+rEtGAM59组72堆，未免疫攻虫组117堆。用毒害艾美耳球虫攻虫后第132小时左右，各组鸡陆续排出血便，并出现食欲减退、饮水减少、缩头呆立等症状。攻虫后第180小时鸡群精神状态和食欲逐渐恢复，血便数下降。与未免疫攻虫组相比，各免疫组鸡的症状均轻。各组排出的血便总数分别为：rEnApiAP2组21堆，rEtGAM56组32堆，rEtGAM59组18堆，rEnApiAP2+ rEtGAM56组27堆，rEnApiAP2+rEtGAM59组19堆，未免疫攻虫组55堆。
2.3 平均增重、相对增重率与病变记分rEnApiAP2不同剂量免疫试验(见表 3)：在免疫阶段，各试验组鸡的平均增重无显著差异(P>0.05)。攻虫阶段，各免疫组鸡的平均增重差异不显著(P>0.05)，但均显著高于未免疫攻虫组(P < 0.05)，其中重组蛋白高剂量组和中剂量组均显著低于未免疫未攻虫组(P < 0.05)。重组蛋白低剂量组相对增重率最高(82.36%)，且平均肠道病变记分最低，显著低于未免疫攻虫组(P < 0.05)。在免疫组中，重组蛋白高剂量组的平均肠道病变记分最高。
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表 3 rEnApiAP2不同剂量免疫试验中各组的增重、相对增重率和肠道病变记分 Table 3 Weight gain, relative weight growth and lesion score of each group immunized with different dosages of rEnApiAP2 |
rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验(见表 4)：在免疫阶段，各试验组鸡的平均增重无显著差异(P>0.05)。攻虫阶段，柔嫩艾美耳球虫攻虫组中，rEtGAM59组和rEnApiAP2+rEtGAM59组的平均增重均显著高于未免疫攻虫组(P < 0.05)，各免疫组与未免疫攻虫组的平均增重均显著低于未免疫未攻虫组(P < 0.05)；毒害艾美耳球虫攻虫组中，各免疫组间鸡的平均增重差异不显著(P>0.05)，但各免疫组鸡的平均增重显著高于未免疫攻虫组(P < 0.05)，显著低于未免疫未攻虫组(P < 0.05)。在柔嫩艾美耳球虫攻虫组间比较，rEtGAM59组相对增重率最高(84.88%)。免疫组的平均肠道病变记分均小于未免疫攻虫组，其中rEnApiAP2+rEtGAM59组的平均肠道病变记分最低，显著低于未免疫攻虫组(P < 0.05)；在毒害艾美耳球虫攻虫组间比较，rEtGAM59组相对增重率最高(91.26%)。免疫组的平均肠道病变记分均小于未免疫攻虫组，其中rEtGAM56组和rEnApiAP2+rEtGAM56组的平均肠道病变记分最低，显著低于未免疫攻虫组(P < 0.05)。
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表 4 rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验中各组的增重、相对增重率和肠道病变记分 Table 4 Weight gain, relative weight growth and lesion score of each group immunized with rEnApiAP2 combination with rEtGAM |
rEnApiAP2不同剂量免疫试验(见表 5)：未免疫攻虫组，每只鸡排出卵囊量为2.68×107个。各免疫组的卵囊产量均低于未免疫攻虫组，其中重组蛋白低剂量组的卵囊减少率最高(73.88%)，其次为重组蛋白高剂量组(35.45%)，重组蛋白中剂量组最低(21.27%)。
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表 5 rEnApiAP2不同剂量免疫试验中各组的卵囊产量与卵囊减少率 Table 5 The oocyst output and reduction rates of each group with different dosages of rEnApiAP2 |
rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验(见表 6)：各免疫组的卵囊产量均低于未免疫攻虫组；在柔嫩艾美耳球虫攻虫组间比较，rEtGAM59组卵囊减少率最高(51.23%)，rEnApiAP2+rEtGAM59组稍次(29.64%)，rEnApiAP2+rEtGAM56组最低(20.49%)。在毒害艾美耳球虫攻虫组间比较，rEtGAM56组卵囊减少率最高(64.38%)，rEnApiAP2+ rEtGAM56组稍次(51.13%)，rEtGAM59组最低(13.09%)。
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表 6 rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验中各组的卵囊产量与卵囊减少率 Table 6 The oocyst output and reduction rates of each group immunized with rEnApiAP2 combination with rEtGAM |
rEnApiAP2不同剂量免疫试验(见表 7)：重组蛋白低剂量组的ACI值最高(155.26)，接近抗球虫中效水平，其次为重组蛋白高剂量组(133.73)，属抗球虫低效水平。重组蛋白中剂量组的ACI值为117.30属抗球虫无效水平。未免疫攻虫组的ACI值为101.77。
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表 7 rEnApiAP2不同剂量免疫试验中各组的抗球虫指数 Table 7 The anti-coccidial index of each group immunized with different dosages of rEnApiAP2 |
rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验(见表 8)：在柔嫩艾美耳球虫攻虫组间比较，rEtGAM59组的鸡抗球虫指数最高(151.88)，接近抗球虫中效水平；其次为rEnApiAP2+rEtGAM59组，ACI值为141.62，属抗球虫低效水平；rEnApiAP2+ rEtGAM56组最低，为115.46，其余组ACI值接近130；在毒害艾美耳球虫攻虫组间比较，rEnApiAP2+ rEtGAM56组的抗球虫指数最高(169.83)，属于抗球虫中效水平，其次为rEtGAM56组，ACI值为165.48；余下免疫组的ACI值均接近155，rEtGAM59组的ACI值最低，为139.26。
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表 8 rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验中各组的抗球虫指数 Table 8 The anti-coccidial index of each group immunized with rEnApiAP2 combination with rEtGAM |
rEnApiAP2不同剂量免疫试验(见图 2)：用间接ELISA法检测14日龄与21日龄各试验组鸡的血清特异性抗体水平。在14日龄(图 2A)，各免疫组鸡的血清特异性抗体水平均显著高于未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组(P＜0.05)，高剂量和中剂量免疫组的抗体水平又显著高于低剂量免疫组(P＜0.05)。在21日龄(图 2B)，各免疫组鸡的血清特异性抗体水平明显升高；同样，各免疫组鸡的血清特异性抗体水平均显著高于未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组(P＜0.05)，但高剂量免疫组的抗体水平显著高于中剂量免疫组、中剂量免疫组又显著高于低剂量免疫组(P＜0.05)。
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A. 14日龄血清特异性抗体水平；B. 21日龄血清特异性抗体水平。***表示差异极其显著(P＜0.001) A. Serum specific antibody level of 14-day-old; B. Serum specific antibody level of 21-day-old. *** indicates exceedingly significant difference (P < 0.001) 图 2 rEnApiAP2不同剂量免疫试验各组鸡血清特异性抗体水平 Fig. 2 Antibody level of each group immunized with different dosages of rEnApiAP2 |
rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验(见图 3)：用间接ELISA法检测14日龄、21日龄各组鸡的血清特异性抗体水平。在14日龄(图 3A)，各免疫组鸡的血清特异性抗体水平均显著高于未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组(P＜0.05)；rEtGAM56组特异性抗体水平又显著高于其他免疫组，rEnApiAP2组的特异性抗体水平显著低于其余免疫组(P＜0.05)。余下免疫组的特异性抗体水平相接近。在21日龄(图 3B)，各免疫组鸡的血清特异性抗体水平明显升高；同样，各免疫组鸡的血清特异性抗体水平均显著高于未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组(P＜0.05)；在各免疫组，rEtGAM56组显著高于其余免疫组，rEnApiAP2组显著低于其余免疫组(P＜0.05)。余下免疫组的特异性抗体水平相接近。
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A. 14日龄血清特异性抗体水平；B. 21日龄血清特异性抗体水平。*表示差异显著(P＜0.05)；***表示差异极其显著(P＜0.001) A. Serum specific antibody level of 14-day-old; B. Serum specific antibody level of 21-day-old. * indicates significant difference (P < 0.05); *** indicates exceedingly significant difference (P < 0.001) 图 3 rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫试验中各组鸡血清特异性抗体水平 Fig. 3 Antibody level of each group immunized with rEnApiAP2 combination with rEtGAM |
近年来随着生物信息学的快速发展以及7种艾美耳球虫基因组测序工作的完成，大大加快了亚单位疫苗的研发进程。目前已从7种鸡艾美耳球虫的不同发育阶段分离与克隆了数十种保护性抗原，并对其中的部分重组抗原(如AMA-1、cSZ-JN1、cSZ-JN2、EF-1α、Em6、Em8、EMHP-1、EMHP-2、EmCKRS、EmJS-1、Em14-3-3、EMRP、EmSAG、EtMIC1、EtMIC2、Gam82、GAPDH、IMPI、LDH、MICs、MIF、NA-4、NPmz19、rEtSO7和TA4等)的免疫保护力进行了观察[16]。这些抗原免疫鸡群可以获得部分的免疫保护作用，但距临床实际要求还有较大的差距，其原因可能是单一抗原免疫产生的免疫保护力弱，因此用两种或以上抗原联合免疫可能会产生更有效的免疫保护作用[17]。
球虫配子体蛋白是卵囊壁的前体蛋白，参与卵囊壁的形成[18]。柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白基因有Etgam22、Etgam56和Etgam59三种。朱玉兰[11]克隆、原核表达了Etgam59基因，对重组蛋白进行了雏鸡免疫保护试验，发现100 μg剂量的免疫效果最好，相对增重率55.89%~56.92%，卵囊减少率46.74%~58.98%。刘悦[10]克隆、原核表达了Etgam56基因，对重组蛋白的雏鸡免疫保护试验发现200 μg剂量的免疫效果最好，相对增重率62.99%，卵囊减少率50.37%。王礼跃等[9]观察了rEtGAM22、rEtGAM56和rEtGAM59分别单独免疫或联合免疫对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护力，结果显示单独免疫时rEtGAM22免疫保护力均低于rEtGAM56和rEtGAM59，故在本研究中没选用rEtGAM22，且重组蛋白rEtGAM59和rEtGAM56的单免剂量分别设置为100和200 μg，联合免疫剂量减半，分别为50和100 μg。
因重组蛋白rEnApiAP2的免疫保护力尚不明确，为此本研究首先通过动物试验比较了rEnApiAP2不同剂量免疫雏鸡对毒害艾美耳球虫的保护力，结果显示低剂量组(50 μg/鸡)病变记分最低、平均增重和卵囊减少率最高，其ACI值(155.26)接近抗球虫中效水平。随后选择50 μg为rEnApiAP2的免疫剂量，分别与rEtGAM56或rEtGAM59联合免疫雏鸡，同时设置3种重组蛋白的单免组，分别比较联合免疫与单免对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力。结果显示rEnApiAP2与rEtGAM联免对毒害艾美耳球虫的保护效力要好于单免，其中rEnApiAP2与rEtGAM56联免组的ACI值最高，达169.83；在对柔嫩艾美耳球虫的保护效力中，联免组的保护力反而低于相应的rEtGAM56或rEtGAM59单免组，同样，王礼跃等[9]观察到rEtGAM56与rEtGAM59联免组的抗柔嫩艾美耳球虫ACI值(148.85)反而低于rEtGAM59单免组(159.47)，rEtGAM22与rEtGAM56联免组的抗毒害艾美耳球虫ACI值(127.19)也低于rEtGAM56单免组(155.70)。因此，其可能原因是免疫剂量减半所致，这有待进一步探析。两次试验中50 μg rEnApiAP2组的抗毒害艾美耳球虫ACI值相近，显示该重组蛋白对毒害艾美耳球虫有较强的免疫保护力。
在遗传学上柔嫩艾美耳球虫与毒害艾美耳球虫亲缘关系最近，两者的gam56和gam59基因相似性分别达87.9%和93.4%，Western blot检测结果显示重组蛋白rEtGAM56和rEtGAM59可被毒害艾美耳球虫感染的鸡康复血清特异性识别，具有良好的交叉反应原性[10-11]。同样，两者的ApiAP2基因相似性为90.4%，重组蛋白rEnApiAP2可被柔嫩艾美耳球虫感染的鸡康复血清特异性识别[8]。因此，rEtGAM和rEnApiAP2均有一定的鸡球虫种间的交叉免疫保护力，但rEnApiAP2对毒害艾美耳球虫的免疫保护力明显大于对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力。rEtGAM56和rEtGAM59对毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力正好相反，前者对毒害艾美耳球虫的免疫保护力要大，后者对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力要大，这与王礼跃等[9]的报道相一致。
鸡球虫病亚单位疫苗CoxAbicⓇ由巨型艾美耳球虫的天然配子体抗原GAM230、GAM82和GAM56组成，其中GAM82与GAM56与卵囊壁形成有关[4]。母鸡免疫该疫苗后可产生大量母源抗体，并通过卵黄传递给子代。子代体内的高水平抗体可以抑制巨型艾美耳球虫发育，并将卵囊产量减少60%~80%，从而阻断球虫病的传播[19]。本文用间接ELISA法分别检测各试验组鸡二免前和攻虫前血清特异性抗体水平，均检查到血清特异性抗体水平显著升高。用不同剂量rEnApiAP2免疫雏鸡，鸡血清特异性抗体水平随免疫剂量增加而升高，但血清抗体水平与ACI值不一致，这一现象与Jang等[20]的报道相似，后者分别用60 μg和30 μg重组蛋白rEnGAM82免疫鸡群，发现30 μg免疫组的保护效果更好。因此，rEnApiAP2蛋白的免疫保护性机制有待进一步研究。重组蛋白联合免疫2次后，免疫组鸡血清特异性抗体水平升高约1倍，免疫rEnApiAP2组的血清特异性抗体水平显著低于rEtGAM56组和rEtGAM59组，其ACI值(128.37、156.29)低于rEtGAM56组(130.12、165.48)、高于或低于rEtGAM59组(151.88、139.26)。由此可见，鸡血清特异性抗体水平与ACI值无相关性。
4 结论重组蛋白rEnApiAP2以50 μg免疫剂量的保护效果最好，抗毒害艾美耳球虫效果接近中效水平；rEnApiAP2与rEtGAM联合免疫可提高抗毒害艾美耳球虫的免疫保护效力，其中rEnApiAP2与rEtGAM56联免抗毒害艾美耳球虫效果达抗球虫中效水平。本研究为鸡球虫病重组亚单位疫苗的研发提供了实验依据。
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(编辑 白永平)