2. 吉林大学动物科学学院，长春 130000;
3. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193
, LIU Shuang1, HE Lixia1, FENG Xue1, YANG Mengli1, WANG Shuzhe1, LIU Yuan1, FENG Lan1, DING Xiaoling1, JI Guoshang1, YANG Runjun2, ZHANG Lupei3, MA Yun1
2. College of Animal Science, Jilin University, Changchun 130000, China;
3. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
牛肉营养丰富，是肉类消费的一个重要组成部分。风味作为牛肉品质关键特性，决定肉品的价值和消费者的购买意愿，肉品中代谢物类别以及含量是评估肉类风味和整体适口性的重要指标[1-2]。基于核磁共振(NMR)和质谱(MS)的代谢组学技术可以解析生物样本间代谢物的差异和筛选潜在的相关生物标志物[3]。代谢组学技术具有操作简单、通量高等特点，已成为了解肉品化学组成及动态变化的主要方法之一，常用于肉品品质研究和分子育种研究[4-7]。
固原黄牛是分布于宁夏回族自治区六盘山周边地区特有的地方黄牛类群，主要含有本地黄牛、秦川牛和蒙古牛血液[8]。固原黄牛肉具有蛋白质含量高、谷氨酸含量丰富、胆固醇含量低、肉质细嫩多汁等特点，分别于2016年和2019年入选国家地理标志保护产品和中国农业品牌目录，但目前对固原黄牛肉品质研究未见报道[9]。其他肉牛品种不同部位肉品质已有不少研究和报道，牛蕾等[10]对中国西门塔尔公牛的研究发现不同肌肉部位品质存在较大差异。保善科等[11]在对高原牦牛肉品质研究中发现部位因素对肉品质有显著影响。基于此，为了研究固原黄牛不同部位肌肉组织的肉品质差异和风味形成相关的关键代谢物，本研究利用非靶向代谢组学技术对6头24月龄雄性固原黄牛眼肉、臀肉和肩肉3个部位的肌肉组织进行代谢物分析，筛选与牛肉品质和风味形成相关的关键代谢物，以期为固原黄牛肉品质性状进一步研究及分子育种提供一些参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物和样品采集本试验选用的黄牛为固原富民农业科技发展有限公司同一生长条件下的固原黄牛群体。随机挑选6头24月龄及体重相近的健康雄性固原黄牛，根据屠宰场肉牛屠宰标准操作流程进行屠宰，肉牛按1~6进行编号，对眼肉(背最长肌)、臀肉(臀二头肌)、肩肉(冈上、冈下肌)的3个部位进行平均多点取样，将采集的样品置于2 mL冻存管中。眼肉标记为YR，即6头牛分别对应YR1、YR2、YR3、YR4、YR5、YR6；臀肉标记为TR，即6头牛分别对应TR1、TR2、TR3、TR4、TR5、TR6；肩肉标记为JR，即6头牛分别对应JR1、JR2、JR3、JR4、JR5、JR6。将取好的样品立即置于液氮中进行速冻，再统一转移至-80 ℃超低温冰箱中保存，后续干冰运输至北京诺禾致源科技股份有限公司进行代谢物提取和检测分析。
1.2 代谢物提取取冷冻状态下的牛肉组织样本切成小薄片状，再用小剪刀剪碎，置于盛有少量液氮的研钵中，用研杵对组织样本进行碾压研磨，并及时补充液氮让样品始终保持冷冻状态，直至组织被研磨成粉末状。精确称量100 mg(±2%)研磨好的组织样品于1.5 mL离心管中，加入1 mL保存于-20 ℃条件下的组织提取液(900 mL·L-1甲醇氯仿、水体积比为3 ∶1)，涡旋混匀30 s，冰上超声30 min后静置30 min；4 ℃，15 000 g离心20 min，移取850 μL上清液至1.5 mL样品管中，进行冷冻干燥后加入200 μL 530 mL·L-1甲醇溶液进行复溶，复溶后的提取物溶液经0.22 μm膜过滤后置于检测瓶中。取等体积试验样本进行混合得到QC(质控)样本，Blank(空白)样品为530 mL·L-1甲醇溶液。
1.3 色谱和质谱条件1.3.1 色谱条件 赛默飞Vanquish UHPLC色谱仪；赛默飞Hypesil Gold Column色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；正模式流动相A为1 mL·L-1甲酸，流动相B为甲醇；负模式流动相A为5 mmol·L-1醋酸铵(pH 9.0)，流动相B为甲醇；进样量6 μL，柱温40 ℃，流速0.2 mL·min-1。
1.3.2 质谱条件 赛默飞Q ExactiveTM HF质谱仪，扫描范围选择m/z 100~1 500；喷雾电压(spray voltage)：3.5 kV；鞘气流速(sheath gas flow rate)：35 psi；辅助气流速(aux gas flow rate)：10 L·min-1；离子传输管温度(capillary temp)：320 ℃；离子导入射频电平(s-lens rf level)：60；辅助气加热器温度(aux gas heater temp)：350 ℃；正离子与负离子模式下采集质谱信号；MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描(data-dependent scans)。
1.4 数据预处理和代谢物鉴定将下机数据(.raw)文件导入Compound Discover 3.1软件中进行处理，首先对每个代谢物进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后设置保留时间偏差0.2 min和质量偏差5 ppm的指标对不同样品进行峰对齐，使鉴定更准确。随后设置质量偏差5 ppm、信号强度偏差30%、信噪比3、最小信号强度、加合离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud、mzVault和Masslist数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，同时根据样本代谢物定量值总和与QC样本代谢物定量值总和对样品测定值进行标准化处理，得到相对峰面积，并将QC样本中相对峰面积的CV大于30%的化合物剔除，得到代谢物相对定量结果，最后使用KEGG数据库和LIPID MAPS数据库对鉴定到的代谢物进行注释。
1.5 差异代谢物筛选使用数据处理软件metaX对数据转换后进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)[12-13]，进而获得每个代谢物的VIP值。单变量分析部分，基于t检验计算各代谢物在两组间的统计学显著性(P值)，并计算代谢物在两组间的差异倍数FC(fold change)值。差异代谢物筛选的标准为VIP>1，P < 0.05且FC>1.5或FC < 0.667。
1.6 差异代谢物KEGG富集分析和调控网络分析为了进一步了解差异代谢物在机体内的生物学功能，使用BioDeep云平台(https://www.biodeep.cn/)对筛选到的差异代谢物进行KEGG富集分析，并以P < 0.05作为条件判断KEGG通路富集的显著性，确定差异代谢物参与的主要生化代谢途径和信号转导途径。基于筛选得到的差异代谢物，利用FELLA(R包)[14]进行通路、功能模块、关键酶及代谢物网络分析。
1.7 肩肉、眼肉和臀肉代谢物WGCNA分析利用WGCNA R包对肩肉、眼肉和臀肉3个组的代谢物进行共表达网络分析，将肩肉、眼肉和臀肉的表型性状作为加权，代谢物依据表达水平不同聚类为不同颜色的模块。将各不同颜色模块与表型性状进行关联分析，筛选与牛肉品质显著相关的模块。
2 结果 2.1 固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉代谢物鉴定基于代谢物的相对定量值计算QC样本之间的Pearson相关系数，QC样本R2均大于0.99，说明整个试验过程中仪器误差引起的变异较小(图 1A)。将QC样本提取得到的峰进行PCA分析(图 1B)，QC样本聚集在一起，再次表明固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉代谢物鉴定数据质量较高。
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A.QC样本相关性分析；B.总样本PCA分析；C.代谢物分类饼状图；D.LIPID MAPS分类注释 A.Correlation analysis of QC samples; B.PCA analysis of total samples; C.Pie chart of metabolite classification; D.Classification annotation using LIPID MAPS 图 1 固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉代谢物鉴定 Fig. 1 Identification of metabolites of eye meat, shoulder meat and hip meat of Guyuan cattle |
将所有试验样本提取到的峰进行PCA分析(图 1B)：PCA分析显示肩肉、眼肉和臀肉3组样品间有分离，表明PCA分析对两组样品间有区分效果，肩肉、眼肉和臀肉3组样品的代谢物组成类别和含量上存在差异。第一主成分(PC1)占总变量的25.05%，第二主成分(PC2)占总变量的13.32%，二者累计贡献率可达38.37%。
对眼肉、肩肉和臀肉的代谢物进行分析，共鉴定到代谢物689个，包括脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、核苷、核苷酸和类似物、有机杂环化合物、含氧有机化合物、苯环型化合物、有机氮化合物、苯丙类和聚酮类、生物碱及其衍生物(图 1C)，其中脂质和类脂分子占比最高为32.08%(221个代谢物)。进一步使用LIPID MAPS脂质数据库对脂质和类脂分子分类(图 1D)，主要类别为脂肪酸类(fatty acids，FA)、甘油脂类(glycerolipids，GL)、甘油磷脂类(glycerophospholipids，GP)、聚酮化合物(polyketides，PK)和固醇脂类(sterol lipids，ST)，其中脂肪酸类占比最高为50%(49个代谢物)。
2.2 固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉差异代谢物筛选对不同肌肉组织的差异代谢物进行筛选，首先用偏最小二乘法判别分析方法(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)进行代谢物轮廓分析。结果显示(图 2)，眼肉、肩肉和臀肉各样品组间代谢物明显分开，表明固原黄牛不同部位肌肉组织间代谢物存在差异；眼肉组与肩肉组(YR vs. JR)：R2Y=0.99，Q2Y=0.53，R2Y>Q2Y，Q2与Y轴截距小于0；眼肉组与臀肉组(YR vs. TR)：R2Y=0.98，Q2Y=0.48，R2Y>Q2Y，Q2与Y轴截距小于0；肩肉组与臀肉组(JR vs. TR)：R2Y=0.99，Q2Y=0.50，R2Y>Q2Y，Q2与Y轴截距小于0。以上信息表明模型质量高、差异代谢物筛选可靠性强。
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A.眼肉组和肩肉组的PLS-DA模型得分散点图；B.眼肉组和臀肉组的PLS-DA模型得分散点图；C.肩肉组和臀肉组的PLS-DA模型得分散点图；D.眼肉组和肩肉组的PLS-DA模型排序验证图；E.眼肉组和臀肉组的PLS-DA模型排序验证图；F.肩肉组和臀肉组的PLS-DA模型排序验证图 A.PLS-DA score scatter plot of eye meat vs. shoulder meat; B.PLS-DA score scatter plot of eye meat vs. hip meat; C.PLS-DA score scatter plot of shoulder meat vs. hip meat; D.PLS-DA sorting verification chart of eye meat vs. shoulder meat; E.PLS-DA sorting verification chart of eye meat vs. hip meat; F. PLS-DA sorting verification chart of shoulder meat vs. hip meat 图 2 固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉代谢物的偏最小二乘法判别分析 Fig. 2 Partial least squares discriminant analysis of metabolites in eye meat, shoulder meat and hip meat of Guyuan cattle |
设置VIP>1.0，FC>1.5或FC < 0.667且P-value < 0.05，对固原黄牛不同部位肌肉组织间差异代谢物进行筛选。眼肉组与肩肉组相比，113个差异代谢物显著上调和33个差异代谢物显著下调(P＜0.05)；眼肉组与臀肉组相比，131个差异代谢物显著上调和31个差异代谢物显著下调(P＜0.05)；肩肉与臀肉相比，44个差异代谢物显著上调和28个差异代谢物显著下调(P＜0.05)。对3个样品组的代谢物进行聚类分析，从聚类热图可以看出(图 3A)，肩肉组和臀肉组样本聚为一类，眼肉组样本为一类，这说明不同组间样本具有明显的表达差异。眼肉与肩肉、臀肉相比较，筛选得到73种显著差异代谢物(图 3B)，其中(R)-3-羟基肉豆蔻酸、油酸、前列腺素E2、(9Z)-12, 13-二羟基-9-十八烷基酸、12-氧植物二烯酸、15-OxoEDE、10-Nitrolinoleate、5-OxoETE、9-Oxo-ODE和13(S)-HOTrE共10种脂肪酸类代谢物在眼肉中显著高表达(P＜0.05)；ACar 22 ∶3(脂肪酸类代谢物)在眼肉中显著低表达(P＜0.05)；N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸(N6, N6, N6-trimethyl-L-lysine，有机酸及其衍生物)和麦芽三糖(maltotriose，含氧有机化合物)是眼肉、肩肉和臀肉之间共同的差异代谢物，二者表达量均在眼肉最高、肩肉次之、臀肉最低(P＜0.05)(图 3C)。
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A.眼肉、肩肉和臀肉差异代谢物的聚类热图；B.眼肉、肩肉和臀肉差异代谢物的韦恩图；C.眼肉、肩肉和臀肉差异代谢物的箱线图 A.Clustering heat map of significantly differential metabolites in eye meat, shoulder meat and hip meat; B.Venn diagram of significantly differential metabolites in eye meat, shoulder meat and hip meat; C.Boxplot of significantly differential metabolites in eye meat, shoulder meat and hip meat 图 3 固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉差异代谢物筛选 Fig. 3 Screening of significantly differential metabolites in eye meat, shoulder meat and hip meat of Guyuan cattle |
眼肉与肩肉的组间差异代谢物主要富集在脂肪细胞的脂肪分解调节(regulation of lipolysis in adipocytes)、嘌呤代谢(purine metabolism)和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine, aspartate and glutamate metabolism)等通路(P＜0.05)；眼肉与臀肉的组间差异代谢物主要富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine, aspartate and glutamate metabolism)等通路(P＜0.05)；肩肉与臀肉的组间差异代谢物主要富集在氮代谢(nitrogen metabolism)等通路(P＜0.05)。其中有17条代谢通路是眼肉与肩肉(YR vs. JR)、眼肉与臀肉(YR vs. TR)和肩肉与臀肉(JR vs. TR)差异代谢物共同富集的主要通路，即嘌呤代谢，嘧啶代谢，脂肪细胞中脂肪分解调节，花生四烯酸代谢，醛固酮合成和分泌，味觉传导，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，炎症介质对TRP通道的调节，催产素信号通路，丙酸酯代谢，丁酸酯代谢，乙醛酸及二羧酸代谢，不饱和脂肪酸生物合成，糖的消化和吸收，氮代谢，长寿调节途径和氧化磷酸化(图 4)。固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉的差异代谢物共同富集通路和差异代谢物见表 1。
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A.眼肉与肩肉差异代谢物富集通路；B.眼肉与臀肉差异代谢物富集通路；C.肩肉与臀肉差异代谢物富集通路 A.Significantly differential metabolites enrichment pathways between eye meat and shoulder meat; B.Significantly differential metabolites enrichment pathways between eye meat and hip meat; C.Significantly differential metabolites enrichment pathways between shoulder meat and hip meat 图 4 固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉差异代谢物共同富集通路 Fig. 4 Common enrichment pathways of significantly differential metabolites in eye meat, shoulder meat and hip meat of Guyuan cattle |
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表 1 固原黄牛眼肉与肩肉、眼肉与臀肉和肩肉与臀肉差异代谢物富集通路 Table 1 Significantly differential metabolites enrichment pathways between eye meat and shoulder meat, eye meat and hip meat, shoulder meat and hip meat of Guyuan cattle |
使用FELLA(R包)进行调控网络分析，了解密切相关途径、代谢模块以及潜在的关键酶和代谢物，以便更好地理解整体的代谢反应(图 5)。重点关注固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉的差异代谢物以及代谢物在不饱和脂肪酸生物合成通路中所起的作用。结果显示，乙酰辅酶A(CoA)、油酰辅酶A(oleoyl-CoA)、油酰(oleoyl)、二十二碳五烯酸辅酶A(docosapentaenoyl-CoA)和二十二六烯酸辅酶A(docosahexaenoyl-CoA)这5种代谢物在不饱和脂肪酸生物合成中扮演关键角色。除了不饱和脂肪酸生物合成通路，上述代谢物还参与了脂肪酸延伸、脂肪酸降解、花生四烯酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代谢、PPAR信号通路和PI3K-Akt信号通路等多个代谢通路。此外，涉及不饱和脂肪酸生物合成的17种酶也对这一过程进行了调控。这些结果有助于更全面地了解固原黄牛不同部位肌肉的代谢特征，尤其是在不饱和脂肪酸合成方面的关键作用。
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红色.通路；紫色.功能模块；黄色.酶；天青色.相互作用；绿色.代谢物 Red. Pathway; Purple. Modules; Yellow. Enzyme; Azure. Interaction; Green. Metabolites 图 5 固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉差异代谢物富集不饱和脂肪酸生物合成通路的调控网络分析 Fig. 5 Regulatory network analysis of significantly differential metabolites enriched in biosynthesis of unsaturated fatty acids pathway in eye meat, shoulder meat and hip meat of Guyuan cattle |
本研究旨在了解与固原黄牛肉风味相关的代谢物和探究代谢物与肉品质的关系，利用WGCNA分析再次对眼肉、肩肉和臀肉品质相关差异代谢物进行探索。聚类分析显示, 除了YR2个体，眼肉组(YR)代谢物与肩肉组(JR)和臀肉(TR)组代谢物分布存在差异，肩肉组(JR)和臀肉(TR)组代谢物相近(图 6A)。说明眼肉与肩肉、眼肉和臀肉品质上存在差异，肩肉和臀肉品质上相近。当R2为0.8，软阈值为3时(图 6B)，平均连接度急剧下降(图 6C)。将代谢物用颜色模块进行注释分类，共14个颜色模块，其中蓝色模块(blue)、棕色模块(brown)、绿松石模块(turquoise)占有较大比例(图 6D)。相关性分析显示, 眼肉(YR)与蓝色模块(blue)具有强相关，肩肉(JR)与棕色模块(brown)强相关，臀肉(TR)与绿松石模块(turquoise)强相关(图 6E)。当模块中GS(gene significance)与MM(module membership)大于0.8时，3个模块共有1个关键代谢物，为11(Z), 14(Z)-二十碳二烯酸[11(Z), 14(Z)-Eicosadienoic Acid]，当GS与MM大于0.6时YR有35个关键代谢物(图 6G)，如(±)18-HEPE、(+/-)12(13)-DiHOME、LPE 20 ∶3、LPE 22 ∶4、15-OxoEDE；TR有11个关键代谢物(图 6H)；JR有17个关键代谢物(图 6I)。
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A. 样本聚类；B-C.为了获得更佳拓扑关系，进行软阈值β的计算，本研究中β=6，此时R2为0.8，平均连接度区域恒定；D.颜色模块聚类；E.颜色模块相关性分析；F.代谢物与组织部位关联性分析；G-I.模块中基因显著性(GS)与模块成员(MM)的散点图 A. Clustering of samples; B-C. Calculation of soft threshold β was carried out in order to obtain better topological relationships, β=6 in this study, at which time R2 was 0.8 and the average connectivity region was constant; D. Color module clustering; E. Color module correlation analysis; F. Correlation analysis between metabolites and tissue location; G-I. Scatter plot of gene significance (GS) versus module membership (MM) in the module 图 6 固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉WGCNA分析 Fig. 6 WGCNA analysis of eye, shoulder and hip meat of Guyuan cattle |
不同肉牛品种和胴体部位的肌肉因肌纤维、结缔组织组成差异呈现不同特点，一般腿部、颈部肌肉日常活动量大肌肉韧性相对较强，对应部位肉品嫩度也相对差些，肉品等级低，距腿部和颈部远一些部位的肉品相对细嫩，肉品等级高[15-17]。在对分割肉的食用品质评定过程中背腰部分割肉肉品等级明显优于臀部和前后腿分割肉肉品等级[18]。分割肉中的眼肉，为牛背前部两侧背最长肌，肌内脂肪易沉积形成大理石花斑纹状，食用口感细嫩，是高档牛肉来源的主要部位；臀肉为后腿近臀部位肉品，肌肉外形呈圆滑状，肌内脂肪含量相对其它部位肌肉低，食用口感明显不及眼肉，肉品档次等级低；肩肉为前肩胛部和前腿的上部肌肉，肌纤维比较粗，嫩度差，肉品档次等级较低[19-21]。臀肉和肩肉在肉品品质上相近，眼肉与臀肉和肩肉存在明显的差异。对固原黄牛不同部位肌肉组织进行代谢物分析发现臀肉和肩肉聚为一类，眼肉聚为一类，说明臀肉和肩肉代谢物组成相近，眼肉与臀肉和肩肉之间存在差异，与肉品档次分级一致。以上也说明代谢物组成与牛肉品质存在一定的相关性，代谢物分析可以作为一种研究固原黄牛肉品质的有效方法。
肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)含量是决定牛肉品质的重要因素之一，大量研究表明肌内脂肪含量与牛肉的多汁性、嫩度和适口性呈正相关[22-24]。牛肉肌内脂肪中较高百分比的单不饱和脂肪酸(MUFA)可以导致较低的脂肪熔点，可提升肉质的柔软度和改善牛肉的风味[25-29]。关注度较高的肉牛品种中，日本和牛背长肌脂肪含量高达36.5%，并且有较高的PUFA/SFA(多不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸)比例[30]。美国2014年一份关于产品质量的白皮书显示和牛和安格斯牛背最长肌中肌间脂肪含量与MUFA(单不饱和脂肪酸)含量呈正相关，提示高品质牛肉除了有出色的食用口感，还有更高的营养价值[31]。固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉代谢分析研究鉴定到的代谢物中脂质和类脂分子占比高达32.08%，LIPID MAPS分类中脂肪酸类占重要组成部分，表明脂类是牛肉重要组成分和影响固原黄牛肉品质的重要因素，在固原黄牛牛肉风味形成过程中发挥关键作用。在肉品大理石花纹感官上，固原黄牛的眼肉与臀肉和肩肉存在明显的差异，眼肉大理石花纹评分优于臀肉和肩肉，属于3个部位肉品品质最高的。眼肉与肩肉和臀肉相比，油酸、花生四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸等不饱和脂肪酸显著高表达，其中油酸是一种单不饱和Omega-9脂肪酸，也是牛肉中最丰富的脂肪酸。油酸不仅参与牛肉风味形成，对人体健康方面也有积极的作用，可以通过影响机体血脂水平和降低胆固醇水平减少心血管疾病的发生率[31-33]。花生四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸均为多不饱和脂肪酸，具有调节血脂改善血液循环作用，对机体健康有着重要影响，本研究分析结果与前人研究中表明的高品质牛肉PUFA/SFA比例相对较高基本相符[34]。
差异代谢物中花生四烯酸-12-脂加氧酶、花生四烯酸15-脂加氧酶、花生四烯酸5-脂加氧酶、sn-1特异性二酰基甘油脂肪酶、前列腺素内过氧化物合酶等都是参与花生四烯酸代谢相关酶，花生四烯酸是一种ω-6多不饱和脂肪酸，广泛地参与机体的脂代谢和炎症反应[35]。二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸含量受花生四烯酸调节呈正相关[36]。硬脂酰辅酶A-9-去饱和酶也是多不饱和脂肪酸转化为更长多不饱和脂肪酸的关调控酶[37]。生物体内脂类物质的合成、分解和转化过程十分复杂，受多种酶及不同通路的调控，如前列腺素是二十碳不饱和脂肪酸花生四烯酸经酶促代谢产生的一类脂质介质，前列腺素内过氧化物合酶是前列腺素生物合成过程中的关键酶，此外乙酰辅酶A-酰基转移酶、氨基酸-N-酰基转移酶、长链脂肪酸辅酶A连接酶等在脂质代谢都起重要的作用。不同部位肌肉组织代谢物差异分析结果也表明固原黄牛肉独特风味以及整体的品质特性与不饱和脂肪酸生物合成过程中的相关酶和代谢物相关。
N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸和麦芽三糖是眼肉、肩肉和臀肉共同差异代谢物，二者均在眼肉中含量最高(P＜0.05)。N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸作为负责脂肪酸跨线粒体膜转运载体分子肉碱的前体，在脂肪酸代谢中起着至关重要的作用[38]。肉碱除了将长链脂肪酸转运到线粒体中，还在调节线粒体内酰基辅酶A与游离辅酶A的比例中起重要作用，同时调节参与三羧酸循环(TCA)、脂肪酸氧化、尿素循环和糖异生的几种线粒体酶的活性，对心脏能量代谢至关重要[39]。麦芽三糖作为肝脏中的主要可溶性糖，参与碳水化合物代谢、脂质代谢与肝脂肪沉积以及肌内脂肪含量密切相关[40]。固原黄牛眼肉、肩肉、臀肉中的N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸、麦芽三糖含量呈递减趋势，可能与肌内脂肪沉积程度有关，也是影响牛肉风味的关键因素。
眼肉与肩肉、眼肉与臀肉以及肩肉与臀肉差异代谢物共同富集到核酸、脂类、氨基酸合成与代谢以及能量代谢等通路，其中不饱和脂肪酸生物合成、味觉传导、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、花生四烯酸代谢、乙醛酸及二羧酸代谢与牦牛脂肪沉积特征研究中差异代谢物富集通路一致[41]。乙醛酸代谢和二羧酸代谢与延边黄牛风味研究中眼肉和臀肉差异代谢物富集通路一致[42]。氮代谢、氧化磷酸化通路与牦牛品质特性研究中脊肉与肩肉品质差异基因富集到相关通路一致[18]。综上说明，不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢、氧化磷酸化通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等通路是影响固原黄牛肉品质的关键代谢通路。
4 结论本研究采用非靶向代谢组学对固原黄牛眼肉、臀肉和肩肉3个部位肌肉组织进行分析研究，发现脂肪酸类代谢物在鉴定到的代谢物中占比最高，可能在固原黄牛风味形成过程中发挥关键作用。脂肪细胞中脂肪分解调节、花生四烯酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、丙酸酯代谢、不饱和脂肪酸生物合成、糖的消化和吸收等通路参与固原黄牛风味形成的调控，这些结果可能是固原黄牛不同部位肌肉组织肉品质差异的重要原因。此外，本研究鉴定到的10种关键代谢物和17种关键酶可作为固原黄牛风味形成及品质研究的候选生物标志物。同时，本研究结果有助于解析不同个体不同组织部位风味品质差异，为进一步固原黄牛品质性状分子育种的研究提供理论依据。
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(编辑 郭云雁)