2. 华中农业大学信息学院，武汉 430070
, YU Qian1, LIU Yucheng1, YANG Hua1, ZHAO Zhuo1, WANG Limin1, ZHOU Ping1, YANG Qingyong1,2
, DAI Rong1
2. College of Informatics, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
新疆是传统养殖大省也是牛羊肉消费大省。统计局公布数据显示，2022年底新疆羊肉产量60.72万吨占全国的11.58%，羊胴体重平均16 kg以上，高出全国平均水平，但与美国、澳大利亚等畜牧业发达国家还存在较大差距。影响羊肉用性能的因素很多[1]，其中品种是肉用性能提升的基础，而携带优良肉用性能基因是产肉能力提升的核心[2]。
骨骼肌的生长发育与绵羊产肉性能密切相关，肌纤维直径的大小和肌内脂肪含量多少是评价肉品质的重要指标[3]。肌球蛋白是肌原纤维的组成单位，由两条重链和四条轻链组成。肌球蛋白轻链(myosin light chain，MYL)是由基础性轻链(essential light chain，ELC)和调节性轻链(regulatory light chain，RLC)组成的多基因家族[4]，在维持重链构象、调节骨骼肌发育和肌纤维活性中发挥作用[5-6]。人基因组中已鉴定出13个MYL基因，其中MYL1、MYL3、MYL4、MYL6和MYL6B是ELC型，其他属于RLC型[7]。有研究发现, MYL家族成员对羊肌细胞的生长发育也有调节作用[8-10]。Zhan等[11]分析了增殖和分化阶段的山羊骨骼肌卫星细胞表达谱，发现MYL2基因参与调控山羊骨骼肌生成。MYL2基因不仅参与产前肌肉纤维的产生，还涉及与肌肉发育相关的信号通路[12]。Xie等[13]分析了内蒙古绒山羊不同部位的肌肉组织蛋白谱，鉴定出MYL3基因在股二头肌中显著高水平表达，推测其表达水平与肌肉韧性有关。Noce等[14]利用表达谱芯片分析了西班牙5个品种的肉用绵羊骨骼肌转录组，确定MYLPF在调节肌肉收缩上发挥重要作用。
综上所述，MYLs在肌肉发生发育和功能形成方面有重要作用，但该基因家族在绵羊基因组中的成员及特性等缺乏系统全面的了解。因此，本研究利用生物信息学方法在绵羊基因组水平筛选MYL基因家族成员，并分析其理化性质、基因结构、染色体分布、选择压力和蛋白互作，比较MYLs在绵羊与山羊和牛基因组上的进化关系，确定MYLs在不同品种绵羊中的组织表达模式，为深入探讨绵羊MYLs基因调控肌肉生长发育的作用机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物试验羊均来自石河子市新疆农垦科学院华宇基地种羊场。随机选取饲养环境一致的军垦白肉羊(n=3)、新疆细毛羊(n=3)和湖羊(n=3)成年公羊，屠宰后立即取骨骼肌(腿)、大肠、小肠、背最长肌、心、肝、瘤胃、脾、肺、肾等组织样品，放入-80 ℃液氮中保存，以备提取RNA。
1.2 主要试剂动物组织总RNA提取试剂盒(DP431)、凝胶回收试剂盒(DP219)和SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBR Green、FP205)都购自天根生化科技(北京)有限公司，pMD19-T载体、cDNA第一链合成试剂盒(RR047A)购自TaKaRa公司，大肠杆菌DH5α感受态细胞、T4 DNA连接酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.3 数据来源研究中的参考基因组数据及相关基因的编码序列和氨基酸序列均从公共数据库中获得。NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载绵羊参考基因组(GCA_016 772 045.1)，从Ensemble(http://asia.ensembl.org/index.html)获得绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra hircus)、人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、猪(Sus scrofa)和牛(Bos taurus)MYLs的氨基酸序列。基于省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室杨庆勇团队构建的多物种全组织表达谱数据库HTIR(http://yanglab.hzau.edu.cn/HTIR#/)获取成年湖羊脑、心、肝、脾、肺、结肠、骨骼肌等17个组织的表达量数据。
1.4 方法1.4.1 引物设计与合成 根据NCBI公布的绵羊MYL1、MYL6B和MYLPF的CDS序列，利用PrimerPremier 5.0软件设计基因克隆引物和荧光定量PCR引物(表 1)。引物由赛默飞世尔科技公司合成。
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表 1 引物信息 Table 1 Primers information |
1.4.2 RNA提取和cDNA合成 根据RNA提取试剂盒提取各组织样的总RNA。取1 μL提取的总RNA用核酸蛋白检测仪测定RNA的质量浓度，取5 μL用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。检测合格的RNA反转录为cDNA，-20 ℃保存备用。
1.4.3 MYL1、MYL6B和MYLPF基因克隆与测序 以军垦白肉羊背最长肌cDNA为模板，扩增3个目的基因完整的CDS区，扩增体系(15 μL)：模板cDNA 1.0 μL，上、下游引物(10 μmol ·L-1)各0.5 μL，2×taq PCR MasterMix Ⅱ 7.5 μL，ddH2O 5.5 μL。反应程序：94 ℃预变性8 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收目的片段，随后将目的片段和载体pMD19-T连接、进行转化及鉴定，挑取阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.4.4 qRT-PCR 按照试剂盒推荐方法，qRT-PCR采用20 μL反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.6 μL，补足RNase-free ddH2O至终体积20 μL。PCR程序：95 ℃ 15 min; 95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。循环结束后通过熔解曲线检测引物的特异性。以GAPDH作为内参基因，每个样品3次重复，采用2-ΔΔct法计算基因相对表达量，使用GraphPad Prism 8软件分析作图。
1.5 MYL基因家族的生物信息学分析1.5.1 绵羊MYL基因的鉴定、染色体定位和理化性质分析 利用在线数据库Pfam检索绵羊MYLs蛋白保守结构域。以绵羊MYLs蛋白序列作为查询序列，在绵羊蛋白质序列数据库进行Blastp比对，通过NCBI的CD-search在线工具进行验证，并利用绵羊参考基因组的MYL基因信息进行注释校正[15]。使用TBtools(v1.09)软件[16]的Gene Location Visualize(Advanced)绘制染色体定位图。通过在线软件ExPASy分析绵羊MYLs的氨基酸数目、等电点、分子量和亲疏水性均值等信息。采用WOLF PSORT在线工具研究蛋白亚细胞定位。利用SignalP和TMHMM sever 2.0在线平台预测MYLs基因家族蛋白质的跨膜结构域等[17]。
1.5.2 基因结构和保守基序分析 利用MEME在线平台预测MYLs的蛋白保守基序(Motif)，基序数量参数为10，其他参数默认。采用TBtools软件对绵羊MYLs的进化关系、蛋白保守结构域、基因结构和Motif进行可视化分析。
1.5.3 系统进化树的构建 利用MEGA7.0软件内置的Clustal W程序对绵羊、山羊、人、鼠、猪和牛的MYL蛋白质序列进行序列比对，分析结果用Neighbor-joining方法构建系统发生树[18]，选用泊松模型，校验参数bootstrap设置为1 000次重复，其他参数默认[19]。利用在线工具iTOL(https://itol.embl.de)渲染系统发育树。
1.5.4 共线性分析 在TBtools软件的MCScanX功能界面分析绵羊MYL基因的复制事件，并分析绵羊和山羊(GCA_001 704 415.1)牛(GCA_002 263 795.3)之间的同源性，随后利用Advanced Circos和Dual Systeny Plot进行可视化。提取绵羊、山羊和牛的MYLs基因CDS序列，通过Simple Ka/Ks Calculator(NG)计算其非同义(Ka)和同义(Ks)替换。
1.5.5 蛋白质二级结构预测及互作网络分析 利用SOPMA在线软件预测绵羊MYLs的蛋白质二级结构。使用STRING(https://string-db.org/cgi/input?sessionId)构建蛋白质互作网络，蛋白质来源设置为绵羊(Ovis aries)，其他参数默认，分析绵羊MYL与其他蛋白质及家族成员间的相互作用。
1.5.6 羊MYL家族基因表达模式分析 在本实验室构建的HTIR数据库中下载湖羊全组织转录组数据，从基因表达量数据(TPM)文档中提取各组织MYLs表达数据，利用TBtools软件的Heatmap界面绘制湖羊MYLs在17个组织的表达量热图[20]。
2 结果 2.1 绵羊MYLs的鉴定及其在染色体上的分布基于蛋白质保守结构域和系统进化关系，在绵羊基因组中鉴定到12个MYLs家族成员。根据基因注释文件命名为MYL1、MYL2、MYL3、MYL4、MYL6、MYL6B、MYL7、MYL9、MYL10、MYLPF、MYL12A和MYL12B。12个MYLs基因分布在9条染色体上(图 1)，其中MYL6和MYL6B位于3号染色体，MYL3和MYL12A位于19号染色体，MYL10和MYLPF位于24号染色体，剩余6个成员分布在2、4、11、13、17和23号染色体。
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图 1 绵羊MYLs在染色体上的分布 Fig. 1 The chromosomes distribution of the MYLs in sheep |
ExPASy对蛋白质理化性质分析的结果显示，绵羊MYLs基因编码蛋白质的氨基酸数量在147个(MYL10)~211个(MYL6B)之间，相对分子质量在16 695.86(MYL7)~23 388.92(MYL6B)之间，等电点范围为4.37(MYL7)~5.40(MYL6B)，脂肪指数为52.27(MYL9)~82.18(MYL6B)，不稳定系数在24.73(MYL10)~56.48(MYL4)范围内(表 2)，无信号肽和跨膜结构域。亲疏水性指数结果显示，12个成员均为亲水性蛋白。MYL6B和MYLPF蛋白亚细胞定位在线粒体，其他成员均在细胞质中。
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表 2 绵羊MYL基因家族的理化性质 Table 2 Physicochemical properties of MYL gene family in sheep |
参考人MYLs的划分类型[5]，结合系统进化树结果(图 2)，以基因结构为参考将绵羊MYL家族成员分成3组，其中MYL2、MYL7、MYL10和MYLPF在组Ⅰ，MYL9、MYL12A和MYL12B在组Ⅱ，组Ⅰ和组Ⅱ同属于RLC型；组Ⅲ包括MYL1、MYL3、MYL4、MYL6和MYL6B是ELC型。EF-hand结构域(PF13405)是MYLs家族成员共有的保守结构域。MYLs的外显子数目在1~8个之间，其中MYL1和MYL7包含8个外显子，有6个外显子的基因最多，占50%。
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图 2 绵羊MYL基因家族结构与进化 Fig. 2 Gene structure and evolution of MYL gene family in sheep |
同一组基因的Motif种类、数量和位置较为一致，每个基因包含3~6个Motif(图 3)，Motif1和Motif2是家族成员共有，RLC型均有Motif3，Motif4和Motif5只在ELC型中出现。利用Pfam在线数据库进行注释，发现Motif1包含EF-hand结构域，这是MYL基因家族成员共有的保守结构域[5]。
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图 3 绵羊MYL基因家族保守基序 Fig. 3 Conserved motifs of MYL gene family in sheep |
利用MEGA7.0比对分析了人(13个)、鼠(13个)、牛(13个)、猪(12个)、山羊(12个)和绵羊(12个)6种哺乳动物的MYL蛋白质序列，构建系统进化树(图 4)。结果显示，与蛋白和基因结构构建的系统发育树结果一致。绵羊RLC型的MYLs进化关系与山羊较近，ELC型与山羊和牛亲缘关系较近。
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图 4 人、鼠、猪、牛、山羊和绵羊MYL基因家族发育树 Fig. 4 The phylogenetic tree of MYL gene family in Homo sapiens(Hom.), Mus muscμlus(Mus.), Sus scrofa(Sus.), Bovidae(Bos.), Capra hircus(Cap.) and Ovis aries(Ova.) |
根据绵羊基因组注释文件，对MYLs进行物种内和物种间共线性分析。12个MYLs中有2对基因，MYL2和MYL10、MYL2和MYLPF，存在片段复制现象(图 5)，选择压力Ka/Ks值分别是0.08和0.11，表明在进化过程中受到的纯化选择较强。物种间共线性分析结果显示，绵羊(12个MYLs)、山羊(12个MYLs)和牛(13个MYLs)MYL基因家族高度保守。绵羊与山羊、绵羊与牛基因组之间分别存在12对(图 6a)和14对(图 6b)共线性关系。同时也发现一个基因同时和多个基因呈现共线性关系，其中绵羊MYL2基因与牛MYL2、MYL10和MYLPF同源。
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灰色线表示绵羊基因组中的所有共线性区块，而黄色线表示发生复制的MYL基因对 The gray line represents all the collinearity blocks in the sheep genome, while the yellow line represents the MYL gene pairs in which replication occurs 图 5 绵羊MYL基因家族成员共线性分析 Fig. 5 Collinear distribution of MYL family members |
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绵羊与山羊(a)和牛(b)MYL基因的共线性分析，背景中的灰色线表示绵羊与山羊、牛基因组中的共线性区块，而红色和紫色的连接线则突出显示了MYL相关的共线性基因对 Synteny analysis of MYL genes between sheep and goat(a), sheep and cattle(b). The gray lines in the background indicate the collinear blocks within sheep and other animal genomes, while the red and purple lines highlight the syntenic MYL gene pairs 图 6 绵羊与山羊和牛MYL的同源性分析 Fig. 6 Synteny analysis of MYL family members between sheep and goat, cattle |
绵羊MYLs氨基酸序列的二级结构由α-螺旋、无规则卷曲、β-转角和延伸链组成(表 3)。家族成员与肌球蛋白重链10(myosin heavy chain 10，MYH10)、骨骼肌肌动蛋白A1(actin alpha 1，ACTA1)和肌动蛋白γ1(actin gamma 1，ACTG1)等33个蛋白质互作，其中MYH10与各成员都有互作关系(图 7)。
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表 3 绵羊MYL蛋白的二级结构 Table 3 Secondary structure of MYL protein in sheep |
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图 7 绵羊MYLs蛋白互作网络 Fig. 7 Proteins interaction network of MYLs in sheep |
基于本实验室搭建的多物种全组织转录组数据库中基因表达量数据(TPM)，建立湖羊MYLs的组织表达模式(图 8)。结果显示MYL1、MYL2和MYLPF在长斜方肌、胸肌、腹外直肌、三角肌、腹外斜肌和背阔肌等骨骼肌中的表达水平显著高于其他组织。MYL3在骨骼肌组织中表达水平相对较高。MYL4和MYL7特异在心脏组织中极显著地高表达。MYL6、MYL6B、MYL9和MYL12B在各组织中都有表达，其中MYL6、MYL9和MYL12B在非骨骼肌组织中的表达水平要高于各骨骼肌组织。MYL10和MYL12A在各组织的表达水平较低，或不表达。
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数字代表表达量的值；颜色刻度条代表基因表达量 The number represents the value of expression. The color scale bar represents the amount of expression 图 8 绵羊MYLs基因组织表达模式 Fig. 8 Tissues expression pattern of MYLs gene family in sheep |
PCR扩增结果显示(图 9)，扩增产物条带明亮且清晰，大小在400~600 bp之间，与MYL1、MYL6B和MYLPF基因CDS的全长(579、635和450 bp)相比大小一致。测序结果表明，扩增片段为目的基因序列。
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M.DNA相对分子质量标准；1~3.MYL1、MYL6B和MYLPF基因；4.空白对照 M.DNA Marker; 1-3. MYL1, MYL6B and MYLPF genes of sheep; 4. Blank control 图 9 MYL1、MYL6B和MYLPF基因全长cDNA扩增结果 Fig. 9 Full length cDNA amplification of MYL1, MYL6B and MYLPF |
以军垦白肉羊为对象，运用qRT-PCR技术分析MYL1、MYL6B和MYLPF基因在心、肝、肺和肾等10个组织的表达情况(图 10)。结果显示，MYL1、MYL6B和MYLPF基因在军垦白肉羊背最长肌和骨骼肌中表达量极显著高于其他组织(P < 0.000 1)。MYL1和MYLPF均在瘤胃、脾和肺低水平表达。MYL6B基因在瘤胃和脾脏中的表达量高于在小肠、大肠、肝脏、肺部和肾脏中的表达水平。
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以心脏组织的表达水平作为对照，****代表差异极显著(P < 0.000 1) The heart tissues was used as a control, **** represents an extremely significant difference (P < 0.000 1) 图 10 MYL1、MYL6B和MYLPF在绵羊10个组织的表达 Fig. 10 Expression of MYL1, MYL6B and MYLPF in10tissues ofsheep |
比较了军垦白肉羊、湖羊和细毛羊的心脏、肝脏和骨骼肌3种组织中MYL1、MYL6B和MYLPF基因的表达差异(图 11)。结果显示，MYL1、MYL6B和MYLPF均表现出骨骼肌中高水平的特异表达。在这3个品种之间，MYL1、MYL6B和MYLPF的骨骼肌表达差异非常显著(P < 0.000 1)，且在军垦白肉羊中的表达显著高于湖羊和细毛羊。在不同品种的绵羊肝脏组织中，MYL1的表达在细毛羊中极其显著高于湖羊和军垦白肉羊(P < 0.000 1)，而MYL6B在湖羊中的表达水平则极显著高于细毛羊和军垦白肉羊(P < 0.000 1)。
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以心脏表达水平作为对照。图柱上标字母表示不同品种绵羊同一组织中基因表达量差异极显著(P < 0.000 1)。相同的大写字母表示基因在骨骼肌组织中表达量差异极显著, 相同的小写字母表示基因在肝脏组织中表达量差异极显著 Heart expression levels were used as a control. The letters on the bars in the figure indicate extremely significant expression differences of the same gene in the same tissue of different sheep breeds (P < 0.000 1). The same capital letter indicates extremely significant expression differences of the gene in the skeletal muscle tissue, while the same lowercase letter indicates extremely significant expression differences of the gene in the liver tissue 图 11 MYL1、MYL6B和MYLPF基因在不同绵羊品种和不同组织中的表达量 Fig. 11 Expression of MYL1, MYL 6B and MYLPF in different breeds and tissues of sheep |
MYLs在人[7]、鸡[21]和猪[22]肌肉生长发育中发挥重要的调节作用。有研究表明, 该基因家族成员与羊肉用性能密切相关[13, 23]，但对绵羊中MYL家族成员缺乏全面系统的认识。本研究在绵羊基因组中共鉴定出12个MYL基因，它们共有Motif1和Motif2，其中Motif1包含EF-hand保守结构域，该结构域是钙传感器，Ca2+是骨骼肌兴奋收缩耦联的桥梁，当EF-hand与Ca2+结合时发生构象改变，完成与下游靶点的相互作用[24]。含有EF-hand结构域的蛋白功能多样[25]，如细胞质中的钙缓冲，细胞区室之间的信号转导和肌肉收缩等。
MYH10是调控肌纤维组成和肌内脂肪含量的候选基因[26-27]。岳彩娟等[28]分析了湖羊与滩羊的差异甲基化基因，发现MYH10富集在与肌肉相关的功能调控通路中，与肌肉发育分化，肌纤维组成等密切相关。本研究发现MYH10是绵羊MYL基因家族共有的互作蛋白。由此推测，MYH10与绵羊MYLs之间的蛋白互作，可能是调节绵羊骨骼肌收缩和发育的重要因素，但是具体调控方式有待进一步研究。
位于同一系统发育进化分枝上的蛋白可能具有相似的结构和功能[29]。本研究中, MYL1、MYL3、MYL4、MYL6和MYL6B位于同一组，属于ELC型。ELC型肌球蛋白主要参与调节肌肉的受力和力学性能，它的变化可以影响肌肉纤维的收缩速度和力量[3]。研究发现，MYL1、MYL3和MYL6B与内蒙古绒山羊的肉质特性形成相关，免疫组化分析结果显示，MYL3的表达比例可能作为肌肉韧性的潜在分子标记[13]。MYL1和MYL3在骨骼肌中的表达水平较高，此外发现MYL1基因具有2个TATA box，推测MYL1是绵羊骨骼肌组织特异性表达的基因[30]。MYL3主要在牛肌原纤维的粗肌丝中表达，编码蛋白的表达水平随生长月龄的变化呈现递增趋势[23]，主要与调控肌肉生长发育的相关蛋白相互作用[31]。MYL4与肌动蛋白单体结合相关，是控制大鼠心房收缩、电性和结构完整性的关键基因[32]，其功能障碍会导致严重的遗传性心房心肌病[33]。本研究发现，MYL4在绵羊心脏组织中特异性高表达，推测该基因在绵羊心脏功能维持中具有重要作用。
RLC型肌球蛋白主要参与肌肉纤维的结构稳定和肌肉功能的调节，它的变化可以影响肌肉的适应性和功能[4]。RLC型家族成员有MYL2、MYL7、MYL10、MYLPF、MYL9、MYL12A和MYL12B。其中，MYL9和MYL12B蛋白质互作网络相似。研究发现，猪肌生成抑制素基因(myostatin，MSTN)敲除后，MYL9 mRNA和蛋白的表达水平显著上调，表明MYL9在猪骨骼肌的生长和发育中起着重要作用，并推测MYL9可能通过控制ATP酶活性来调节肌肉能量代谢，或者与肌凝蛋白相互作用间接参与骨骼肌生长发育的调控[10]。Deeg等[34]证明了MYL12A是维持鸡外周血单个核细胞和溶菌酶细胞完整性所必需的基因。MYL12B是细胞骨架的重要组分[35]，作为肌球蛋白的调节性轻链，可通过调节轻链的磷酸化与去磷酸化来参与调节细胞信号传导。MYL9和MYL12B在湖羊各个组织中广泛表达，表现出相近的调控网络和作用机制。
MYL2和MYLPF在湖羊胸肌等骨骼肌中高表达，MYL10在各组织中低表达。MYL2是肌纤维再生的敏感标记物[36]，与MYL10编码的蛋白共同调控形成紧密连接、黏着斑和肌动蛋白细胞骨架[37]。MYL7表达水平的变化与唐氏综合征患者的先天性心脏病密切相关[5]，本研究发现MYL7在湖羊心脏中呈现特异性高表达。MYLPF在山羊背最长肌、腓肠肌和腹肌中表达水平高，而在肝、脾、肺和肾中表达水平低，且骨骼肌中MYLPF的表达量随着年龄增长而逐渐减少，说明MYLPF在骨骼肌的生长和分化发育中具有重要作用[3]。绵羊种内共线性分析揭示了2对(MYL2-MYL10、MYL2-MYLPF)基因片段复制现象。生物进化过程中，片段复制和串联重复有助于加速基因家族的扩张，为获取新的基因功能提供机会[38]。基因在复制过程中发生遗传变异，引起功能分歧，随后纯化选择，这些功能被保留下来[39]。
基因的表达在一定程度上揭示了基因的潜在功能[40]，为进一步挖掘与绵羊肌肉发育相关的基因，本研究根据湖羊MYLs 的多组织表达模式分析结果，挑选出在肌肉中高水平表达的家族成员。利用qRT-PCR技术，检测了处于育种过程中的军垦白肉羊各组织的基因表达变化，并与湖羊各组织的检测对比结果相似，其中MYL1、MYL6B和MYLPF在军垦白肉羊肌肉中的表达水平也显著高于其他组织(P < 0.000 1)。军垦白肉羊是新疆农垦科学院选育的、适应工厂化养殖的良种肉羊群体，其产肉性能和肉品质优良。本研究比较了MYL1、MYL6B和MYLPF基因在军垦白肉羊、湖羊和细毛羊这3个不同品种绵羊的表达差异，发现以上基因在军垦白肉羊骨骼肌中的表达显著高于湖羊和细毛羊(P < 0.000 1)。同时，还比较了3个品种绵羊肝脏中MYL1、MYL6B和MYLPF的表达情况，发现MYL1在军垦白肉羊和湖羊的表达水平显著低于细毛羊(P < 0.000 1)，而MYL6B在军垦白肉羊和细毛羊的表达水平显著低于湖羊(P < 0.000 1)。肝脏是脂肪分解代谢的重要器官。推测MYL1和MYL6B在军垦白肉羊肝脏中的低水平表达，可能影响脂肪沉积，有利于肌内脂肪的形成。这些发现对于深入了解绵羊肉质形成的分子机制具有重要意义，并为今后通过遗传改良提高绵羊的肉质提供了新的候选基因。
4 结论本研究利用生物信息学技术在绵羊基因组中鉴定出了12个MYLs基因，并对该家族成员进行理化性质、遗传进化和表达模式分析，发现MYL家族基因在绵羊不同组织表达具有特异性，其中MYL1、MYL6B和MYLPF在肌肉中表达水平显著高于其他组织，研究结果为进一步探讨MYL 基因家族与绵羊肌肉生长发育的关系提供了科学基础。
| [1] |
PRACHE S, SCHREURS N, GUILLIER L. Review: factors affecting sheep carcass and meat quality attributes[J]. Animal, 2022, 16(Suppl): 100330. |
| [2] |
杨宇为, 周玉香, 孙占鹏. 羊肉品质的影响因素及其调控措施研究概况[J]. 家畜生态学报, 2013, 34(12): 82-85. YANG Y W, ZHOU Y X, SUN Z P. Review on the influencing factors and control measures of mutton quality[J]. Acta Ecologae Animalis Domastici, 2013, 34(12): 82-85. DOI:10.3969/j.issn.1673-1182.2013.12.019 (in Chinese) |
| [3] |
XU H G, XU G Y, WANG D H, et al. Molecular cloning, sequence identification and expression analysis of novel caprine MYLPF gene[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(3): 2565-2572. DOI:10.1007/s11033-012-2342-0 |
| [4] |
TIMSON D J. Fine tuning the myosin motor: the role of the essential light chain in striated muscle myosin[J]. Biochimie, 2003, 85(7): 639-645. DOI:10.1016/S0300-9084(03)00131-7 |
| [5] |
ZHANG C L, WANG G Z, JI Z B, et al. Molecular cloning, characterisation and mRNA expression analysis of the sheep myosin light chain 1 gene[J]. Gene, 2015, 569(1): 51-59. DOI:10.1016/j.gene.2015.04.048 |
| [6] |
张素珍, 解慧琪, 徐永, 等. 肌球蛋白轻链在肌肉再生中作用的体外实验研究[J]. 中国修复重建外科杂志, 2008, 22(6): 753-758. ZHANG S Z, XIE H Q, XU Y, et al. An experimental study of the role of myosin light chain in myogenesis in vitro[J]. Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, 2008, 22(6): 753-758. (in Chinese) |
| [7] |
HEISSLER S M, SELLERS J R. Myosin light chains: teaching old dogs new tricks[J]. Bioarchitecture, 2014, 4(6): 169-188. DOI:10.1080/19490992.2015.1054092 |
| [8] |
SHI J P, WANG X Y, SONG Y L, et al. Excavation of genes related to the mining of growth, development, and meat quality of two crossbred sheep populations based on comparative transcriptomes[J]. Animals, 2021, 11(6): 1492. DOI:10.3390/ani11061492 |
| [9] |
MOHAMMADABADI M, BORDBAR F, JENSEN J, et al. Key genes regulating skeletal muscle development and growth in farm animals[J]. Animals, 2021, 11(3): 835. DOI:10.3390/ani11030835 |
| [10] |
JIAO D, JI K X, WANG W Q, et al. Transcriptome profiles of the liver in two cold-exposed sheep breeds revealed different mechanisms and candidate genes for thermogenesis[J]. Genet Res, 2021, 2021: e10. |
| [11] |
ZHAN S Y, ZHAI H F, TANG M, et al. Profiling and functional analysis of mRNAs during skeletal muscle differentiation in goats[J]. Animals (Basel), 2022, 12(8): 1048. |
| [12] |
VERARDO L L, NASCIMENTO C S, SILVA F F, et al. Identification and validation of differentially expressed genes from pig skeletal muscle[J]. J Anim Breed Genet, 2012, 130(5): 372-381. |
| [13] |
XIE Y C, RILE N, LI X W, et al. Analysis of cashmere goat meat by label-free proteomics shows that MYL3 is a potential molecular marker of meat toughness[J]. Czech J Anim Sci, 2022, 67(4): 137-146. DOI:10.17221/61/2021-CJAS |
| [14] |
NOCE A, CARDOSO T F, MANUNZA A, et al. Expression patterns and genetic variation of the ovine skeletal muscle transcriptome of sheep from five Spanish meat breeds[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 10486. DOI:10.1038/s41598-018-28760-9 |
| [15] |
PAN C L, WANG S Z, YANG C Y, et al. Genome-wide identification and expression profiling analysis of Wnt family genes affecting adipocyte differentiation in cattle[J]. Sci Rep, 2022, 12(1): 489. DOI:10.1038/s41598-021-04468-1 |
| [16] |
CHEN C J, WU Y, LI J W, et al. TBtools-Ⅱ: a "one for all, all for one" bioinformatics platform for biological big-data mining[J]. Mol Plant, 2023, 16(11): 1733-1742. DOI:10.1016/j.molp.2023.09.010 |
| [17] |
陈达年, 马旭升, 代军飞, 等. 非洲猪瘟病毒多基因家族MGF360-13L基因功能的初步研究[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(12): 4419-4428. CHEN D N, MA X S, DAI J F, et al. Preliminary study on the function of MGF360-13L gene of African swine fever virus multigene family[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2022, 53(12): 4419-4428. (in Chinese) |
| [18] |
JACOB MACHADO D, PORTELLA DE LUNA MARQUES F, JIMÉNEZ-FERBANS L, et al. An empirical test of the relationship between the bootstrap and likelihood ratio support in maximum likelihood phylogenetic analysis[J]. Cladistics, 2022, 38(3): 392-401. DOI:10.1111/cla.12496 |
| [19] |
NASER-KHDOUR S, QUANG MINH B, LANFEAR R. Assessing confidence in root placement on phylogenies: an empirical study using nonreversible models for mammals[J]. System Biol, 2022, 71(4): 959-972. DOI:10.1093/sysbio/syab067 |
| [20] |
马淑娟, 徐祎洁, 何珂, 等. 反刍动物Toll样受体多基因家族的分子进化及表达模式分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(9): 3722-3734. MA S J, XU Y J, HE K, et al. Molecular evolution and expression patterns of a multigene family of Toll-like receptors in ruminants[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2023, 54(9): 3722-3734. (in Chinese) |
| [21] |
CHAVES L D, OSTROSKI B J, REED K M. Myosin light chain genes in the turkey (Meleagris gallopavo)[J]. Cytogenet Genome Res, 2003, 102(1/4): 340-346. |
| [22] |
LI X, XIE S S, QIAN L L, et al. Identification of genes related to skeletal muscle growth and development by integrated analysis of transcriptome and proteome in myostatin-edited Meishan pigs[J]. J Proteomics, 2020, 213: 103628. DOI:10.1016/j.jprot.2019.103628 |
| [23] |
刘瑞莉, 吴磊, 袁玮, 等. MYL3基因在肉牛肌肉生长过程中的功能研究[J]. 华北农学报, 2019, 34(2): 221-228. LIU R L, WU L, YUAN W, et al. Function of MYL3 gene in muscle growth of cattle[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2019, 34(2): 221-228. (in Chinese) |
| [24] |
WETERMAN M A J, BARTH P G, VAN SPAENDONCK-ZWARTS K Y, et al. Recessive MYL2 mutations cause infantile type Ⅰ muscle fibre disease and cardiomyopathy[J]. Brain, 2013, 136(1): 282-293. DOI:10.1093/brain/aws293 |
| [25] |
HEIZMANN C W. Calcium-binding proteins of the EF-hand superfamily: from basics to medical applications[M]. New York: Springer, 2019.
|
| [26] |
ZHUANG Z W, XU L Y, YANG J, et al. Weighted single-step genome-wide association study for growth traits in Chinese simmental beef cattle[J]. Genes (Basel), 2020, 11(2): 189. DOI:10.3390/genes11020189 |
| [27] |
YE M S, YE F, HE L T, et al. Transcriptomic analysis of chicken myozenin 3 regulation reveals its potential role in cell proliferation[J]. PLoS One, 2017, 12(12): e0189476. DOI:10.1371/journal.pone.0189476 |
| [28] |
岳彩娟, 梁小军, 王秀琴, 等. 滩羊和湖羊背最长肌全基因组甲基化差异分析[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(10): 3058-3068. YUE C J, LIANG X J, WANG X Q, et al. Whole genome methylation variation analysis of longissimus dorsi between tan sheep and hu sheep[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2020, 47(10): 3058-3068. (in Chinese) |
| [29] |
ADAMEK M, ALANJARY M, ZIEMERT N. Applied evolution: phylogeny-based approaches in natural products research[J]. Nat Prod Rep, 2019, 36(9): 1295-1312. DOI:10.1039/C9NP00027E |
| [30] |
张春兰. 小尾寒羊MYL1基因启动子区的克隆、分析及蛋白表达[J]. 中国畜牧杂志, 2020, 56(2): 150-152. ZHANG C L. Cloning, analysis and protein expression of MYL1 gene promoter region in small tail Han sheep[J]. Chinese Journal of Animal Science, 2020, 56(2): 150-152. (in Chinese) |
| [31] |
张梦帆, 路建卫, 扎老, 等. 牦牛MYL3基因的克隆及组织表达分析[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2024, 52(4): 1-9. ZHANG M F, LU J W, ZHA L, et al. Cloning and tissue expression analysis of MYL3 gene in yak (Bos grunniens)[J]. Journal of Northwest A & F University (Natural Science Edition), 2024, 52(4): 1-9. (in Chinese) |
| [32] |
PENG W H, LI M X, LI H L, et al. Dysfunction of myosin light-chain 4 (MYL4) leads to heritable atrial cardiomyopathy with electrical, contractile, and structural components: evidence from genetically-engineered rats[J]. J Am Heart Assoc, 2017, 6(11): e007030. DOI:10.1161/JAHA.117.007030 |
| [33] |
GHAZIZADEH Z, KIVINIEMI T, OLAFSSON S, et al. Metastable atrial state underlies the primary genetic substrate for MYL4 mutation-associated atrial fibrillation[J]. Circulation, 2020, 141(4): 301-312. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.119.044268 |
| [34] |
DEEG C A, DEGROOTE R L, GIESE I M, et al. CD11d is a novel antigen on chicken leukocytes[J]. J Proteomics, 2020, 225: 103876. DOI:10.1016/j.jprot.2020.103876 |
| [35] |
PARK I, HAN C, JIN S, et al. Myosin regulatory light chains are required to maintain the stability of myosin Ⅱ and cellular integrity[J]. Biochem J, 2011, 434(1): 171-180. DOI:10.1042/BJ20101473 |
| [36] |
NOGUCHI S, TSUKAHARA T, FUJITA M, et al. cDNA microarray analysis of individual duchenne muscular dystrophy patients[J]. Hum Mol Genet, 2003, 12(6): 595-600. DOI:10.1093/hmg/ddg065 |
| [37] |
CUI H X, LIU R R, ZHAO G P, et al. Identification of differentially expressed genes and pathways for intramuscular fat deposition in pectoralis major tissues of fast-and slow-growing chickens[J]. BMC Genomics, 2012, 13: 213. DOI:10.1186/1471-2164-13-213 |
| [38] |
梁莎莎, 庞春英, 邓廷贤, 等. 水牛STAT基因家族分析[J]. 中国牛业科学, 2022, 48(1): 45-52. LIANG S S, PANG C Y, DENG T X, et al. STAT gene family identification in water buffalo[J]. China Cattle Science, 2022, 48(1): 45-52. (in Chinese) |
| [39] |
ZHAO S R, YE Z, STANTON R. Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols[J]. RNA, 2020, 26(8): 903-909. DOI:10.1261/rna.074922.120 |
| [40] |
ZHANG C L, WANG J M, WANG G Z, et al. Molecular cloning and mRNA expression analysis of sheep MYL3 and MYL4 genes[J]. Gene, 2016, 577(2): 209-214. DOI:10.1016/j.gene.2015.11.041 |
(编辑 郭云雁)