间皮是分布于腹膜、胸膜、心包膜和大多数内脏器官表面的单层扁平上皮，其基本功能是作为一种保护性的湿润光滑表面减少脏器之间的摩擦，也是抵抗微生物和肿瘤细胞入侵的重要防线^[1]。间皮主要由间皮细胞构成，其源自于中胚层，但具有与上皮细胞相似的特征，如细胞极性、基底膜黏附、胞间紧密连接、表面微绒毛等^[2-3]。间皮细胞可分泌黏多糖和表面活性物质为脏器提供润滑和保护，同时间皮细胞还具有其他多种生理功能，如参与物质转运、参与炎症反应、调节凝血与纤溶、抑制肿瘤细胞扩散、参与间皮损伤修复等，同时也与多种病理过程有关，如浆膜炎(胸膜炎、腹膜炎、心包炎)、粘连、肿瘤的发生发展等^[4-6]。

浆膜炎是动物传染病的一类常见临床表现，包括胸膜炎、腹膜炎、心包炎，引起动物浆膜炎常见的病原包括副猪革拉瑟菌(Glaesserella parasuis，GPS)^[7]、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis，Mhr)^[8-9]、鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer)^[10]等，给我国养殖业造成严重经济损失。其中Mhr在世界范围内广泛感染，可引起多发性浆膜炎、关节炎，给养猪业带来重大经济损失^[11-12]。细胞模型是病原学研究的重要基础，本研究以猪腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell，PMC)为对象，建立猪原代间皮细胞分离培养方法，并以Mhr作为引起浆膜炎病原的代表将PMC细胞初步用于体外感染试验，以期为引起猪浆膜炎相关病原的感染致病机制研究提供细胞模型。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 试验动物 　　1~3月龄健康二元杂交猪(长白-大白)。

1.1.2 猪鼻支原体 　　Mhr 495c强毒株由江苏省农业科学院兽医研究所分离并保存。

1.1.3 主要试剂 　　DMEM/F12培养基、0.25%EDTA-胰酶、特级胎牛血清、鼠单抗白细胞CD45单克隆抗体、兔抗第Ⅷ因子单克隆抗体购自赛默飞科技有限公司。青霉素、链霉素、DAPI、LDH试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。红细胞裂解液和胶原酶购自北京索莱宝科技有限公司。鼠抗波形蛋白单克隆抗体、兔抗角蛋白18多克隆抗体、FITC-羊抗兔IgG二抗、Cy3-羊抗鼠IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。明胶、DMSO购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。KM2培养基由江苏省农业科学院兽医研究所自制。

1.2 方法

1.2.1 猪原代腹膜间皮细胞的分离与培养 　　无菌采集猪腹腔大网膜组织，放入装有含双抗(青霉素100 U·mL^-1、链霉素100 μg·mL^-1)的无菌D-Hanks溶液的离心管中，低温条件下运送至实验室。将大网膜组织置于培养皿内，用预冷的D-Hanks溶液洗涤6~8遍。尽量剔除血管和脂肪，将剩余大网膜组织剪成1 cm²大小，加入预热的0.1% Ⅰ型胶原酶消化液，混匀后置于37 ℃摇床180 r·min^-1消化约8 min，期间手动剧烈震荡一次，而后加入3倍~4倍体积的D-Hanks溶液终止消化。用力震荡，使细胞从消化的组织中充分释放出来，弃去消化后的组织，过150目筛网，收集液体于50 mL尖底离心管，300 g离心10 min，弃上清。如红细胞较多，加入红细胞裂解液室温处理5 min裂解红细胞，再用D-Hanks洗涤细胞2次，最终用含15%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和双抗的DMEM/F12培养基重悬。将细胞按1×10⁶~2×10⁶·mL^-1浓度铺入25 cm²细胞培养瓶内，置于含5% CO₂培养箱37 ℃培养，差速贴壁2次，即贴壁1 h后换新的细胞瓶，再次贴壁1 h，收集上清于15 mL尖底离心管，离心收集细胞，用完全培养基重悬，按3 × 10⁵·mL^-1浓度铺入0.1%明胶包被的25 cm²细胞培养瓶，置于含5% CO₂培养箱37 ℃培养。

1.2.2 明胶包被方法 　　使用无菌PBS配制1%明胶溶液，试验前用PBS稀释至0.1%后过0.22 μm滤器除菌，取3 mL加入25 cm²细胞培养瓶中完全覆盖瓶底或取500 μL明胶加入24孔板中使其完全覆盖孔底，4 ℃过夜，次日倒去多余液体并晾干1~2 h即可使用。

1.2.3 细胞传代培养 　　当原代细胞的融合度达85%~90%时，需对PMC细胞进行传代处理。使用无菌PBS润洗细胞后，向瓶内加入适量0.25%胰酶-EDTA消化液，使其完全覆盖瓶底，置于37 ℃培养箱内消化2~4 min，消化过程中注意观察细胞形态变化，当细胞变圆并与瓶底脱离后，加入与胰酶等量的完全培养基终止消化过程。收集瓶内液体于尖底离心管，300 g离心10 min，用完全培养基重悬细胞沉淀，按1 × 10⁵·mL^-1浓度转移至2~3个细胞瓶内培养。

1.2.4 腹膜间皮细胞的鉴定

1.2.4.1 光学显微镜鉴定　　取原代培养的PMC细胞置于光镜下观察细胞形态。

1.2.4.2 扫描电镜鉴定　　玻片经灭菌处理后用明胶包被，将细胞按1 × 10⁵·mL^-1浓度接种于放置有玻片的6孔板中，待细胞生长至90%融合时，用PBS洗涤细胞3遍，加入2.5%戊二醛电镜固定液4 ℃过夜固定细胞，PBS洗涤后，用1%锇酸溶液固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥法干燥，离子溅射，真空喷镀金后进行扫描电镜(EVO-LS10)观察。

1.2.4.3 间接免疫荧光鉴定　　将细胞按1×10⁵·mL^-1浓度接种于明胶包被的24孔板中，待细胞生长至90%融合时，用PBS洗涤细胞3遍，加入1.25%戊二醛室温固定10 min，洗涤后用0.2% Triton X-100透化处理5 min，洗涤后加入5%牛血清白蛋白于37 ℃封闭1 h，再加入一抗溶液(波形蛋白、角蛋白18、第Ⅷ因子、CD45抗体)，4 ℃孵育过夜，次日洗涤后加入相应的FITC-羊抗兔IgG二抗和Cy3-羊抗鼠IgG二抗，于37 ℃室温孵育1 h，洗涤后加入DAPI室温染色10 min，洗涤后于荧光显微镜下观察。

1.2.5 细胞冻存与复苏 　　提前配制细胞冻存液，按50% DMEM/F12基础培养基、40% FBS、10% DMSO比例配制并混匀。弃去细胞瓶内原培养基，使用无菌PBS润洗两遍后，加入适量0.25%胰酶-EDTA消化液置于37 ℃消化，显微镜下观察待消化完全后，加入等量完全培养基终止消化，收集细胞悬液于尖底离心管，300 g离心10 min，弃上清。使用已配制好的冻存液重悬细胞沉淀并转移至冻存管，将冻存管置于冻存盒中，-80 ℃放置过夜，次日转移至液氮中保存。

细胞复苏时，取出液氮中的细胞冻存管，迅速置于37 ℃水浴摇晃直至液体融化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，补加5 mL常温完全培养基，混匀后，300 g离心10 min，弃上清，用完全培养基重悬至5 mL，转移至25 cm²细胞瓶内，置于含5% CO₂培养箱37 ℃培养。

1.2.6 Mhr的培养 　　取Mhr菌种按1 ∶9的比例接种于KM2液体培养基中，置于37 ℃细菌培养箱培养，待菌液由红色变为黄色时，收集菌液或继续按1 ∶9比例扩大培养，最终收获的Mhr菌液分装冻存于-80 ℃，测定滴度，用颜色变化单位(color change unit，CCU)表示，分装保存备用。

1.2.7 Mhr感染细胞 　　将细胞按1×10⁵·mL^-1浓度接种于96孔板中，培养至85%~90%融合后进行感染，设置未感染孔为对照组。取冻存的Mhr菌液，12 000 g离心20 min，弃去上清，用含1% FBS的DMEM/F12培养基重悬菌体，调整浓度至10⁸ CCU·mL^-1，按100 μL·孔^-1接种于感染组细胞孔中。感染24 h后取出细胞培养板观察或进行下一步试验。感染及对照组均设置3个重复孔。

1.2.8 Mhr感染后细胞活力检测 　　Mhr感染24 h后，取出96孔板，吸取细胞上清后分装至离心管，并做好标记，400 g离心5 min。分别取各孔的上清液70 μL，加入到新的96孔板相应孔中。将乳酸溶液、10 × INT溶液、INT稀释液、酶溶液恢复至室温。按说明书避光配制LDH检测工作液，各孔分别加入35 μL的检测工作液并混匀，室温避光孵育30 min，然后于490 nm处测定吸光度。

1.2.9 统计学分析 　　数据用“平均值±标准差(x±s)”表示。利用GraphPad Prism 9软件，对数据进行Student’s t-test统计学分析。^*. P < 0.05表示差异显著，**. P < 0.01表示差异极显著。

2 结果 2.1 细胞分离培养及形态学观察

取健康猪大网膜组织，采用0.1% Ⅰ型胶原酶消化分离猪原代PMC细胞。消化分离的原代细胞贴壁72 h后，使用倒置相差显微镜观察细胞形态，早期细胞密度低，细胞多伸展，呈拉网状生长(图 1A)；培养4~8 d后，细胞逐渐融合，融合后细胞呈多边形，大小较为一致，边缘不齐，似铺路石状(图 1B)。

2.2 超微结构

利用扫描电镜对F2代细胞进行超微结构观察，结果如下图所示，电镜下细胞较为铺展，呈椭圆形或多角形，有核处细胞隆起较厚，细胞表面可见大量微绒毛(图 2)。

2.3 免疫荧光鉴定

对分离的F2代细胞进行特征性抗原的免疫荧光鉴定，结果显示，细胞角蛋白18抗原(图 3A)和波形蛋白抗原(图 3B)均呈阳性，符合PMC细胞特征；而第Ⅷ因子相关抗原和CD45抗原呈阴性，由此排除了成纤维细胞、血管内皮细胞和白细胞。PMC细胞纯度可达95%。

2.4 传代培养

细胞传代培养2~3代时细胞贴壁率、生长速度和形态与初始原代细胞无明显差异，4~5代开始细胞贴壁率降低、生长增殖变缓，部分细胞膨大、变形，出现衰老现象。体外培养一般可维持到4~6代(图 4)。

2.5 细胞的冻存与复苏

细胞经冻存复苏后，细胞形态仍为典型的鹅卵石形，间皮细胞的纯度在90%以上。经冻存复苏后第6~7天生长至融合(图 5)。

2.6 Mhr感染诱导猪腹膜间皮细胞损伤

Mhr感染PMC细胞24 h后，光镜下可观察到感染组细胞发生明显皱缩(图 6)。通过LDH试剂盒检测细胞LDH释放量，结果如图 7所示，感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高(P < 0.01)。结果提示Mhr感染对PMC细胞有明显损伤作用。

3 讨论

间皮细胞是研究浆膜炎的主要靶细胞。大网膜是腹膜的最大褶皱，具有高密度的间皮细胞，每平方厘米的网膜组织中可提供一百万个左右的间皮细胞，能够获取相对较多的细胞，因此常用大网膜分离间皮细胞^[13]。目前报道的人、大鼠、小鼠等动物的腹腔大网膜间皮细胞分离多用胰蛋白酶进行消化^[14-16]。但在猪大网膜间皮细胞分离中，笔者发现胰酶消化法效果不稳定，时间难以控制，容易受到动物日龄和脂肪含量的影响，消化时间过短获得的细胞少，时间过长则易损伤细胞，或者增加成纤维细胞污染的概率，笔者改用Ⅰ型胶原酶消化，获得细胞得率和纯度更佳。

本研究结果显示，从大网膜消化的原代细胞在培养初期呈拉网状生长，不易与成纤维细胞区别，融合后才形成特殊的铺路石样外观，此时可与成纤维细胞明显区分开来，与人、大鼠等动物腹腔间皮细胞分离时的形态变化过程类似^[17-18]。进一步对所分离细胞进行免疫荧光鉴定和扫描电镜鉴定，波形蛋白和角蛋白-18特征性抗原表达为阳性，细胞表面具有微绒毛，证实了笔者分离的细胞为猪原代PMC细胞。由此，本研究成功建立了猪大网膜PMC细胞的体外培养方法。

为提高培养成功率，在试验过程中需要注意以下问题：1)选用的试验猪日龄以3月内为宜。日龄过大的猪腹腔脂肪过多，大网膜是腹腔脂肪堆积的主要部位，过多的脂肪影响间皮细胞的消化，分离不易成功。2)处理组织时尽量摘除血管和脂肪组织，并多次清洗去除多余油脂，组织剪碎至1 cm²左右，组织过大与消化液接触面积不足，不利于充分消化，剪得过碎消化获得的细胞中成纤维细胞比例上升。3)根据最终获得的大网膜组织量，加入适量胶原酶消化，消化液体积以不低于组织体积的3倍为宜。消化液应提前预热，加入后充分分散组织，置于摇床中震荡消化。严格掌握消化时间，消化结束后及时终止，并充分振摇使细胞从组织碎片中释放出来。4)消化获得的细胞通过差速贴壁法去除成纤维细胞，贴壁时间以2 h左右为宜。5)合适的接种密度有利于细胞快速生长并提高细胞纯度。如果接种密度过低，细胞不但铺展速度慢，生长形态差，而且在间皮细胞的间隙处易出现成纤维细胞生长。根据笔者经验，猪原代PMC细胞一般接种密度以2×10⁵~5 × 10⁵·mL^-1为宜；6)F1代培养时避免换液过早。3 d内不宜挪动细胞，首次换液最好在第3~4天后进行。换液时动作轻柔，贴壁良好时可采用全换液，贴壁不佳时采用半换液。7)用明胶包被细胞瓶更有利于PMC细胞贴壁。8)试验使用细胞以1~3代为佳，4代以后细胞增殖活力下降，部分细胞形态出现老化现象，可能影响试验结果的准确性。

Mhr是临床上引起猪多发性浆膜炎的主要病原之一。本研究尝试将所分离的PMC细胞用于Mhr感染，结果发现Mhr感染后可造成PMC细胞形态发生明显的皱缩，细胞活性受损，提示PMC细胞对Mhr感染较为敏感，可成为后续Mhr诱导浆膜炎致病机制研究和疫苗、药物研究的良好细胞模型。

4 结论

本研究采集猪大网膜组织，利用胶原酶消化法分离获得原代细胞，通过形态学和免疫学鉴定为猪PMC细胞，建立了简便、快捷的猪原代PMC细胞分离和体外培养方法。使用Mhr感染PMC细胞可观察到明显的细胞形态变化和LDH释放量的显著增加。