畜牧兽医学报  2024, Vol. 55 Issue (3): 1115-1126. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.03.024    PDF    
引用本文
董欣怡, 李锦群, 陈钦玺, 廖明, 曹伟胜. J亚群禽白血病病毒血液核酸筛查技术的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(3): 1115-1126.  
DONG Xinyi, LI Jinqun, CHEN Qinxi, LIAO Ming, CAO Weisheng. Establishment of Blood Nucleic Acid Screening Technology for Subgroup J Avian Leukosis Virus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2024, 55(3): 1115-1126.  
J亚群禽白血病病毒血液核酸筛查技术的建立
董欣怡, 李锦群, 陈钦玺, 廖明, 曹伟胜     
华南农业大学兽医学院, 人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室, 农业部兽用疫苗创制重点实验室, 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室, 广州 510642
收稿日期：2023-05-25
基金项目：广东省重点领域研发计划项目（2020B020222001）；广东省家禽产业技术体系（2023KJ128）；国家肉鸡产业技术体系（CARS-41-G10）
作者简介：董欣怡(1998-), 女, 山东烟台人, 硕士, 主要从事动物传染病学研究, E-mail: dongxinyi0102@163.com.
通信作者：曹伟胜, 主要从事家禽重要传染病防控和净化研究, E-mail: caoweish@scau.edu.cn.
摘要：为缩短J亚群禽白血病病毒（subgroup J avian leukosis virus，ALV-J）检测周期，进一步加快禽白血病净化进程，本研究结合SYBR Green Ⅰ qPCR和混样检测，建立了一种适用于低ALV-J流行率场景下的快速筛检ALV-J的血液核酸筛查技术（ALV-J blood quantitative polymerase chain reaction，ALV-J-B-qPCR）。根据GenBank中ALV-J pol及env基因序列，设计ALV-J的特异性引物，并优化反应条件，建立了ALV-J SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法。以ALV-J病毒分离为阳性的鸡抗凝血为实验材料，分别制备抗凝血DNA、血细胞DNA、外周血淋巴细胞DNA、外周血淋巴细胞cDNA和血浆cDNA 5类血液检测模板进行ALV-J的PCR检测，筛选最佳检测模板；进一步比较蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法，血液混样总体积为200 μL的混样方法，血液混样总体积为10 μL的混样方法共3种混样方法的检测准确性，筛选最佳混样方法。综合上述qPCR方法、检测模板与混样方法，成功建立了ALV-J-B-qPCR。运用ALV-J-B-qPCR分别进行预期流行率为1%~2%、4%~5%场景下的模拟筛查试验，并与病毒分离法比较。qPCR方法的特异性、灵敏性和重复性试验显示，该方法仅特异性扩增ALV-J，对标准质粒的最低检测限度为1×102 copies·μL-1，批内与批间变异系数均 < 1%。对90份临床送检血液样品的检测结果显示，该qPCR方法对ALV-J的检出率（15.6%）高于p27抗原ELISA和普通PCR的检出率（12.2%）。检测模板筛选试验中，抗凝血DNA最符合检测准确度高、操作复杂度和成本低的要求，为最佳检测模板。混样方法摸索试验中，混样总体积为10 μL（混样规模 < 12份）的混样方法检测准确性最高，为最佳混样方法。在样本数为400份，预期流行率为4%~5%场景的模拟筛查中，ALV-J-B-qPCR检出率为6.25%，比病毒分离法高2.00%；在样本数为400份，预期流行率为1%~2%场景的模拟筛查中，ALV-J-B-qPCR检出率为2.25%，比病毒分离法高0.75%。本研究建立的ALV-J-B-qPCR技术具有灵敏性高、检测快速和节约成本的优势，为种禽场加快ALV净化进程提供了新的思路和方法。
关键词：J亚群禽白血病病毒    实时荧光定量PCR    混样检测    筛查技术    
Establishment of Blood Nucleic Acid Screening Technology for Subgroup J Avian Leukosis Virus
DONG Xinyi, LI Jinqun, CHEN Qinxi, LIAO Ming, CAO Weisheng     
National and Local Joint Engineering Laboratory for Zoonoses Prevention and Control Agents; Key Laboratory of Veterinary Vaccine Creation, Ministry of Agriculture; Key Laboratory of Prevention and Control of Zoonotic Diseases of Guangdong Province, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Corresponding author: CAO Weisheng, E-mail: caoweish@scau.edu.cn.
Abstract: To shorten the detection cycle of subgroup J avian leukosis virus (ALV-J) and further accelerate the process of avian leukosis decontamination, this study combined SYBR Green Ⅰ qPCR and pooling sample assay to establish a blood nucleic acid screening technique (ALV-J-B-qPCR) for rapid screening of ALV-J in low prevalence. Based on the sequences of ALV-J pol and env genes in GenBank, the specific primers for ALV-J were designed and the reaction conditions were optimized to establish the ALV-J SYBR Green Ⅰ qPCR assay. Anticoagulant DNA, blood cell DNA, peripheral blood lymphocyte DNA, peripheral blood lymphocyte cDNA and plasma cDNA were respectively prepared to perform PCR detection of ALV-J, and the best assay templates were screened. Further, the accuracy of the three mixing methods of extracting DNA from mixed blood by red blood cell cracking method, the mixed method with 200 μL total volume of blood mixed sample and the mixed method with 10 μL total volume of blood mixed sample were compared, and the best mixing method was selected. The ALV-J-B-qPCR was established by combining the above qPCR method, assay template and mixing method. Simulated screening tests with expected prevalence scenarios of 1%-2% and 4%-5% were performed using ALV-J-B-qPCR respectively, and compared with the virus isolation method. Specificity, sensitivity and reproducibility tests of the qPCR method showed that the method specifically amplifies only ALV-J and has a minimum detection limit of 1×102 copies·μL-1 for standard plasmids, with intra-and inter-batch coefficients of variation < 1%. Results on 90 clinical samples showed that the detection rate of ALV-J by this qPCR method (15.6%) was higher than that of p27 antigen ELISA and PCR (12.2%). In the assay template screening test, anticoagulated blood DNA best met the requirements of high assay accuracy, operational complexity and low cost, and was the best assay template. In the mixing method screening test, the mixing method with a total mixing volume of 10 μL (mixing size < 12) had the highest detection accuracy and was the best mixing method. In a simulated screening with a sample size of 400 and an expected prevalence of 4%-5%, the detection rate of ALV-J-B-qPCR was 6.25%, which was 2.00% higher than that of the virus isolation method; in a simulated screening with a sample size of 400 and an expected prevalence of 1%-2%, the detection rate of ALV-J-B-qPCR was 2.25%, which was 0.75% higher than that of the virus isolation method. The ALV-J-B-qPCR technique established in this study has the advantages of high sensitivity, rapid detection and cost saving, which provides a new idea and method to accelerate the ALV purification process in breeding poultry farms.
Key words: ALV-J    qPCR    pooling sample assay    screening technique    

禽白血病(avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的一类禽肿瘤性疾病。目前ALV可分为A~K共11个亚群，其中，ALV-J流行最广，可引起鸡的髓细胞瘤、血管瘤、纤维肉瘤等，对养禽业危害巨大[1-6]。目前，尚无针对AL的疫苗或药物，对种鸡群进行净化是防控AL的主要措施[7-9]。

目前，病毒分离法是净化检测外源性ALV的金标准，该方法主要通过将采集的血浆等临床样品接种细胞，培养7~9 d后用ALV p27抗原ELISA试剂盒进行检测，该方法检测周期长且成本高[10-11]。此外，当种鸡场ALV流行率低时，利用病毒分离法对鸡逐一进行检测，会造成耗材和人工的极大浪费。核酸检测法具有检测周期短、特异性强、灵敏度高的优点[12]。其中，实时荧光定量PCR方法(quantitative real-time PCR)发展成熟，自动化程度高，已被广泛用于各类病原检测工作中[13-14]。但在检测大批量样本时，也存在成本偏高的缺点。

混合样本检测(pooling sample assay)简称混样检测，是将适量样本混合后检测的模式，合理应用可提高检测效率，节约成本[15-17]。在防控新型冠状病毒(SARS-CoV-2019)的过程中，10混1、20混1等样本混合检测策略显著提高了检测效率[18-21]；对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)等血液传染病的混样核酸筛查能提高用血安全，降低单独使用ELISA检测的漏检风险[22-25]。常用的混样检测主要分为2轮。第1轮对混合样本组进行检测，第2轮对阳性混合样本组中的样本进行逐一检测。假设流行率为p，混样规模为k，理论上每个样本的检测次数${E_{(X)}} = \frac{1}{k} \times {(1 - p)^k} + \left[{1- {{(1- p)}^k}} \right] \times \left({1 + \frac{1}{k}} \right) = 1 + \frac{1}{k} - (1 - p)$[26]。E(X)数值越低，代表检测总量越低，成本越低，令E(X)数值最低的混样规模为理论最佳混样规模。由此可知，流行率p越小，最佳混样规模k越大，检测数量减少比例越大。因此，混样检测更适合低流行率的应用场景[27]。

本研究结合核酸检测技术和混样检测模式，建立了一套适用于ALV-J低流行率场景下的快速筛检ALV-J感染鸡的血液核酸筛查技术(ALV-J-B-qPCR)，旨在加快种禽场外源性ALV的净化进程。

1 材料与方法 1.1 主要实验材料

DF-1细胞、ALV-A GD13-1株、ALV-B CD08株、ALV-J SCAU-HN06株、ALV-K GDFX0601株、ALV-E HN1301株、马立克病病毒(MDV)Md5株、禽流感病毒(AIV)G1-like株cDNA、禽网状内皮增生症病毒(REV)SNV株cDNA均由本实验室保存；鸡抗凝血样采集自广东省3个正在进行AL净化的种鸡场；ALV p27抗原ELISA检测试剂盒是哈尔滨国生生物科技股份有限公司产品；通用柱式基因组DNA提取试剂盒购自广州攻逸生物科技有限公司；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 引物序列

根据GenBank中ALV-J pol及env基因序列，设计1对特异性检测ALV-J的qPCR引物F1/R1，同时以引物H5/H7作为ALV-J的PCR检测引物[28](表 1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表 1 本研究使用的引物 Table 1 Primers used in this study
1.3 标准质粒的制备

以ALV-J SCAU-HN06株cDNA为模板，利用引物F1/R1对目的片段进行PCR扩增。反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 8 min。胶回收目的条带，连接至pMD-19T载体上，转化至DH5α感受态细胞，挑取单菌落，置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养后提取质粒。将测序正确的标准质粒命名为pMD19-T-J。

1.4 qPCR反应条件的优化及标准曲线的建立

采用20 μL的反应体系，分别对退火温度(54、54.7、56.0、58.0、60、60.4、62.3、63.5、64 ℃)、引物终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1)进行优化，得到最佳反应条件。再以拷贝数为7.15×102~ 7.15×109 copies·μL-1的10倍倍比稀释的标准质粒为模板进行qPCR反应，绘制标准曲线，计算其相关系数R2及其扩增效率E。

1.5 qPCR的特异性、灵敏性和重复性试验

以ALV-A、ALV-B、ALV-K、ALV-E、REV、AIV、MDV等病毒的基因组DNA或cDNA为模板，以标准质粒为阳性对照，去离子水为阴性对照，进行qPCR反应，以分析所建立方法的特异性；以拷贝数为1×1010~1×100 copies·μL-1的10倍倍比稀释的标准质粒为模板，分别进行qPCR和普通PCR检测，比较两种方法对标准质粒的最低检出限，以分析所建立方法的灵敏性；以1×104、1×105、1×106 copies·μL-1的标准质粒为模板，进行qPCR的批内重复性试验和批间重复性试验(批内重复：每个稀释度的标准质粒设置3个重复并同时扩增；批间重复：在不同时间段对以上试验进行3次独立的重复)，并统计Ct值的平均值、标准差和变异系数，以分析所建立方法的重复性。

1.6 临床样本检测

随机抽取90份鸡抗凝血，将离心的血浆接种DF-1细胞，维持培养9 d后收集细胞培养液，用p27抗原ELISA试剂盒进行ALV检测，对阳性样品的细胞沉淀用H5/H7引物进行ALV-J特异性检测；提取上述90份细胞沉淀RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，分别用建立的qPCR方法和普通PCR方法进行ALV-J检测；分析比较以上3种方法的检出率。

1.7 核酸筛查检测模板的筛选

以15份经病毒分离和亚群鉴定为ALV-J阳性的鸡血液样本和1份阴性鸡血液样本为材料(ALV阳性样本为经病毒分离后细胞培养上清ELISA S/P值高于0.2的样本，反之为阴性样本，下同)，分别制备这16份样本的抗凝血DNA、血细胞DNA、外周血淋巴细胞DNA、外周血淋巴细胞cDNA和血浆cDNA，进行ALV-J特异性PCR检测，并综合评估其检测准确度、操作复杂度和成本，选出最佳模板类型。

1.8 核酸筛查混样方法的探索

选取22份经病毒分离和亚群鉴定为ALV-J阳性的抗凝血样本，提取其抗凝血DNA为模板，进行qPCR检测，获得血液原液检测Ct值。同时，将上述抗凝血样本用于以下3种混样方法的探索试验。

1.8.1 蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法 　　鸡红细胞可在蒸馏水中破裂并释放DNA，因此可用该方法粗提鸡抗凝血DNA。以100 μL为ALV-J阳性抗凝血与蒸馏水混合的总体积，分别将占体积比为0.5%、1%、2%和4%的抗凝血与相应体积的蒸馏水混合后剧烈震荡，待红细胞碎屑沉降后吸取1 μL上清作为模板，进行qPCR检测。根据检测结果确定最佳的血液-蒸馏水体积比并设计后续试验。

1.8.2 血液混样总体积为200 μL的混样方法 　　以200 μL作为混合总体积，分别将22份ALV-J阳性抗凝血按1 ∶2、1 ∶5、1 ∶8和1 ∶11体积比与阴性抗凝血充分震荡混匀(即阳性血样的3倍稀释、6倍稀释、9倍稀释和12倍稀释)，再从中吸取10 μL混合血液，提取其DNA作为模板，进行qPCR检测，分析不同混合比例对检测准确度的影响。

1.8.3 血液混样总体积为10 μL的混样方法 　　以10 μL作为混合总体积，分别将22份ALV-J阳性抗凝血按1 ∶2、1 ∶5、1 ∶8和1 ∶11体积比与阴性抗凝血充分震荡混匀(即阳性血样的3倍稀释、6倍稀释、9倍稀释和12倍稀释)，提取其DNA作为模板，进行qPCR检测，分析不同混合比例对检测准确度的影响。

1.9 ALV-J血液核酸筛查技术的建立

根据上述qPCR方法，确定的最佳检测模板和最佳混样方法，组合建立了ALV-J血液核酸筛查技术，并命名为ALV-J-B-qPCR。

1.10 临床ALV-J血液核酸筛查模拟试验

选取17份ALV-J阳性血样和383份阴性血样进行随机排列，模拟流行率为4%~5%的临床检测场景，以k=5的混样规模分80个混合样本组，提取DNA进行第一轮qPCR检测，对检测为反应性的混合样本组进行第二轮单个样品的DNA提取和qPCR检测；同样，选取6份ALV-J阳性血样和394份阴性血样进行随机排列，以k=10的混样规模，进行预期流行率为1%~2%的临床血液核酸筛查模拟试验。

1.11 统计分析方法

运用Prism 9、SPSS 21.0软件对试验数据进行处理和分析。P>0.05表示差异不显著，P < 0.05表示差异显著。*.P < 0.05，**.P < 0.01，***.P < 0.001，ns.P>0.05。

2 结果 2.1 qPCR标准质粒的构建与鉴定

以ALV-J cDNA为模板，采用引物F1/R1进行PCR扩增，电泳结果显示条带大小约204 bp(图 1a)，与预期大小一致。将目的片段连接至pMD19-T并转化至DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落并提取重组质粒。测序结果显示，标准质粒pMD19-T-J构建成功。

a. 标准质粒PCR扩增(M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~2. 标准质粒；3. 阴性对照)；b. 标准曲线 a. Standard plasmid PCR amplification (M. DL2000 DNA marker; 1-2. Standard plasmid; 3. Negative control); b. Standard curve 图 1 标准质粒的鉴定和标准曲线的建立 Fig. 1 Identification of standard plasmid and establishment of standard curve
2.2 qPCR反应条件优化和标准曲线的建立

qPCR反应条件的优化结果显示，最佳退火温度为58 ℃，最佳引物终浓度为0.2 μmol·L-1。最终确定20 μL qPCR反应体系：上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，qPCR预混液10 μL，DNA模板1 μL，去离子水8.2 μL；反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s，39个循环。将拷贝数为7.15×109~7.15×102 copies·μL-1共8个浓度梯度的标准质粒进行qPCR扩增，并绘制标准曲线，结果显示，标准曲线方程为y = -3.329 8x + 41.071，R2 = 0.999 5，扩增效率E=100%(图 1b)。

2.3 qPCR的灵敏性、特异性、重复性

结果显示，所建立的qPCR方法对标准质粒的最低检测限为1×102 copies·μL-1，而普通PCR的最低检测限为1×103 copies·μL-1(图 2)，表明所建立的qPCR方法的灵敏性高于普通PCR，为普通PCR的10倍；分别以ALV-A、ALV-B、ALV-K、ALV-E、REV、AIV的cDNA和MDV的DNA作为检测模板，以ALV-J标准质粒为阳性对照，去离子水为阴性对照，进行qPCR扩增，结果显示，仅ALV-J标准质粒出现特异性扩增，表明该方法的特异性良好(图 3)；利用1×104、1×105和1×106 copies·μL-1 3个浓度的标准质粒分别进行批内和批间的qPCR重复性试验，结果显示，批内重复性试验的变异系数为0.122%~0.505%，批间重复性试验变异系数为0.279%~0.745%，两组变异系数均小于1%，表明建立的qPCR方法具有良好的重复性(表 2)。

a. ALV-J荧光定量PCR扩增曲线(1~10. 1010~101拷贝数的标准质粒)；b. ALV-J普通PCR扩增结果(M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~10. 1010~101拷贝数的标准质粒；12. 阴性对照；14. 阳性对照) a. ALV-J fluorescence quantitative PCR amplification curve(1-10. 1.0×1010 -1.0×101 copies·μL-1 of plasmid standard); b. ALV-J PCR amplification result(M. DL2000 DNA marker; 1-10. 1.0×1010-1.0×101 copies·μL-1 of plasmid standard; 12. Negative control; 14. Positive control) 图 2 qPCR与PCR灵敏性对比试验 Fig. 2 Sensitivity test results of qPCR and PCR
图 3 qPCR特异性试验结果 Fig. 3 Specificity test result of the qPCR
表 2 qPCR重复性试验结果 Table 2 Repeatability test results of qPCR
2.4 临床样品检测

随机抽取90份鸡抗凝血, 分离血浆并接种至DF-1细胞，培养9 d后通过ALV p27抗原ELISA共检出11份阳性，阳性DF-1细胞培养物经PCR鉴定表明均存在ALV-J感染，表明p27 ELISA方法的ALV-J检出率为12.2%(11/90)；以上述90份DF-1细胞cDNA为模板，分别利用普通PCR和所建立的qPCR进行ALV-J检测，结果显示，普通PCR ALV-J检出率为12.2%(11/90)，qPCR的ALV-J检出率为15.6%(14/90)，且所有被p27 ELISA和普通PCR检出的样本，均可被qPCR方法检出，表明所建立的qPCR方法比PCR方法和p27 ELISA方法灵敏性高。

2.5 核酸筛查模板筛选

结果显示，5种检测模板中，外周血淋巴细胞cDNA的ALV-J阳性检出率为46.67%(7/15)，血浆cDNA的ALV-J阳性检出率为13.33%(2/15)，抗凝血DNA、血细胞DNA和外周血淋巴细胞DNA 3种模板的ALV-J阳性检出率为100%(15/15)，其中，外周血淋巴细胞DNA需要从抗凝血中分离淋巴细胞，需额外购买试剂盒，成本高且操作复杂，而血细胞DNA的制备需要先离心抗凝血，比直接采用抗凝血操作复杂，因此选定检测准确度高、成本低、操作复杂度低要求的抗凝血DNA作为后续试验的检测模板。

2.6 核酸筛查混样方法的探索

2.6.1 蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法 　　以22份ALV-J阳性的抗凝血为材料，分别将占体积比为0.5%、1%、2%和4%的抗凝血与相应体积的蒸馏水混合并剧烈震荡后吸取上清DNA进行qPCR检测，结果显示，血液占比为0.5%、1%、2%和4%的4个组的平均Ct值均介于31~32，且组间差异均不显著(P>0.05)(图 4)，显著低于DNA试剂盒提取的原血样组DNA的平均Ct值26.44，灵敏性差。

图中未做显著性标记表示各组数据间的差异性均不显著 No significant marks were made in the figure, indicating that the differences between the groups of data were not significant 图 4 不同血液-蒸馏水体积比混合组的核酸检测结果 Fig. 4 Nucleic acid test results of different blood-distilled water volume ratio mixed group

2.6.2 血液混样总体积为200 μL的混样方法 　　以200 μL作为混合总体积，分别将22份ALV-J阳性抗凝血与阴性抗凝血3、6、9和12倍稀释后吸取10 μL，提取其DNA作为模板进行qPCR检测，结果显示，3、6、9和12倍稀释组的平均Ct值分别为27.96、29.18、29.27和28.74，相比原血样组的核酸检测平均Ct值26.44分别增加了1.52、2.74和2.83、2.30，且单个样本检测结果均呈反应性。其中，3倍稀释组与原血样组的平均Ct值无显著差异(P>0.05)，6、9和12倍稀释组与原血样组的Ct值差异均显著(P < 0.05)。值得注意的是，3、6、9和12倍稀释组的平均Ct值随着稀释倍数的增加先上升后下降，12倍稀释组的平均Ct值低于6和9倍稀释组(图 5a)。

a. 总体积为200 μL的混样方法；b. 总体积为10 μL的混样方法。**.P < 0.01，***.P < 0.001，ns.P>0.05 a. Scheme with a mixed samples volume of 200 μL; b. Scheme with a mixed samples volume of 10 μL. **.P < 0.01, ***.P < 0.001, ns.P>0.05 图 5 不同阳性血样稀释倍数对核酸检测结果的影响 Fig. 5 Effect of different dilution ratio of positive blood samples on nucleic acid test results

2.6.3 血液混样总体积为10 μL的混样方法 　　以10 μL作为混合总体积，分别将22份ALV-J阳性抗凝血与阴性抗凝血3、6、9和12倍稀释后提取其总DNA进行qPCR检测，结果显示，3、6、9和12倍组的平均Ct值分别为27.98、29.13、29.71、29.85，相比原血样组的核酸检测平均Ct值26.44分别增加了1.54、2.69、2.73、3.41，但有1份血样在12倍稀释组中未出现反应性。其中，3倍稀释组与原血样组的平均Ct值无显著差异(P>0.05)，6、9和12倍稀释组与原血样组的Ct值差异均显著(P < 0.05)(图 5b)。相对混样总体积为200 μL的混样方法，混样总体积为10 μL的方法中3、6、9和12倍稀释组的平均Ct值随着稀释倍数的增加逐渐升高，其结果更合理准确，因此采纳混样总体积为10 μL(混样规模 < 12)的混样方法。

2.7 临床ALV-J血液核酸筛查模拟试验

选取17份ALV-J阳性抗凝血和383份阴性抗凝血随机排列，以模拟流行率为4%~5%的临床检测场景，以k=5的混样规模分为80个混合样本组，提取其抗凝血DNA进行第一轮qPCR检测，结果显示，共有20个混合样本组呈反应性。进一步提取这20个混合样本组对应的100份抗凝血DNA进行第二轮qPCR检测，共检出25份反应性样本。ALV-J-B-qPCR总检出率为6.25%，比病毒分离法高2%。两轮qPCR共检测样本180份，仅占样品总数的45%。同样，选取6份ALV-J阳性抗凝血和394份阴性抗凝血进行随机排列，以模拟流行率为1%~2%的临床检测场景，以k=10的混样规模分为40个混合样本组，结果显示，第一轮qPCR检测共有8组混合样本组呈反应性，第二轮qPCR检测共检出9份反应性样本，ALV-J-B-qPCR总检出率为2.25%，比病毒分离法高0.75%。两轮qPCR共检测样本120份，仅占样品总数的30%。

对2种预期流行率下ALV-J-B-qPCR和病毒分离法的检测结果进行卡方检验和Kappa一致性检验，结果显示，在1%~2%、4%~5%预期流行率下，卡方检验结果的χ2值分别为0.611、1.608，并且P值均大于0.05，说明2种方法差异无统计学意义；Kappa一致性检验结果的Kappa值分别为0.796、0.799，并且P值均小于0.05，说明2种方法具有显著的一致性，且结果有统计学意义(表 3、4)。

表 3 1%~2%预期流行率下的ALV-J-B-qPCR法与病毒分离法的检测结果 Table 3 Results of ALV-J-B-qPCR and Viral isolation at 1%-2% expected prevalence
表 4 4%~5%预期流行率下的ALV-J-B-qPCR法与病毒分离法的检测结果 Table 4 Results of ALV-J-B-qPCR and Viral isolation at 4%-5% expected prevalence

以上结果表明，ALV-J-B-qPCR具有良好的可行性。

3 讨论

目前的混样核酸检测策略，都会不可避免地稀释病毒核酸，当病毒核酸低于检测限时，就会发生漏检。因此，应合理设置混样规模，尽量减少假阴性风险。此外，还要合理选择混样类型和灵敏的检测方法，以保证检测结果的准确性[29-30]。新型冠状病毒流行期间，检测工作中通过多样本混检，可大大提高特定区域内大规模人群筛查和控制COVID-19疫情的能力[31]。孙微超等[32]评价了6混样和48混样在血液筛查工作中的适用性，发现两种混样方法的检测结果具备良好的一致性，48混样可大幅提高检测效率，但漏检风险略高。

随着国家对家禽种业重视程度的提高，我国许多规模化种禽场纷纷加大对外源性ALV的净化力度，其外源性ALV流行率已降至较低水平，此时使用病毒分离法逐个检测和淘汰阳性鸡，检测样本量大而淘汰病鸡数量少，且同时具有检测周期长的不足[33]。此外，病毒分离法所需的ELISA检测试剂盒价格昂贵，会增加净化成本。以qPCR为代表的核酸检测方法能大幅度缩短检测周期，其高灵敏性也能保障检测的准确性。同时，净化后期的鸡群ALV流行率低，符合混样检测的应用场景，可大幅减少检测数量，达到节约成本的目的。因此，本研究首次尝试建立针对ALV-J的血液核酸筛查方法。

本研究首先建立了ALV-J SYBR Green Ⅰ荧光定量检测方法。结果表明，该方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性，可作为后续试验的基础。

适宜的检测模板对检测结果的准确性具有重要影响[34]。在检测模板的选择中，本研究对5种检测模板进行评估，发现抗凝血DNA最符合准确度高，操作复杂度低、成本低的要求，因此以鸡抗凝血DNA为最终的检测模板。

在混样方法的探索中，蒸馏水破裂鸡红细胞法提取的DNA模板用于核酸检测的灵敏性差，因此不予采用。在混样总体积为200 μL的混样方法中，出现了阳性样本稀释倍数增加但平均Ct值反而降低的情况，分析原因，可能是由于抗凝血质地不均一，多个血样难以完全混匀，或混合血液产生凝集反应，造成血液性质改变[35]，导致用于提取核酸的10 μL混合血样不能代表组内的平均水平。相比之下，混样总体积为10 μL的混样方法中，随稀释倍数的增加，核酸检测的平均Ct也逐渐增加，更合理准确，因此采用混合总体积为10 μL的混样方法，但该方法在12倍稀释组中有1例ALV-J样本未检出反应性，因此实际应用中应尽量将混样规模控制在12以下。

本研究建立的ALV-J血液核酸筛查技术(ALV-J-B-qPCR)检测流程可参考如下：根据公式$E_{(X)}=1+\frac{1}{k}-(1-p)^k$(k为混样规模，p为流行率)，根据前期净化数据预估待检鸡场ALV-J的流行率p，选择令E(X)值小、且不大于12的混样规模k；根据混样规模k分组抗凝血样，同组的每个血样各吸取$\frac{10}{k}$ μL置于同一混合管内，并做好标注；使用DNA提取试剂盒提取混合血液的DNA，进行第一轮qPCR检测；对检测结果呈反应性的混合管对应的单个血样提取DNA并进行第二轮qPCR检测，统计并分析最终的检测结果(图 6)。

图 6 ALV-J-B-qPCR检测流程示意图 Fig. 6 Schematic diagram of ALV-J-B-qPCR detection process

在2种预期流行率的临床筛查模拟试验中，ALV-J-B-qPCR的检出率均比病毒分离法高，且被病毒分离法检出的样本均可被ALV-J-B-qPCR检出，说明ALV-J-B-qPCR灵敏性更高。此外，预期流行率为1%~2%的模拟试验的总检测量较预期流行率为4%~5%的模拟试验更少，可印证本方法更适合流行率低的应用场景。Kappa检验可评估两种检测方法的一致性，卡方检验重在评估两种方法之间的差异性[36]。通过卡方检验和Kappa检验评估ALV-J-B-qPCR和病毒分离法的检测差异性和一致性，结果表明2种方法具有显著的一致性。

4 结论

本研究结合qPCR方法和混样检测模式，首次建立了ALV-J血液核酸筛查技术。该技术存在以下几点优势：无需病毒分离过程，可大幅缩短检测周期；避免使用价格昂贵的ELISA检测试剂盒，且能大幅降低检测总量，节约成本；灵敏性高，有利于在大规模鸡群中精准筛检出ALV-J感染鸡。该技术尤其适用于低ALV-J流行率场景下鸡群的快速筛检，为规模化种鸡场加快ALV净化进程提供了新的思路和方法。

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(编辑   白永平)